このプロトコルは、 その場で 軸索の成長および成長円錐ダイナミクスを研究するための簡単で堅牢な方法を実証する。 これは、生体外で 生理学的に関連する急性脳スライスを調製する方法を説明し、ユーザーフレンドリーな分析パイプラインを提供します。
ニューロンの発達の間、軸索は皮質環境をナビゲートして最終目的地に到達し、シナプス接続を確立する。成長円錐 – 軸索を発達させる遠位先端に位置する感覚構造 – は、このプロセスを実行します。成長円錐の構造とダイナミクスを研究することは、軸索の発達と、神経回路を形成することを可能にする周囲の中枢神経系(CNS)との相互作用を理解するために不可欠です。これは、基礎研究や前臨床の文脈で損傷後に軸索を神経回路に再統合する方法を考案する際に不可欠です。これまでのところ、成長円錐ダイナミクスの一般的な理解は、主に2次元(2D)で培養されたニューロンの研究に基づいています。成長円錐構造ダイナミクスと刺激に対する応答に関する現在の知識にとって間違いなく基本的なものですが、2D研究は、無傷のCNS組織においてニューロン成長円錐体が遭遇する生理学的3次元(3D)環境を誤って表現しています。より最近では、コラーゲンゲルがこれらの制限のいくつかを克服するために使用され、3Dでのニューロン発達の調査が可能になりました。しかし、合成2Dおよび3D環境の両方に、CNS組織内のシグナル伝達手がかりがなく、発達中の軸索の伸長および経路探索を指示する。このプロトコルは、発達中の軸索が生理学的に関連する物理的および化学的手がかりに遭遇する有機型脳スライスを使用して軸索および成長円錐を研究するための方法を提供する。このプロトコルは、子宮 内 エレクトロポレーションと 子宮外 エレクトロポレーションを組み合わせて蛍光レポーターをまばらに配信し、超解像顕微鏡とともに、軸索と成長円錐のダイナミクスを その場で視覚化するための方法論的パイプラインを提示します。さらに、長期および生細胞画像化データの分析の詳細なツールキット記述が含まれる。
ニューロンは、神経系における基本的な計算単位を表す高度に分極した細胞である。それらは、入力部位と出力部位の区画化に依存する情報(樹状突起および軸索、それぞれ1)を受信し、放出する。開発中、軸索は、信じられないほど複雑な環境をナビゲートしながら、目的地に到達しながら拡張します。軸索ナビゲーションは、発達中の軸索の先端に位置する感覚構造である成長円錐によって導かれる。成長円錐は、環境の手がかりを検出し、それらをその細胞骨格の動的空間再編成に変換する役割を担っています2,3。結果として生じる形態力学的反応は、成長円錐に誘発合図から伸縮するように指示し、特定の軸索操作をもたらす。
軸索伸長および成長円錐ダイナミクスの現在の理解は、2次元(2D)基質2、4、5、6、7にわたる軸索成長を評価する研究に由来する。これらの先駆的な研究は、成長円錐と成長基質との間の洗練された相互作用を同定し、接着性および剛性などの基質特性に依存する顕著な違いを明らかにした8,9。これらの洞察に導かれて、細胞外環境手がかりが軸索成長を指示する仮説が立てられ、成長円錐細胞骨格がこの成長を実行する2、10、11、12。注目すべきことに、ニューロンは、非接着性基質(例えば、ポリリジン、ポリオルニチン)中の軸索を伸長させることができる13。さらに、基質剛性は、細胞接着複合体8とは無関係に軸索増殖速度に影響を与え得る。したがって、2D基板における成長円錐ダイナミクスを研究するだけでは、軸索成長円錐と生理学的に関連する3次元(3D)環境(生体内に見られるような)との相互作用から生じる力のバランスを正確にモデル化することはできません。
2Dアッセイの限界を克服するために、軸索成長および成長円錐ダイナミクスが3D行列8、9において研究されてきた。これらのマトリックスは、より生理学的文脈をもたらすが、軸索成長の細胞内因性メカニズムを研究することを可能にする。これは、様々な条件および薬理学的処置における単一細胞様式での成長円錐検査を可能にする9。このような3D環境において、軸索は明確な細胞骨格ダイナミクスを示し、2D培養ニューロンで観察されたものよりも速く成長した9。これらの優雅な研究は、成長円錐体細胞骨格の再編成、ひいてはその挙動に対する余分な次元の影響を実証した。
ネイティブ様のニューロンの発達および軸索成長をサポートする上で、2D表面上の3Dマトリックスによって提示される明らかな利点にもかかわらず、それらは、中枢神経系(CNS)組織で観察されるダイナミクスの複雑さを反映することができない単純化された合成足場のままである。ここで、 ex utero および in utero electroporationによるレポータープラスミドの送達を、脳器官型スライス培養および in situ ライブ超解像画像と組み合わせて、生理学的文脈における成長円錐ダイナミクスを分析する。この方法論は、 生体内 環境の3次元性とその物理化学的組成の複雑さを経験しながら、発達中の軸索の視覚化を可能にする。最後に、一般的にライセンスされ、一般に入手可能なソフトウェアを使用して軸索の成長および成長円錐のダイナミクスを測定するためのユーザーフレンドリーな手順について説明します。
成長円錐体が周囲の環境をどのように感知し、反応して軸索の伸長とガイダンスを同時に調整するかは、まだ議論の余地があります3,18。2D基板における先駆的な研究は、軸索形成、外生、およびナビゲーション中に成長円錐ダイナミクスを駆動する力を生成する基本的な分子メカニズムを垣間見ることができた2,10,11,12,19。より最近では、3D行列の研究は、3次元が成長円錐の挙動、ひいては軸索の成長にどれほどの影響を与えるかを明らかにした8,9。それにもかかわらず、インビボでの成長円錐ダイナミクスを指示する複雑なメカニズムは、まだ徹底的に検討されていない。
IUEまたはEUE脳からの有機型スライス培養物の調製は広く利用されており、十分に文書化されている。これは、科学者が生きている脳組織におけるニューロンの発達と行動についての洞察を得ることを可能にする黄金の標準となっています20,21。実際、この技術は、その場で特定の分子プロセスおよび形態学的事象を視覚化するために、様々な高解像度イメージング技術と組み合わせて首尾よく利用されている。このような研究には、軸索形成および伸長19、22、皮質ニューロン遊走19、22、23、24、セントロソームダイナミクス25、26、微小管ダイナミクス27、ならびにシナプス前部およびシナプス前部28、29の機能的ダイナミクスが含まれる。
このプロトコルは、実験的神経生物学におけるギャップに対処し、 その場で皮質ニューロンを発達させる成長円錐ダイナミクス、 ex vivo 急性脳スライス培養物、および得られたデータを分析するためのツールを視覚化する。
急性脳スライス培養物は、(1)いくつかの実践では、生成が容易であるため、このプロトコルを確立するために利用された。(2)準生理学的環境に埋め込まれた成長円錐を研究するためのアクセス可能なシステムを提示するが、高解像度の生細胞イメージングを可能にするのに十分透明である。(3)無数のトランスジェニックマウス系統と共にその使用のために拡張することができる;(4)IUEまたはEUEのいずれかと組み合わせることで、蛍光レポーターおよび細胞骨格プローブとともに、機能レジームの喪失/獲得下でのインビボでの成長円錐および軸索の性能を評価するための分子ツールを提供する事実上無限の可能性を提供する。
この方法論は、EUEとIUEの両方の文脈で記述された。依然として信頼性の高い方法であるが、EUEは、送達方法としてIUEを用いて得られたものと比較して、無秩序なRGネットワークを示す脳スライスの発生率の増加をもたらした(図4C)。RGアレイにおける外乱は、ニューロン遊走および軸索伸長のパターン30、31に強く影響する。これらは、特定の時点で分析用の軸索を見つける場所と、それらがナビゲートしている環境の種類を予測する重要なパラメータです。著しく破壊されたRGネットワークを有する脳スライスは、典型的には、皮質ニューロン層別形成の障害を有する。これは、順番に、混沌とした軌道を持つ軸索を生成します。したがって、RGネットワークの構造的完全性を制御することを強くお勧めします。興味深いことに、構造的完全性の低さは、胚性脳の年齢の増加と相関する。実際、若いE12.5-E13.5胚においてそのような効果は典型的には観察されなかった19。
現在のプロトコルは徹底的かつ単純です。それにもかかわらず、最適な結果を得るために特別な注意と注意を払わなければならないいくつかの重要なステップがあります。これらはプロトコルに明示的に記載されており、(1)エレクトロポレーションで使用されるDNAの量を調整してまばらな標識を得ることを含む。(2)脳の抽出中の損傷を避ける;(3)脳ケーシング中のアガロースの温度を制御する工程;(4)所定の年齢の脳に対するアガロースの理想的な割合をトラブルシューティングする。(5)蛍光色素の選択、その経験は以下の通りである。プロトコルの最適化中に、生細胞in situイメージングにおける いくつかの蛍光色素の性能が試験されました。LifeActタグ付きプラスミドおよびLynタグ付きプラスミドの調製のための単量体GFP変異体EGFPおよびNeonGreenを、このプロトコールについて選択した(図5A、B)。さらに、RFPバリアントmScarletがテストされ、このセットアップに非常に適していることが判明しました(データは示されていません)。多量体tRFP(二量体)およびZsGreen(四量体)(図5C および 補足ビデオ1、 右)も試験した。これらの高速フォールディング超高輝度蛍光色素分子は、DNA送達後に迅速な蛍光シグナル生成が必要な場合に推奨されます。
スライス培養を使用する際の一般的な方法は、異なる脳からのスライスを利用して、制御および実験条件をテストすることです。これは、望ましくない変動性の固有の原因を表します。ここでは、同定のために隣接するニューロンおよびレポーターの発現の独立した改変を可能にする発現系を用いた。なお、このデモンストレーション(図5C)では、いずれの蛍光色素分子を発現するニューロン間に差異はなかった。しかしながら、一例として、Cre感受性遺伝子を保有するトランスジェニックマウス系統と組み合わせたこのようなプラスミドミックスは、野生型として残ったtRFP(Dre感受性)ニューロンで標識するであろう。対照的に、ZsGreen(またCre感受性)は、組換えニューロンにラベルを付けます。したがって、2つの異なる遺伝子型の成長円錐形、そしておそらく表現型も、同じ脳スライス内で同時に並べて研究することができた。
分析のための軸索および成長円錐の局在化は重要な考慮事項である。皮質ニューロンは、心室帯(VZ)から皮質板(CP)に向かって放射状に移動しながら分極する。このプロセスの間、ニューロンは、軸索となる先行プロセス(将来の樹状突起)および後続プロセスを形成し、最終的に中間ゾーン(IZ)における先駆的な軸索を結合し、軸索管32を確立する。したがって、軸索成長円錐体を捕捉するために、CPから出る軸索および軸索束に既に関連する早期に生成された軸索を含む、IZ内の軸索線維についてイメージングが行われた。または最終的には、IZを横切ってその下に延びる繊維で(図7)。
このプロトコルは、有機型スライス内のニューロンの超解像イメージングを実行することを実現可能にする。歴史的に、光散乱は厚い試料をイメージングする際に直面する大きな問題でした。過去20年間、光学技術の広範な進歩により、厚い試料のイメージングが可能になりました。ここでは、成長円錐などの小さな構造をよりよく視覚化するために、長い作動距離対物レンズを使用しました。必然的に、このプロトコルは、逆行性アクチン流または微小管ダイナミクスなどのより詳細な事象を捕捉しない。長い作動距離対物レンズは、より低い開口数(NA)を必要とし、厚いスライスからの情報を保持します。しかし、このプロトコルを作動距離の短縮を目的として使用するために適合させることも可能であった。これには、構造的完全性を維持するために、スライスをガラス底の皿にスムーズに移す必要がありました。しかし、この方法を使用すると、ガス交換の喪失により、生存期間が短くなり、〜15時間が短縮されました(データは示されていません)。2D カルチャとは異なり、3D の成長円錐はより大きな体積を占め、Z 軸での動き – アーチファクト補正を必要とします。詳細な事象を画像化する能力を高めるためには、現代の共焦点技術を利用する必要があります。したがって、高感度共焦点顕微鏡33で利用可能なz−Galvoのような高速走査zスタックモータを使用することが推奨される。
注目すべきは、このプロトコルには 3 つの主な制限があります。第1に、任意のプラスミドの発現レベル/発現細胞数を インビボで制御することはしばしば困難である。これにより、同じプラスミド濃度を維持した場合でも、すべてのスライス間にばらつきが生じます。したがって、使用する発現ベクターにおける調節エレメントの選択は、注意して予め決められていなければならない。第二に、メンブレンインサートを用いて詳細な事象を画像化することは、現在実現不可能である。この第2の制限は、前の段落で提案された方法論的更新によって克服することができる。最後に、成長円錐は非常に感光性があり、すぐに光漂白される可能性があります。したがって、成長円錐の頻繁な画像化は、レーザー走査顕微鏡を用いてわずか5分間、成長円錐を崩壊させることが多い。これに関して、生成された装置のライトシート顕微鏡における新たな進歩は、脳スライス34の長期画像化に適合させることができる。
このようなプロトコルは、新しい研究の道を開き、成長円錐が複雑な in vivo 環境を読み取って反応するために必要なものをよりよく理解できるようにし、さらに重要なことに、この洗練された相互作用のメカニズムを解明することが想定されています。
The authors have nothing to disclose.
手順を撮影してくれたマリア・エウジェニア・ベルニスに感謝します。また、原稿を読んで議論してくれたエミリー・バーンサイド、エミリー・ハンドリー、ソーベン・ピエトララ、マックス・シェルスキー、シーナ・スターンにも感謝します。私たちは、優れた技術アシスタントであるジェシカ・ゴニエ、ブランカ・ランデル、アン・トゥアン・ファムに感謝しています。我々は、DZNEの光学顕微鏡施設及び動物施設の貴重な支援を認識する。この研究は、Deutsche Forschungsgesellschaft(DFG)、International Foundation for Research in Paraplegia(IRP)、Wings for Life(F.B)の支援を受けました。F.B.は、エクセレンスクラスターImmunoSensation2、SFBs1089および1158のメンバーであり、Roger De Spoelberch Prizeを受賞しています。
Adson Forceps | Fine Science Tools | 11006-12 | |
Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A21202 | Goat Anti-Mouse |
Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A21236 | Goat Anti-Mouse |
Anti-Vimentin antibody | sigma-Aldrich | V2258-.2ML | Monoclonal mouse, clone LN-6, ascites fluid |
B27 supplement | ThermoFisher Scientific | 17504044 | |
Betadine | B. Braun | 3864154 | |
Biozym Sieve GP Agarose | Biozyme | 850080 | |
Braunol, Sprühflasche | B. Braun | 3864073 | |
Buprenorphine (Temgesic) | GEHE Pharma | 345928 | |
DAPI | sigma-Aldrich | D9542 | |
DMZ unevirsal electrode puller | Zeitz | NA | |
Electric razor | Andes | NA | ProClip UltraEdge Super 2-Speed model |
Enrofloxacin (Baytril) | Bayer | 3543238 | 2,5% (wt/vol) |
Eppendorf microloader pipette tips | FischerScientific | 10289651 | |
Fast Green FCF | Sigma-Aldrich | F7252-5G | Dye content ≥ 85 % |
Fetal Bovine Serum | ThermoFisher Scientific | 10500064 | |
Fiji 2.1.0 | NIH | NA | https://imagej.net/software/fiji/downloads |
Fine Scissors | Fine Science Tools | 14058-09 | ToughCut/Straight/9cm |
FluoroDish Cell Culture Dish | World Precision Instruments | FD5040-100 | |
Fluoromount Aqueous Mounting Medium | sigma-Aldrich | F4680-25ML | |
Glucose | MedPex | 3705391 | 5% |
GlutaMAX Supplement | ThermoFisher Scientific | 35050061 | |
Glycine | Sigma-Aldrich | G8898 | |
HBSS | Life Technologies | 14025092 | calcium, magnesium, no phenol red |
Horse serum | Pan-Biotech | P30-0711 | |
Imaris 9.7.2 | Bitplane | NA | https://imaris.oxinst.com/products/imaris-for-neuroscientists |
Isoflurane | Virbac | NA | |
Isotonic saline solution | B. Braun | 8609261 | 0.90% |
Leica VT1200 S vibratome | Leica | 14048142066 | |
LSM 880 with Airyscan | Zeiss | NA | |
Metacam | Venusberg Apotheke | 8890217 | 5 mg/ml |
Mice | Janvier Labs | NA | C57BL/6JRj |
Micro-Adson Forceps | Fine Science Tools | 11018-12 | |
Micropipette Storage Jar | World Precision Instruments | E210 | 16.16.27 |
Microsoft Excel | Microsoft | NA | https://www.microsoft.com/en-us/microsoft-365/p/excel/cfq7ttc0k7dx?activetab=pivot:overviewtab |
Millicell Cell Culture Insert | EMD Millipore | PICM0RG50 | 30 mm, hydrophilic PTFE, 0.4 µm |
Moria Perforated Spoons | Fine Science Tools | 10370-18 | |
Moria Spoon | Fine Science Tools | 10321-08 | |
Neurobasal Medium, minus phenol red | ThermoFisher Scientific | 12348017 | |
Neuropan-2 supplement | Pan-Biotech | P07-11010 | |
Normal goat serum | Abcam | ab138478 | |
Olsen-Hegar Needle Holder with Scissors | Fine Science Tools | 12002-12 | |
p-Tub-alpha-1-Dre | Addgene | 133925 | |
p-Tub-alpha-1-iCre | Addgene | 133924 | |
p-Tub-alpha-1-LifeAct-GFP | Addgene | 175437 | |
Parafilm | VWR | 52858-000 | |
Paraformaldehyde | sigma-Aldrich | P6148 | |
PBS | Sigma-Aldrich | P3813-10PAK | |
pCAG-lox-rox-STOP-rox-tRFP-lox-Lyn-ZsGreen | Addgene | 175438 | |
pCAG-lox-STOP-lox-Lyn-mNeonGreen | Addgene | 175257 | |
Penicillin-Streptomycin | ThermoFisher Scientific | 15140122 | |
PicoNozzle Kit v2 | World Precision Instruments | 5430-ALL | |
Platinum Tweezertrodes | Harvard Apparatus | 45-0487 | 1 mm / 3 mm |
QIAGEN Maxi kit | QIAGEN | 12162 | |
Reflex wound closure Clip | World Precision Instruments | 500344-10 | 7 mm |
Sekundenkleber Pattex Mini Trio | Lyreco | 4722659 | |
Square wave electroporation system ECM830 | Harvard Apparatus | W3 45-0052 | |
Sterile gauze | Braun Askina | 9031216 | |
Sterile lubricant eye ointment | Bayer Vital | PZN1578675 | |
Sterile surgical gloves | Sempermed | 14C0451 | |
Sucrose | Roth | 4621.2 | |
Supramid 5-0 surgical silk sutures | B. Braun | NA | |
Thin-wall glass capillaries | World Precision Instruments | TW100-4 | |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 15000-03 | |
µ-Slide 8 Well Glass Bottom | Ibidi | 80827 |