मानव नाक उपकला Organoids की संस्कृति और इमेजिंग
Summary
मानव नाक उपकला कोशिकाओं से एक इन विट्रो ऑर्गेनोइड मॉडल का वर्णन करने के लिए यहां एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया गया है। प्रोटोकॉल में मानक प्रयोगशाला उपकरणों की आवश्यकता वाले माप के लिए विकल्प हैं, जिसमें विशेष उपकरण और सॉफ्टवेयर के लिए अतिरिक्त संभावनाएं हैं।
Abstract
सिस्टिक फाइब्रोसिस (सीएफ) रोगियों के लिए व्यक्तिगत चिकित्सा को बेसलाइन सिस्टिक फाइब्रोसिस ट्रांसमेम्ब्रेन चालकता नियामक (सीएफटीआर) गतिविधि और छोटे अणु यौगिकों से बहाली को समझने के लिए इन विट्रो रोग मॉडल के साथ प्राप्त किया जा सकता है। हमारे समूह ने हाल ही में प्राथमिक मानव नाक उपकला कोशिकाओं (एचएनई) से सीधे व्युत्पन्न एक अच्छी तरह से विभेदित ऑर्गेनोइड मॉडल स्थापित करने पर ध्यान केंद्रित किया है। अनुभागित ऑर्गेनोइड्स, पूरे-माउंट इम्युनोफ्लोरोसेंट स्टेनिंग, और इमेजिंग (कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी, इम्यूनोफ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी और उज्ज्वल क्षेत्र का उपयोग करके) के हिस्टोलॉजी ऑर्गेनोइड्स को चिह्नित करने और कार्यात्मक assays की तैयारी में उपकला भेदभाव की पुष्टि करने के लिए आवश्यक हैं। इसके अलावा, एचएनई ऑर्गेनोइड्स अलग-अलग आकारों के लुमेन का उत्पादन करते हैं जो सीएफटीआर गतिविधि के साथ सहसंबंधित होते हैं, सीएफ और गैर-सीएफ ऑर्गेनोइड्स के बीच अंतर करते हैं। इस पांडुलिपि में, एचएनई ऑर्गेनोइड्स को संवर्धित करने के लिए पद्धति का विस्तार से वर्णन किया गया है, जिसमें इमेजिंग तौर-तरीकों का उपयोग करके भेदभाव के आकलन पर ध्यान केंद्रित किया गया है, जिसमें बेसलाइन लुमेन क्षेत्र का माप शामिल है (ऑर्गेनोइड्स में सीएफटीआर गतिविधि माप की एक विधि जो माइक्रोस्कोप के साथ किसी भी प्रयोगशाला को नियोजित कर सकती है) के साथ-साथ एक कार्यात्मक परख के लिए विकसित स्वचालित दृष्टिकोण (जिसके लिए अधिक विशिष्ट उपकरणों की आवश्यकता होती है)।
Introduction
तकनीक का परिचय
पूर्व विवो संस्कृति आधारित assays सटीक दवा और रोग pathophysiology के अध्ययन के लिए एक तेजी से इस्तेमाल उपकरण हैं। प्राथमिक मानव नाक उपकला (एचएनई) सेल संस्कृति का उपयोग सिस्टिक फाइब्रोसिस 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13 के कई अध्ययनों में किया गया है , एक ऑटोसोमल रिसेसिव रोग जो कई अंगों में उपकला कोशिका समारोह को प्रभावित करता है। एचएनई संस्कृति वायुमार्ग एपिथेलिया का एक नवीकरणीय स्रोत प्रदान करती है जिसे संभावित रूप से प्राप्त किया जा सकता है और सिस्टिक फाइब्रोसिस ट्रांसमेम्ब्रेन चालकता नियामक (सीएफटीआर) गतिविधि का परीक्षण करने के लिए इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल और जैव रासायनिक गुणों को पुन: प्राप्त किया जा सकता है। एचएनई कोशिकाओं को न्यूनतम साइडइफेक्ट्स 14 के साथ नमूना लिया जा सकता है, जो सामान्य वायरल श्वसन स्वैब के समान है। एचएनई ब्रश बायोप्सी से व्युत्पन्न सिस्टिक फाइब्रोसिस अध्ययन के लिए एक मॉडल का वर्णन करने वाले शोध कार्य को हाल ही में11,13 प्रकाशित किया गया है। जबकि प्राथमिक एचएनई 2,3 और आंतों के ऊतक 15,16,17,18,19 का उपयोग करने वाले अन्य मॉडलों के समान, इस मॉडल के भेदभाव और इमेजिंग के विस्तृत लक्षण वर्णन को सीएफ अनुसंधान में उपयोग के लिए और अन्य वायुमार्ग रोगों के अध्ययन में सहायता के लिए यहां वर्णित किया गया है। . ऑर्गेनोइड मॉडल अमर सेल लाइनों की तरह असीमित नहीं है, लेकिन सशर्त रीप्रोग्रामिंग (विकिरणित और निष्क्रिय फीडर फाइब्रोब्लास्ट्स और रो-किनेज इनहिबिटर का उपयोग करके) को अधिक स्टेम सेल जैसी स्थिति 20,21,22,23 तक विस्तारित किया जा सकता है। इस विधि का उपयोग करके एचएनई ब्रश बायोप्सी का प्रसंस्करण उच्च थ्रूपुट पर कई अनुप्रयोगों में उपयोग के लिए बड़ी संख्या में उपकला कोशिकाओं को उत्पन्न करता है, जबकि अभी भी पूरी तरह से अंतर करने की क्षमता को बनाए रखता है। जबकि इस प्रोटोकॉल को फीडर कोशिकाओं का उपयोग करके विकसित किया गया था, फीडर सेल तकनीक14,24 से बचने के इच्छुक जांचकर्ताओं द्वारा अन्य तरीकों का उपयोग किया जा सकता है।
फुफ्फुसीय जीव विज्ञान के लिए तकनीक का महत्व
एक महत्वपूर्ण अध्ययन यह समझने के लिए समर्पित किया गया है कि उपकला कोशिकाओं की कोशिका झिल्ली में नियमित, कार्यशील सीएफटीआर की अनुपस्थिति के परिणामस्वरूप फेफड़ों, अग्न्याशय, यकृत, आंत या अन्य ऊतकों में शिथिलता कैसे होती है। बेकार उपकला आयन परिवहन, विशेष रूप से क्लोराइड और बाइकार्बोनेट के परिणामस्वरूप, उपकला अस्तर तरल पदार्थों की मात्रा में कमी और श्लेष्मा स्राव में परिवर्तन होता है, जिससे श्लेष्मा स्टैसिस और रुकावट होती है। अन्य वायुमार्ग रोगों में, जैसे कि प्राथमिक सिलियरी डिस्किनेसिया, परिवर्तित सिलिअरी गति म्यूकोसिलियरी निकासी को बाधित करती है और श्लेष्म स्टैसिस और रुकावट25 की ओर ले जाती है। इसलिए, वर्तमान एचएनई ऑर्गेनोइड मॉडल को विभिन्न अनुप्रयोगों के लिए विकसित किया गया है, जो अन्वेषक के प्रयोगात्मक डिजाइन और संसाधनों पर निर्भर करता है। इसमें लाइव-सेल दाग का उपयोग करके लाइव-सेल इमेजिंग शामिल है; आकृति विज्ञान को चिह्नित करने के लिए निर्धारण और विभाजन; इंट्राल्यूमिनल संरचनाओं को बाधित करने से बचने के लिए एंटीबॉडी और पूरे-माउंट कॉन्फोकल इमेजिंग के साथ इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला; और चमकीले क्षेत्र इमेजिंग और माइक्रो ऑप्टिकल सुसंगतता टोमोग्राफी सिलियरी बीट आवृत्ति और mucociliary परिवहन के मात्रात्मक मापके लिए 13. अन्य जांचकर्ताओं के विस्तार की सुविधा के लिए, व्यावसायिक रूप से उपलब्ध अभिकर्मकों और आपूर्ति का उपयोग खेती के लिए किया गया था। एक कार्यात्मक परख विकसित किया गया था कि आम माइक्रोस्कोप तकनीकों और अधिक विशेष उपकरणों का इस्तेमाल किया. कुल मिलाकर, जबकि वर्तमान मॉडल को बेसलाइन पर या चिकित्सीय के जवाब में सीएफटीआर गतिविधि का आकलन करने के लिए डिज़ाइन किया गया था, इस प्रोटोकॉल में वर्णित तकनीकों को उपकला सेल फ़ंक्शन, विशेष रूप से उपकला सेल द्रव परिवहन से जुड़ी अन्य बीमारियों पर लागू किया जा सकता है।
अन्य तरीकों की तुलना
हाल ही में इस ऑर्गेनोइड मॉडल की उपयोगिता को उनकी नैदानिक प्रतिक्रिया11 के साथ रोगियों के ऑर्गेनोइड्स के इन विट्रो सीएफटीआर मॉड्यूलेटर प्रतिक्रियाओं को सहसंबद्ध करके विकसित किया गया था। विशेष रूप से, यह भी प्रदर्शित किया गया है कि वर्तमान मॉडल ने शॉर्ट-सर्किट वर्तमान प्रतिक्रियाओं को समानांतर किया, सीएफटीआर फ़ंक्शन का आकलन करने के लिए वर्तमान स्वर्ण मानक, एक ही रोगियों में। शॉर्ट-सर्किट वर्तमान सूजन परख से अलग है क्योंकि पूर्व उपायों CFTR आयन परिवहन26 के माध्यम से समारोह. इसके विपरीत, यह परख तरल पदार्थ परिवहन के साथ एक और अधिक डाउनस्ट्रीम प्रभाव को मापता है, CFTR 27,28,29,30,31,32 के समग्र कार्य के बारे में अतिरिक्त जानकारी प्रदान करता है। शॉर्ट-सर्किट वर्तमान माप सीएफटीआर क्लोराइड चैनल गतिविधि 1,33 को निर्धारित करने के लिए एक सामान्य और विश्वसनीय विधि बनी हुई है। इन electrophysiological assays विशेष, महंगा उपकरण की आवश्यकता है, organoid परख की तुलना में प्रत्येक प्रयोगात्मक प्रतिकृति के लिए कई बार अधिक कोशिकाओं की आवश्यकता है, आसानी से स्वचालित नहीं किया जा सकता है, और उच्च थ्रूपुट अनुप्रयोगों के लिए स्केलिंग करने के लिए अनुकूल नहीं हैं। आंतों के एपिथेलिया से व्युत्पन्न एक अन्य ऑर्गेनोइड मॉडल के अतिरिक्त लाभ 15,16,17,18 हैं, जैसे कि अधिक उत्कृष्ट प्रतिकृति क्षमता, लेकिन न तो वायुमार्ग के ऊतकों से व्युत्पन्न है और न ही सार्वभौमिक रूप से उपलब्ध है। एचएनई ब्रशिंग को बेहोश करने की क्रिया की आवश्यकता के बिना और न्यूनतम जोखिम पर सस्ती साइटोलॉजी ब्रश के साथ प्राप्त किया जाता है। ब्रशिंग प्राप्त करने के लिए एक चिकित्सक की आवश्यकता नहीं होती है और प्रशिक्षित अनुसंधान समन्वयकों और अन्य शोध कर्मचारियों द्वारा किया जा सकताहै। एचएनई ऑर्गेनोइड मॉडल को प्राथमिक सेल संस्कृति क्षमताओं के साथ किसी भी प्रयोगशाला द्वारा सुसंस्कृत किया जा सकता है, और कुछ अनुप्रयोगों को मानक माइक्रोस्कोपी तकनीकों के साथ किया जा सकता है। कुल मिलाकर, ये फायदे वायुमार्ग उपकला समारोह का आकलन करने के लिए प्रौद्योगिकी तक अतिरिक्त पहुंच प्रदान करते हैं जो अन्यथा कुछ प्रयोगशालाओं के लिए अनुपलब्ध हो सकते हैं। इसके अलावा, एचएनई ऑर्गेनोइड्स का उपयोग अन्य रोग राज्यों का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है जो वायुमार्ग को प्रभावित करते हैं, जैसे कि प्राथमिक सिलिअरी डिस्किनेसिया25 या वायरल संक्रमण, जो आंतों के ऑर्गेनोइड्स नहीं कर सकते हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
यह पांडुलिपि एचएनई ब्रश बायोप्सी से व्युत्पन्न वायुमार्ग उपकला ऑर्गेनोइड्स के व्यापक लाइव और फिक्स्ड इमेजिंग के लिए विस्तृत तरीके प्रदान करती है। यह कार्यात्मक assays का वर्णन करता है जो किसी व्यक्ति म?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम कृतज्ञतापूर्वक उन सभी प्रतिभागियों के योगदान को स्वीकार करते हैं जिन्होंने इस प्रोटोकॉल को विकसित करने के लिए एचएनई ब्रश बायोप्सी दान की थी। हम अध्ययन स्वयंसेवक भर्ती और नमूना संग्रह के समन्वय के लिए Latona Kersh और बच्चों की अनुसंधान इकाई के कर्मचारियों को धन्यवाद देते हैं। हम लिली डेंग, जॉनथन बेली और स्टीफन मैके, हमारी प्रयोगशाला में पूर्व प्रशिक्षुओं को तकनीकी सहायता के लिए धन्यवाद देते हैं। हम झोंग लियू और रुई झाओ को उनकी तकनीकी मदद के लिए धन्यवाद देते हैं। यूएबी में सीएफ रिसर्च सेंटर के निदेशक स्टीवन एम रोवे नेतृत्व और संसाधन प्रदान करते हैं, जिसके बिना यह काम संभव नहीं होगा। हम भी साधन प्रशिक्षण के साथ सहायता के लिए Biotek में सारा Guadiana धन्यवाद करना चाहते हैं, रॉबर्ट Grabski UAB उच्च संकल्प इमेजिंग सुविधा में confocal माइक्रोस्कोपी सहायता के लिए, और UAB Histology कोर में हिस्टोलॉजिकल सहायता के लिए Dezhi वांग. इस काम को राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (एनआईएच) द्वारा समर्थित किया गया था। अनुदान K23HL143167 (जेएसजी के लिए), सिस्टिक फाइब्रोसिस फाउंडेशन (CFF) अनुदान GUIMBE18A0-Q (जेएसजी के लिए), ग्रेगरी फ्लेमिंग जेम्स सिस्टिक फाइब्रोसिस केंद्र [NIH अनुदान R35HL135816 और DK072482 और बर्मिंघम (UAB) अनुसंधान और विकास कार्यक्रम (Rowe19RO)] में अलबामा के CFF विश्वविद्यालय, और नैदानिक और ट्रांसलेशनल विज्ञान के लिए UAB केंद्र (NIH19RO)
Materials
| Nasal brush | Medical Packaging CYB1 | CYB-1 | Length: 8 inches, width approximately 7 mm |
| Large-Orifice Pipette Tips | ThermoFisher Scientific | 02-707-141 | Large bore pipette tips |
| Accutase | ThermoFisher Scientific | A1110501 | Cell detachment solution |
| 0.05% trypsin -EDTA | Gibco | 25300-054 | |
| Trypsin inhibitor from soybean | Sigma | T6522 | Working solution: 1mg/mL in 1XDPBS |
| Matrigel matrix | Corning | 356255 | Extracellular matrix (EM) |
| µ-Slide Angiogenesis | Ibidi | 81506 | 15-well slide |
| 24-Well Transwell | Corning | 7200154 | Culture insert |
| Chambered Coverglass | ThermoFisher Scientific | 155409 | 8-well glass-bottom chamber slides |
| Cell-Tak Cell and Tissue Adhesive | ThermoFisher Scientific | 354240 | Cell adhesive |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 50980487 | |
| Triton X-100 | Alfa Aesar | A16046 | |
| BSA | ThermoFisher Scientific | BP1600-100 | |
| NucBlue | ThermoFisher Scientific | R37605 | DAPI |
| Eclipse Ts2-FL (Inverted Routine Microscope) | Nikon | Inverted epi-fluorescence microscope or bright-field microscope | |
| Nikon A1R-HD25 | Nikon | Confocal microscope | |
| NIS Elements- Basic Research | Nikon | manual imaging analysis software | |
| Histogel | ThermoFisher Scientific | HG-4000-012 | |
| Disposable Base Molds | ThermoFisher Scientific | 41-740 | |
| Lionheart FX | BioTek | BTLFX | Automated image system |
| Lionheart Cover | BioTek | BT1450009 | Environmental Control Lid |
| Humidity Chamber | BioTek | BT1450006 | Stage insert (environmental chamber) |
| Gas Controller for CO2 and O2 | BioTek | BT1210013 | Gas controller |
| Microplate/Slide Stage Insert | BioTek | BT1450527 | Slide holder |
| Gen5 Imaging Prime Software | BioTek | BTGEN5IPRIM | Automated imaging analysis software |
| 4x Phase Contrast Objective | BioTek | BT1320515 | |
| 10x Phase Contrast Objective | BioTek | BT1320516 | |
| LED Cube | BioTek | BT1225007 | |
| Filter Cube (DAPI) | BioTek | BT1225100 | DAPI |
| CFTRinh-172 | Selleck Chemicals | S7139 | |
| Forskolin | Sigma | F6886 | |
| IBMX | Sigma | I5879 | |
| Expansion Media | |||
| DMEM | ThermoFisher Scientific | 11965 | |
| F12 Nutrient mix | ThermoFisher Scientific | 11765 | |
| Fetal Bovine Serum | ThermoFisher Scientific | 16140-071 | |
| Penicillin/Streptomycin | ThermoFisher Scientific | 15-140-122 | |
| Cholera Toxin | Sigma | C8052 | |
| Epidermal Growth Factor (EGF) | ThermoFisher Scientific | PHG0314 | |
| Hydrocortisone (HC) | Sigma | H0888 | |
| Insulin | Sigma | I9278 | |
| Adenine | Sigma | A2786 | |
| Y-27632 | Stemgent | 04-0012-02 | |
| Antibiotic Media | |||
| Ceftazidime | Alfa Aesar | J66460-03 | |
| Tobramycin | Alfa Aesar | J67340 | |
| Vancomycin | Alfa Aesar | J67251 | |
| Amphotericin B | Sigma | A2942 | |
| Differentiation Media | |||
| DMEM/F-12 (1:1) | ThermoFisher Scientific | 11330-32 | |
| Ultroser-G | Pall | 15950-017 | |
| Fetal Clone II | Hyclone | SH30066.03 | |
| Bovine Brain Extract | Lonza | CC-4098 | |
| Insulin | Sigma | I-9278 | |
| Hydrocortisone | Sigma | H-0888 | |
| Triiodothyronine | Sigma | T-6397 | |
| Transferrin | Sigma | T-0665 | |
| Ethanolamine | Sigma | E-0135 | |
| Epinephrine | Sigma | E-4250 | |
| O-Phosphorylethanolamine | Sigma | P-0503 | |
| Retinoic Acid | Sigma | R-2625 | |
| Primary antibodies | |||
| Human CFTR antibody | R&D Systems | MAB1660 | Dilution: 100x |
| ZO-1 antibody | Thermo Fisher | MA3-39100-A647 | Dilution: 1000x |
| Anti-MUC5B antibody | Sigma | HPA008246 | Dilution: 100x |
| Anti-acetylated tubulin | Sigma | T7451 | Dilution: 100x |
| Anti-beta IV Tubulin antibody | Abcam | Ab11315 | Dilution: 100x |
| Secondary antibodies | |||
| Donkey anti-Mouse IgG (H+L), Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A21202 | Dilution: 2000x |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H+L), Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A21207 | Dilution: 2000x |
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