Denne protokollen presenterer metodikk for å utføre biofilmvekst og biomassemålinger ved hjelp av selvmonterte PCR-plateenheter med dyp brønn for 96-brønns lokk statisk biofilmscreening.
Bakterielle biofilmer er vanskelige å utrydde fra overflater ved hjelp av konvensjonelle antimikrobielle inngrep. Mikroplatemetoder med høy gjennomstrømning på 96 brønner brukes ofte til å dyrke bakterielle biofilmer for rask antimikrobiell følsomhetstesting for å beregne minimale VERDIER for biofilmutryddelseskonsentrasjon (MBEC). Standard biofilmenheter består av polystyrenpinnede lokk montert på 96-brønns mikroplater og er ideelle for måling av biofilmbiomasse og MBEC-verdier, men disse enhetene er begrenset av tilgjengelig pluggoverflate for biomasseakkumulering og kostnad. Her skisserer vi en protokoll for å bruke selvmontert polypropylen 96-brønns dyp brønn PCR-plate festet lokkenhet for å vokse Escherichia coli BW25113 og Pseudomonas aeruginosa PAO1 biofilmer. En sammenligning av 24-timers biofilmer dannet på standard og dype brønninnretninger av hver art ved hjelp av krystallfiolett biomassefarging og MBEC-bestemmelsesanalyser er beskrevet. Det større overflatearealet av dypbrønninnretninger økte forventet generell biofilmdannelse med begge artene 2-4 ganger. P. aeruginosa dannet betydelig større biomasse /mm2 på dype brønnpinner sammenlignet med standardenheten. E. coli hadde større biomasse/mm2 på standard polystyreninnretninger sammenlignet med dypbrønnanordningen. Biofilm utryddelsesanalyser med desinfeksjonsmidler som natriumhypokloritt (blekemiddel) eller benzalkoniumklorid (BZK) viste at begge forbindelsene kunne eliminere E. coli og P. aeruginosa biofilmer fra begge enhetene, men ved forskjellige MBEC-verdier. Utryddelse av BZK biofilm resulterte i variable E. coli MBEC-verdier mellom enheter, men blekemiddel demonstrerte reproduserbare MBEC-verdier for både arter og enheter. Denne studien gir en dyp brønnmetode med høy gjennomstrømning for å dyrke større mengder biofilmer på polypropylenenheter for nedstrømsstudier som krever høyere mengder statisk biofilm.
Pseudomonas aeruginosa og Escherichia coli er Gram-negative proteobakterier som ofte studeres for deres evne til å danne sessile, overflatetilknyttede cellesamfunn kjent som biofilmer1. Begge artene, når de vokser som biofilmer, kan utskille en matrise av ekstracellulære polymere stoffer (EPS) som hovedsakelig består av forskjellige polysakkarider og proteiner, som også kan inkludere ekstracellulært DNA og / eller lipider, noe som gir ekstra cellulær beskyttelse og forbedret overlevelse i tøffe, næringsbegrensede miljøer2,3. Biofilmfysiologi og dannelse av begge arter er av klinisk relevans, da de representerer de fem mest isolerte antimikrobielle resistente patogenene fra sykehuspasientblod, urinveier og lungeinfeksjoner i Canada4,5. Det er også viktig å merke seg at biofilmer anslås å utgjøre nesten 80% av alle kroniske og tilbakevendende infeksjoner forårsaket av disse bakterielle artene6. På grunn av de utskilte EPS-stoffene og langsommere metabolsk aktivitet7,8, blir etablerte biofilmer vanskeligere å utrydde når de dannes på overflater som implantert medisinsk utstyr, arrvev og i lungene til cystiske fibrosepasienter9,10, og legger til deres antimikrobielle resistens.
De tilbakevendende vekstegenskapene til bakterielle biofilmer gjør dem ofte mer motstandsdyktige mot antimikrobiell hemming og/eller utryddelse2,9. Dermed er etablering av in vitro-metoder for å studere bakteriell biofilm antimikrobiell utryddelse avgjørende for å velge effektive forbindelser for å utrydde infeksjoner når de dannes på medisinsk plast (f.eks. in-dwelling katetre) og medisinske implantater. De raskeste in vitro biofilm antimikrobielle utryddelseskulturene undersøker biofilmvekst som en “statisk” biofilmkultur i stedet for “kontinuerlige” kulturer, der statisk bakterievekst overvåkes tidlig til sent i biofilmdannelse over en kort (24-96 t) tidsramme i samme vekstmedium. Kontinuerlige biofilmmetoder er tungvint for rask analyse, da de krever biofilmvekst vurdert over lengre tidsrammer dyrket i kamre som tillater kontinuerlig strømning og utskifting av vekstmedier med færre replikeringer11. På grunn av tiden og innsatsen som kreves for å opprettholde og etablere kontinuerlige biofilmer, er statiske in vitro biofilmer de mest populære, da de lett tilpasses for antimikrobielle følsomhetstester med høy gjennomstrømning i plast 96-brønns mikrotiterplater i stedet for forseggjorte strømningskammersystemer som begrenser antall kulturer samtidig testet 12,13 . De enkleste statiske “in-well” biofilmmikroplateanalysene bruker standard polystyren eller vinyl (300 μL kapasitet) mikrotiterplater for å måle biofilmdannelse på sidene og bunnen av hver brønn og ofte som ringer i luften til flytende overflategrensesnitt. Bakteriell biofilmdannelse måles ved å fargelegge de avsatte biomassene som følges av brønnene etter at vekstmediumvæsken er fjernet og biofilmene vaskes12,13. Disse analysene er økonomisk populære, men har ofte reproduserbarhetsproblemer på grunn av deres iboende design, da avsatte biofilmer er utsatt for skade eller tap under skylling for cellegjenoppretting og biomassefargingsprosedyrer11,14.
For å redusere biofilmtap har standard kommersielle biofilmenheter forbedret biofilmmikroplatedesignene i brønnen ved å legge til et innsettingsbart 96-brønns polystyrenlokk til standard 96-tommers platedesign, referert til som “standard biofilmenhet” heri. Tilsetningen av et festet lokk utvider det tilgjengelige overflatearealet i hver mikroplatebrønn, noe som gir forbedret overflatetilslutning og biofilmbiomassedannelse15,16. Standard biofilm-tilkoblede lokkenheter gir mulighet for større biofilmgjenvinning, fjerning og skylling for påfølgende antimikrobiell biofilmfølsomhet og utryddelsestesting når festede lokk settes inn i nye mikrotiterplater som inneholder utfordringer knyttet til stoff eller veksttilstand. I likhet med biofilmmikroplateteknikker i brønnen, gir de gjenvunne materialene fra de fjernede og vaskede lokkenhetene mulighet for celleoverlevelsestesting og biofilmbiomassefarging, vanligvis med krystallfiolett (CV) fargeformuleringer 17,18,19. Standard biofilmenheter er også optimale for screening av biofilm antimikrobielle følsomheter. Disse analysene overvåker biofilmvekstinhibering på to måter: 1) Når antimikrobielle midler legges til celler ved starten av veksten, kan det bestemme minimum biofilmhemmingskonsentrasjon (MBIC) verdi. 2) Når etablerte biofilmer dannes på pinnene etter 24 timer og deretter utsettes for antimikrobielle midler, kan den bestemme minimum biofilm utryddelse konsentrasjon (MBEC) verdi 17,20. I likhet med in-well biofilm mikroplateenheter har standard biofilmenheter noen bemerkelsesverdige begrensninger, for eksempel deres høye kostnader per enhet, de er ikke-autoklaverbare og mindre holdbare for kjemiske løsningsmidler på grunn av polystyrenplaten som brukes. Standard biofilmenheter har også et lavt overflateareal til pluggforhold, noe som begrenser de maksimale arbeidsvolumene i hver brønn til 200 μL. Disse faktorene kan gjøre standard biofilmenheter mer utfordrende å bruke til studier som krever større mengder biofilm i et høygjennomstrømningsformat.
Her beskriver vi en statisk biofilm pegged-lid 96-brønns metode utviklet i laboratoriet vårt ved hjelp av kommersielt tilgjengelige polypropylen halvskjørte 0,5 ml 96-brønns PCR-plater montert på 96-brønns mikrotiterplater som har brønner dypere enn standardplaten (Materialbord). Disse monterte enhetene har et maksimalt arbeidsvolum på 750 μL når de brukes til voksende biofilm (heri kjent som “dyp brønn biofilmenhet”). Fordelene ved å bruke disse biofilmenhetene med dyp brønn er deres lavere kostnader sammenlignet med standard biofilmenheter, de kan steriliseres ved autoklavering, og de øker overflatearealet for biofilmdannelse på den større eksterne PCR-platen “rør / pinner”. Med denne metoden viser vi anvendelsene av disse enhetene for dyrking og karakterisering av biofilmbiomasse dannet av Escherichia coli BW25113 og P. aeruginosa PAO1. Metoder for å bestemme MBEC-verdier ved hjelp av biofilm utryddelsesanalyser er beskrevet ved hjelp av kvartær ammoniumforbindelsesdesinfeksjonsmiddel benzalkoniumklorid (BZK) og natriumhypokloritt (blekemiddel) antimikrobielle midler. Det antiseptiske/desinfeksjonsmiddelet BZK ble valgt da denne forbindelsen ofte brukes til å hemme biofilmer fra forurensede overflater, men det er angivelig mindre effektivt til å utrydde veletablerte biofilmer21. Blekemiddel er et svært effektivt kjemikalie for utryddelse av etablerte biofilmer og er en bærebjelke i kjemisk desinfeksjon 22. Begge desinfeksjonsmidler gir en nyttig sammenligning av MBEC-verdier for hver biofilmenhet21. En protokoll for denne biofilmenhetsvurderingen ved hjelp av CV-farging og biofilmutryddelsesanalyser for MBEC-bestemmelse er oppsummert i denne artikkelen. Et protokollflytskjema er inkludert for en forenklet oversikt over arbeidsflyten for disse metodene (figur 1).
Denne studien beskriver metoder for bruk av et større volum 96-brønns statisk biofilmvekstenhet med høy gjennomstrømning som involverer en polypropylen dyp brønnmikroplate utstyrt med et halvskjørt PCR-platelokk for biofilmdannelse (dyp brønnbiofilmenhet; Tabell over materialer). Vi sammenlignet biofilmer generert med denne enheten med en kommersielt tilgjengelig biofilmenhet av polystyrenstandard (Materialfortegnelse). Den dype brønnenhetsmetoden bruker de samme metodologiske trinnene og løsningene som standardenheten17 ved justerte volumer modifisert for de dype brønninnretningene, noe som gjør denne enheten ideell for storskala biofilmdannelse og eksperimentell analyse. Veksten av E. coli BW25113 og P. aeruginosa PAO1, to Gram-negative arter som er kjent for å danne biofilmer, ble undersøkt for deres biomassedannelse og desinfeksjonsmiddel (BZK / blekemiddel) MBEC-verdier ved bruk på begge enhetene. Sammenligning av CV-farget biomasse dannet på pinner fra hver enhet viste at både E. coli og P. aeruginosa dannet biofilmer med høyere biomasse på dypbrønnbiofilmenheten sammenlignet med standardenheten (figur 3A-B). Økt biofilmbiomasse reflekterte det større overflatearealet av dype brønnpinner sammenlignet med standard overflateareal for enhetspinne. Når vi redegjorde for forskjeller i pluggoverflateområder (mm2) med begge enhetene, ble det notert forskjeller i biomassedannelse, der E. coli dannet betydelig større CV-biomasse per mm2 på polystyrenstandard enhetspinner enn med den dype brønnenhetens PCR-rørpinner (tabell 1). P. aeruginosa dannet større CV-farget biomasse/peg mm2 sammenlignet med standardinnretninger (tabell 1). Disse funnene kan fremheve artsspesifikke forskjeller i biofilmbiomassedannelse på de ulike enhetene.
Det skal bemerkes at blekemiddelutryddelse av E. coli og P. aeruginosa biofilmer på dyp brønninnretninger oppstod ved 2-4 ganger lavere konsentrasjoner enn standardenheten (figur 4A-B, tabell 1). Forskjellene i blekemiddel MBEC-verdier identifisert fra hver enhet påvirkes sannsynligvis av forskjeller i enhetspinneformer (dype brønnpinner” er koniske rør og standardpinner er sylindriske), plastsammensetningsforskjeller (polypropylen versus polystyren) og volumforskjeller (750 μL versus 200 μL). For eksempel hadde P. aeruginosa større CV M biomasse/ mm2 på dyp brønnenhetspinner sammenlignet med standardinnretninger, men E. coli hadde mindre biomasse på dype brønnpinner (figur 3). Dette antyder at desinfeksjonskonsentrasjoner som kreves for biofilmutryddelse, kan påvirkes av biomassen dannet av hver art så vel som det tilgjengelige overflatearealet. I tillegg kan forskjeller i enhetspinneform påvirke ulike vekstforhold for bestemte arter. I vår studie kan P. aeruginosa danne større biomasse på dype brønnpinner på grunn av deres større overflateareal og lufting, da denne arten er en obligatorisk aerobe i motsetning til E. coli, som er en fakultetsanaerobe. Til dags dato har vi ikke identifisert noen publiserte studier som direkte har sammenlignet E. coli og P. aeruginosa biofilmdannelse sammen på både polypropylen27,28,29 og polystyren30,31 materialer. Imidlertid har rapporter om robust E. coli og P. aeruginosa biofilmdannelse blitt notert i uavhengige studier som undersøker enten polypropylen eller polystyrenmaterialer. Når det gjelder Pseudomonader, kan mange Pseudomonas spp. bruke plast som polypropylen som potensielle karbonkilder32. Derfor er tilgjengeligheten av denne polypropylen dype brønnbiofilmenheten et nyttig fremskritt i statiske biofilmstudier. Polypropylen er kjemisk mer holdbar enn polystyren og er et klinisk relevant materiale, da det ofte brukes i medisinske implantater, suturer og masker for brokk eller bekkenoperasjoner33,34.
Selv om biofilmbiomasse ble dannet av begge enhetene, hadde den dype brønnenheten litt høyere variasjon i biomasse basert på CV-fargingsmetoden og OD600nm biofilmutryddelse MBEC-verdier for blekemiddel og BZK. Dette kan forklares med 3 hovedfaktorer: 1) Dyp brønninnretninger har større pluggoverflateområde enn standardinnretninger som ble vinklet sammenlignet med standard enhetspinner. 2) Begge de testede artene kan ha forskjellige evner til å holde seg til polypropylen- og polystyrenmaterialer fra hver enhet. 3) Volumene av vekstmedier som brukes i hver enhet (750 μL dyp brønn, 200 μL standard) og avstanden mellom den innsatte pinnen til brønnsideveggene varierer. Disse problemene er ikke et problem hvis bare en type enhet brukes til alle biofilmeksperimenter, men hvis begge enhetene er valgt, bør sammenligningene vi utførte her, utføres for å identifisere forskjeller36,37. På grunn av forskjellene i plastmateriale som brukes i hver enhet, bør CV-farget biofilmbiomasse og MBEC-verdier ikke sammenlignes direkte mellom forskjellige enheter. Men hvis metoder og eksperimenter utføres på samme enhet (dyp brønn eller standard), er resultatene oppnådd for arter og antimikrobielle midler testet sammenlignbare.
Denne protokollen viser at selvmonterte PCR-plateenheter med dyp brønn er større volumbiofilmenhet for måling av biofilmdannelse og utryddelse som også er kostnadseffektiv. Fra et kostnadsperspektiv varierer standard biofilmenheter med en 96 godt festet lokk detaljhandel til $ 29-36 amerikanske dollar (USD) per enhet (Materialfortegnelser). Polystyren standard biofilm enheter er ikke autoklaverbare og er mindre tolerante for løsemidler / syrer på grunn av sine plast kjemiske egenskaper. De selvmonterte polypropylen dype brønnplatene som er beskrevet her, utstyrt med en separat halvskjørt 96 brønn PCR-plate (Materialbord) koster totalt $ 14 USD per montert enhet, som er halvparten av standard biofilmenhetskostnad. Det skal bemerkes at prisene kan variere avhengig av region, distributør og tilgjengelighet, og våre kostnader etter institusjonelle rabatter fungerte til $ 9 USD / dyp brønnenhet. Disse selvmonterte pcR-plateenhetene med dyp brønn har den ekstra fordelen av å være autoklaverbare for sterilisering og tilbyr 2-4 ganger mer biofilmbiomasse enn standardenheter.
Til slutt viser denne protokollen og de representative funnene fra biofilmvekstsammenligninger av de dype brønn- og standard biofilmenhetene at begge enhetene er i stand til å dyrke bakterielle biofilmer, men dype brønnenheter danner 2-4 ganger mer biofilm. Biofilmenheten med dyp brønn tilbyr et levedyktig og rimelig alternativ for større biofilmdannelseseksperimenter med høy gjennomstrømning, for eksempel screeningstudier av legemiddelfølsomhet. Denne teknikken kan generere biofilmer som er nyttige for nedstrøms ‘-omics’ ekstraksjoner (proteomiske, metabolomiske, transkripsjonsemiske) eller eksperimentelle analyser (enzymatiske, fluorescerende) som kan kreve større mengder biofilmmaterialer for analyser. Biofilmenheten med dyp brønn anbefales for laboratorier som ønsker å studere biofilmer i en 96-brønns analyse med høy gjennomstrømning ved hjelp av rimeligere, større volum, kjemisk holdbare plastmaterialer som er klinisk relevante.
The authors have nothing to disclose.
Støtten til dette arbeidet ble gitt ved driftstilskudd til DCB fra Natural Science and Engineering Research Council of Canada Discovery Grant (RGPIN- 2016-05891) og til MRM og GRG fra regjeringen i Canadian Genomics Research and Development Initiative Grant (GRDI) program (GRDI7 2254557).
10 mL serological pipets, individ wrap paper/plastic (200/CS) | Fisher Scientific | 13-678-11F | disposable serological pipettes for aseptic media/ culture transfer |
2 mL serological pipets, individ wrap paper/plastic, 500/CS | Fisher Scientific | 13-678-11C | disposable serological pipettes for aseptic media/ culture transfer |
Axygen Aerosol Filter Tips, Sterile, 5 racks/ PK, 1000 tips/rack | Fisher Scientific | 14-222-766 | sterile pipettor tips for media aliquoting |
Axygen deep well storage microplates, round wells, 1.1 mL cap, 5/PK, P-DW-11-C | Fisher Scientific | P-DW-11-C | microplate for 96 well deepwell device biofilm cultivation |
Axygen Filter tips, 350 µL tips racked, 96/rack, 10 racks, low retention barrier tips | Fisher Scientific | TF-350-L-R-S | sterile pipettor tips for media aliquoting |
Basin/reservoir natural PS 50 mL, Sterile, 5/bag, 40 bags, CS200 | Avantor/ VWR | 89094-676 | sterile basins/ reservoirs for microplate preparation |
BD Difco Dehydrated Culture Media: Granulated Agar, 500 g | Fisher Scientific | DF0145-17-0 | materials for LB agar preparation |
Biotek Synergy Neo2 multimode plate reader | Biotek | NEO2MB | microplate UV/Vis region plate reader |
Branson M3800 Ultrasonic Bath, 117 V | Avantor/ VWR | CPX-952-316R | sonicating water bath |
crystal violet (CV), ACS grade, 100 g | Fisher Scientific | C581-100 | biofilm biomass stain |
Dimethyl sulfoxide (DMSO), 1 L, ACS grade 99.9%, poly bottle, BDH | Avantor/ VWR | CABDH1115-1LP | media components for cryopreservation |
Easypet 3, pipet controller | Avantor/ VWR | CA11027-980 | serological pipettor for aseptic media/ culture transfer |
Eppendorf Research Plus 8 multi-channel pipettor , 10-100 µL | Avantor/ VWR | CA89125-338 | multichannel pipettes for aseptic media/ culture transfer |
Eppendorf Research Plus 8 multi-channel pipettor , 30-300 µL | Avantor/ VWR | CA89125-340 | multichannel pipettes for aseptic media/ culture transfer |
Glacial acetic acid, CAS 64-19-7, 2.5L, ACS grade | Fisher Scientific | A38-212 | CV destain |
Glass test tubes, 150 mm x 18 mm, 72/Pack, PYREX | Fisher Scientific | 14957H/ 9820-18 | materials for cell culturing |
Glycerol, 4 L glass bottle ACS | Fisher Scientific | BP229-4 | media components for cryopreservation |
L-Cysteine, 98%, 250 g | Avantor/ VWR | 97061-204 | universal neutralizing solution |
L-glutathione reduced, 98%, 25 g | Fisher Scientific | AAJ6216614 | universal neutralizing solution |
L-Hisitidine, 98%, 100 g | Avantor/ VWR | CA97062-598 | universal neutralizing solution |
MBEC Assay Inoculator with 96 well tray, 100/CS | Innovotech | 19112 | material for 96 well MBEC device biofilm cultivation |
McFarland Standard, 0.5 EA | Fisher Scientific | R20410 | cell culture standardization |
McFarland Standard, 1.0 EA | Fisher Scientific | R20411 | cell culture standardization |
NUNC 96-well microtiter plates, w/lid, 50/CS | Fisher Scientific | 167008 | microplate for 96 well MBEC device biofilm cultivation and OD measurements |
PCR plate, semi-skirted 96 well, fast PCR, polypropylene, 25ea/PK | Sarstedt | 72.1981.202 | pegged lid for 96 well deepwell device biofilm cultivation |
Petri dish, 100 mm x 15 mm, semi-TK CS/500 | Fisher Scientific | FB0875712 | materials for LB agar preparation |
Potassium phosphate dibasic, ACS 500 g | Fisher Scientific | P288-500 | PBS component/ buffer |
Sodium chloride, ACS grade, 3 kg | Fisher Scientific | S2713 | media components for LB broth and PBS |
sodium phosphate monobasic, 1 kg | Fisher Scientific | S369-1 | PBS component/ buffer |
Syringe filters, Sterile, PES 0.45 um, 25 mm, PK50 | Avantor/ VWR | 28145-505 | non-autoclavable solution sterilization |
Tin foil, heavy duty, 50 feet | Grocery store | — | materials for deepwell device sterilization |
Tryptone (peptone from casein), 2.2 kg/EA | Fisher Scientific | B11922 | media components for LB broth |
Tween-20, 100 mL | Fisher Scientific | BP337-100 | recovery media solution |
Ultra-deepwell, 2.5 mL deep well plates (square well), with lid, polypropylene, 10/CS | Avantor/ VWR | 37001-520 | materials for biofilm dilution preparation |
Yeast Extract, Fisher Bioreagents, 500 g | Fisher Scientific | BP1422-500 | media components for LB broth |