Detta protokoll presenterar metodik för att utföra biofilm tillväxt och biomassa mätningar med hjälp av självmonterade djup brunn PCR-plattor enheter för hög genomströmning 96-väl peggade lock statisk biofilm screening.
Bakteriella biofilmer är svåra att utrota från ytor med konventionella antimikrobiella ingrepp. Mikroplatemetoder med hög genomströmning 96-brunn används ofta för att odla bakteriella biofilmer för snabb testning av antimikrobiell känslighet för att beräkna minimala biofilm utrotningskoncentration (MBEC) värden. Standardbiofilmsanordningar består av polystyrenlock monterade på 96-brunns mikroplattor och är idealiska för mätning av biofilmbiomassa och MBEC-värden, men dessa enheter begränsas av tillgänglig pegyta för ackumulering och kostnad för biomassa. Här beskriver vi ett protokoll för att använda självmonterad polypropylen 96-brunns djup brunn PCR-platta peggade lock enhet för att växa Escherichia coli BW25113 och Pseudomonas aeruginosa PAO1 biofilmer. En jämförelse av 24-timmars biofilmer som bildas på standard- och djupbrunnsenheter av varje art som använder kristallviolett biomassafärgning och MBEC-bestämningsanalyser beskrivs. Den större ytan av djup brunnsenheter ökade förväntat den totala biofilmbildningen av båda arterna 2-4-faldig. P. aeruginosa bildade betydligt större biomassa/mm2 på djupa brunnspinnar jämfört med standardanordningen. E. coli hade större biomassa/mm2 på vanliga polystyrenanordningar jämfört med djupbrunnsanordningen. Biofilm utrotning analyser med desinfektionsmedel såsom natriumhypoklorit (blekmedel) eller bensalkoniumklorid (BZK) visade att båda föreningarna kunde eliminera E. coli och P. aeruginosa biofilmer från båda enheterna men vid olika MBEC-värden. BZK biofilm utrotning resulterade i variabel E. coli MBEC värden mellan enheter, men blekmedel visat reproducerbara MBEC värden för både arter och enheter. Denna studie ger en hög genomströmning djup brunn metod för att odla större mängder biofilmer på polypropylen enheter för nedströms studier kräver högre mängder statisk biofilm.
Pseudomonas aeruginosa och Escherichia coli är gramnegativa proteobakterier som ofta studeras för deras förmåga att bilda sessila, ytanslutna cellsamhällen som kallas biofilms1. Båda arterna, när de växer som biofilmer, kan utsöndra en matris av extracellulära polymera ämnen (EPS) som främst består av olika polysackarider och proteiner, som också kan inkludera extracellulärt DNA och/eller lipider, vilket ger extra cellulärt skydd och förbättrad överlevnad i hårda, näringsbegränsade miljöer2,3. Biofilmsfysiologi och bildning av båda arterna är av klinisk relevans, eftersom de representerar de fem vanligaste isolerade antimikrobiella resistenta patogenerna från sjukhuspatientblod, urinvägs- och lunginfektioner i Kanada4,5. Det är också viktigt att notera att biofilmer beräknas utgöra nästan 80% av alla kroniska och återkommande infektioner orsakade av dessa bakteriearter6. På grund av de utsöndrade EPS-ämnena och långsammare metabolisk aktivitet7,8 blir etablerade biofilmer svårare att utrota när de bildas på ytor som implanterade medicintekniska produkter, ärrvävnader och i lungorna hos cystisk fibrospatienter9,10, vilket ökar deras antimikrobiella resistens.
De motsträviga tillväxtegenskaperna hos bakteriella biofilmer gör dem ofta mer resistenta mot antimikrobiell hämning och/eller utrotning2,9. In vitro-metoder för att studera antimikrobiell utrotning av bakteriell biofilm är därför av största vikt för att välja ut effektiva föreningar för att utrota infektioner när de bildas på medicinsk plast (t.ex. in-dwelling katetrar) och medicinska implantat. De snabbaste in vitro biofilm antimikrobiella utrotningsmetoderna undersöker biofilmstillväxt som en “statisk” biofilmskultur snarare än “kontinuerliga” kulturer, där statisk bakterietillväxt övervakas i tidiga till sena stadier av biofilmbildning under en kort (24-96 h) tidsram i samma tillväxtmedium. Kontinuerliga biofilmsmetoder är besvärliga för snabb analys eftersom de kräver biofilmstillväxt bedömd över längre tidsramar som odlas i kammare som möjliggör kontinuerligt flöde och ersättning av tillväxtmedier med färre replikat11. På grund av den tid och ansträngning som krävs för att upprätthålla och upprätta kontinuerliga biofilmer är statiska in vitro-biofilmer de mest populära, eftersom de lätt anpassas för höggenomströmningstestning av antimikrobiell känslighet i plast 96-brunnsmikrotiterplattor snarare än utarbetade flödeskammaresystem som begränsar antalet kulturer som testas samtidigt 12 13 . De enklaste statiska “in-well” biofilm mikroplattan analyser använder standard polystyren eller vinyl (300 μL kapacitet) microtiter plattor för att mäta biofilm bildas på sidorna och bottnarna av varje brunn och ofta som ringar på luften till flytande yta gränssnitt. Bakteriell biofilmsbildning i brunnen mäts genom att färga den deponerade biomassan som klibbats vid brunnarna efter att tillväxtmediumvätskan har avlägsnats och biofilmerna tvättats12,13. Dessa analyser är ekonomiskt populära men har ofta reproducerbarhetsproblem på grund av deras inneboende design, eftersom deponerade biofilmer är benägna att skadas eller förloras under sköljning för cellåtervinning och biomassafärgningsförfaranden11,14.
För att minska biofilmförlusterna har vanliga kommersiella biofilmsanordningar förbättrat biofilmsmikroplåtsdesignen i brunnen genom att lägga till ett instickbart 96-väletnat polystyrenlock till standard 96-plåtdesignen, kallad “standardbiofilmsanordningen” häri. Tillsatsen av ett knutet lock utökar den tillgängliga ytan i varje mikroplattabrunn, vilket möjliggör förbättrad yt vidhäftning och biofilmsbiomassabildning15,16. Standard biofilm peggade lock enheter möjliggör större biofilm återvinning, borttagning och sköljning för efterföljande antimikrobiell biofilm mottaglighet och utrotning testning när peggade lock sätts in i nya microtiter plattor som innehåller läkemedels- eller tillväxttillstånd utmaningar. I likhet med mikroplattatekniken för biofilm i brunn möjliggör de återvunna materialen från de borttagna och tvättade peggade lockanordningarna cellöverlevnadstestning och biofilmsfärgning av biomassa, vanligtvis med kristallviolett (CV) färgformuleringar 17,18,19. Standardbiofilmenheter är också optimala för screening av biofilm antimikrobiella känsligheter. Dessa analyser övervakar biofilmtillväxthämning på två sätt: 1) När antimikrobiella medel tillsätts till celler i början av tillväxten kan det bestämma det minsta biofilmhämningskoncentrationen (MBIC). 2) När etablerade biofilmer bildas på pinnarna efter 24 timmar och sedan exponeras för antimikrobiella medel, kan det bestämma det lägsta biofilmsutrotningskoncentrationen (MBEC) till 17,20. I likhet med mikroplatta för biofilm i brunnen har standardbiofilmenheter vissa anmärkningsvärda begränsningar, till exempel deras höga kostnad per enhet, de är icke-autoklaverbara och mindre hållbara för kemiska lösningsmedel på grund av det polystyrenplattamaterial som används. Standardbiofilmenheter har också ett lågt förhållande mellan yta och pinnar, vilket begränsar de maximala arbetsvolymerna i varje brunn till 200 μL. Dessa faktorer kan göra standardbiofilmenheter mer utmanande att använda för studier som kräver större mängder biofilm i ett höggenomströmningsformat.
Här beskriver vi en statisk biofilm peggat lock 96-well metod utvecklad i vårt labb med hjälp av kommersiellt tillgängliga polypropylen halvkjolade 0,5 mL 96-brunn PCR plattor monterade på 96-väl microtiter plattor med brunnar djupare än standardplattan (Tabell av material). Dessa monterade enheter har en maximal arbetsvolym på 750 μL när de används för odling av biofilm (häri känd som “deep well biofilm device”). Fördelarna med att använda dessa djupbrunnbiofilmenheter är deras lägre kostnad jämfört med vanliga biofilmenheter, de kan steriliseras genom autoklavering, och de ökar ytan för biofilmbildning på den större externa PCR-plattan “rör / pinnar”. Med denna metod visar vi applikationerna av dessa enheter för odling och karakterisera biofilm biomassa bildas av Escherichia coli BW25113 och P. aeruginosa PAO1. Metoder för att fastställa MBEC-värden med hjälp av biofilmsutrotningsanalyser beskrivs med hjälp av de kvartära ammoniumföreningens desinfektionsmedel bensalkoniumklorid (BZK) och antimikrobiella medel för natriumhypoklorit (blekmedel). Antiseptiska/desinfektionsmedel BZK valdes eftersom denna förening ofta används för att hämma biofilmer från förorenade ytor, men det är enligt uppgift mindre effektivt för att utrota väletablerade biofilmer21. Blekmedel är en mycket effektiv kemikalie för utrotning av etablerade biofilmer och är en stöttepelare i kemisk desinfektion 22. Båda desinfektionsmedlet ger en användbar jämförelse av MBEC-värden för varje biofilmsenhet21. Ett protokoll för denna biofilm enhet bedömning med hjälp av CV färgning och biofilm utrotning analyser för MBEC bestämning sammanfattas i denna artikel. Ett protokollflödesschema har inkluderats för en förenklad översikt över arbetsflödet för dessa metoder (bild 1).
Denna studie beskriver metoder för att använda en större volym 96-väl hög genomströmning statisk biofilm tillväxt enhet som omfattar en polypropylen djup brunn mikroplatta utrustad med en halvkjol pcr-platta lock för biofilm bildandet (djup brunn biofilm enhet; Tabell över material). Vi jämförde biofilmer som genereras med denna enhet med en kommersiellt tillgänglig biofilmenhet av polystyrenstandard (Table of Materials). Metoden för djup brunnsanordning använder samma metodologiska steg och lösningar som standardenheten17 vid justerade volymer modifierade för djupbrunnsenheterna, vilket gör denna enhet idealisk för storskalig biofilmbildning och experimentell analys. Tillväxten av E. coli BW25113 och P. aeruginosa PAO1, två gramnegativa arter som är kända för att bilda biofilmer, undersöktes för deras biomassabildning och desinfektionsmedel (BZK/blekmedel) MBEC-värden som används på båda enheterna. Jämförelse av CV-färgad biomassa som bildas på pinnar från varje enhet visade att både E. coli och P. aeruginosa bildade biofilmer med högre biomassa på biofilmanordningen för djup brunn jämfört med standardanordningen (figur 3A-B). Ökad biofilmbiomassa återspeglade den större ytan av djupa brunnspinnar jämfört med standardenhetens pegyta. När vi räknade med skillnader i pegytor (mm2) med båda enheterna noterades skillnader i biomassabildning, där E. coli bildade betydligt större CV-biomassa per mm2 på polystyrenstandardenhetspinnar än med djupbrunnanordningens PCR-rörpinnar (tabell 1). P. aeruginosa bildade större CV-färgad biomassa/ peg mm2 jämfört med standardanordningar (tabell 1). Dessa fynd kan belysa artspecifika skillnader i biofilm biomassa bildas på de olika enheterna.
Det bör noteras att blekmedelsutrotning av biofilmer av E. coli och P. aeruginosa på djup brunnsanordningar inträffade vid 2-4-faldiga lägre koncentrationer än standardanordningen (figur 4A-B, tabell 1). De skillnader i blekmedel MBEC-värden som identifieras från varje anordning påverkas sannolikt av skillnader i enhetens pegformer (djupa brunnspinnar är avsmalnande rör och standardpinnar är cylindriska), skillnader i plastsammansättning (polypropylen kontra polystyren) och volymskillnader (750 μL jämfört med 200 μL). P. aeruginosa hade till exempel större CV M biomassa/ mm2 på djup brunnsanordningar jämfört med standardanordningar, men E. coli hade mindre biomassa på djupbrunnspinnar (figur 3). Detta tyder på att desinficeringskoncentrationer som krävs för utrotning av biofilm kan påverkas av den biomassa som bildas av varje art samt den tillgängliga ytan. Dessutom kan skillnader i enhetens pegform påverka olika tillväxtförhållanden för vissa arter. I vår studie kan P. aeruginosa bilda större biomassa på djupa brunnspinnar på grund av deras större yta och luftning, eftersom denna art är en obligatorisk aerobe i motsats till E. coli, som är en fakultetsageni. Hittills har vi inte identifierat några publicerade studier som direkt har jämfört E. coli och P. aeruginosa biofilmbildning tillsammans på både polypropylen27,28,29 och polystyren30,31 material. Rapporter om robust E. coli och P. aeruginosa biofilm bildandet har dock noterats i oberoende studier som undersöker antingen polypropylen eller polystyren material. När det gäller Pseudomonads kan många Pseudomonas spp. använda plast som polypropylen som potentiella kolkällor32. Därför är tillgängligheten av denna polypropylen djup brunn biofilm enhet ett användbart framsteg i statiska biofilm studier. Polypropylen är kemiskt mer hållbart än polystyren och är ett kliniskt relevant material, eftersom det ofta används i medicinska implantat, suturer och maskor för bråck- eller bäckenoperationer33,34.
Även om biofilm biomassa bildades av båda enheterna, hade djup brunnsanordningen något högre variabilitet i biomassa baserat på CV färgningsmetod och OD600nm biofilm utrotning MBEC värden för blekmedel och BZK. Detta kan förklaras av 3 huvudfaktorer: 1) Djupbrunnsenheter har större pegyta än standardenheter som vinklades jämfört med vanliga enhetspinnar. 2) Båda de testade arterna kan ha olika förmåga att hålla fast vid polypropylen- och polystyrenmaterial i varje anordning. 3) Volymerna av tillväxtmedier som används i varje anordning (750 μL djup brunn, 200 μL-standard) och avståndet mellan den insatta pinnen till brunnens sidoväggar skiljer sig åt. Dessa problem är inte ett problem om endast en typ av enhet används för alla biofilmsexperiment, men om båda enheterna väljs bör de jämförelser vi utförde häri utföras för att identifiera skillnader36,37. På grund av skillnaderna i plastmaterial som används i varje anordning bör de CV-färgade biofilmsbiomassan och MBEC-värdena inte jämföras direkt mellan olika enheter. Om metoder och experiment utförs på samma anordning (djup brunn eller standard) är dock de resultat som erhållits för testade arter och antimikrobiella medel jämförbara.
Detta protokoll visar att självmonterade pcr-plattor med djupa brunnar är biofilmsanordningar med större volym för mätning av biofilmsbildning och utrotning som också är kostnadseffektivt. Ur ett kostnadsperspektiv varierar standardbiofilmenheter med 96 väl knutna lock detaljhandel till $ 29-36 US-dollar (USD) per enhet (Table of Materials). Polystyrenstandardbiofilmsapparater är inte autoklaverbara och är mindre toleranta mot lösningsmedel/syror på grund av dess kemiska plastegenskaper. De självmonterade polypropylendjupa brunnsplattorna som beskrivs häri, utrustade med en separat halvkjolad 96-brunn PCR-platta (Table of Materials) kostar totalt $ 14 USD per monterad enhet, vilket är hälften av standardkostnaden för biofilmsenheten. Det bör noteras att priserna kan variera beroende på region, distributör och tillgänglighet, och våra kostnader efter institutionella rabatter utarbetades till $ 9 USD / djup brunnsenhet. Dessa självmonterade djupbrunn polypropylen PCR-plattor har den extra fördelen att de är autoklaverbara för sterilisering och erbjuder 2-4 gånger mer biofilmbiomassa än standardenheter.
Sammanfattningsvis visar detta protokoll och de representativa resultaten från biofilmstillväxtjämförelser av djup brunnen och standardbiofilmenheter att båda enheterna kan odla bakteriell biofilm, men djup brunnsenheter bildar 2-4 gånger mer biofilm. Deep well biofilm-enheten erbjuder ett livskraftigt och prisvärt alternativ för större volym biofilmsbildningsexperiment med hög genomströmning, såsom screeningstudier av läkemedelskänslighet. Denna teknik kan generera biofilmer som är användbara för nedströms “-omics” extraktioner (proteomiska, metabolomiska, transkriptomiska) eller experimentella analyser (enzymatiska, fluorescerande) som kan kräva större mängder biofilmsmaterial för analyser. Djupbrunnbiofilmsanordningen rekommenderas för laboratorier som vill studera biofilmer i en 96-well-analys med hög genomströmning med hjälp av billigare, större volym, kemiskt hållbara plastmaterial som är kliniskt relevanta.
The authors have nothing to disclose.
Finansieringen av detta arbete tillhandahölls genom driftsbidrag till DCB från Natural Science and Engineering Research Council of Canada Discovery Grant (RGPIN- 2016-05891) och till MRM och GRG från regeringen för Canadian Genomics Research and Development Initiative Grant (GRDI) program (GRDI7 2254557).
10 mL serological pipets, individ wrap paper/plastic (200/CS) | Fisher Scientific | 13-678-11F | disposable serological pipettes for aseptic media/ culture transfer |
2 mL serological pipets, individ wrap paper/plastic, 500/CS | Fisher Scientific | 13-678-11C | disposable serological pipettes for aseptic media/ culture transfer |
Axygen Aerosol Filter Tips, Sterile, 5 racks/ PK, 1000 tips/rack | Fisher Scientific | 14-222-766 | sterile pipettor tips for media aliquoting |
Axygen deep well storage microplates, round wells, 1.1 mL cap, 5/PK, P-DW-11-C | Fisher Scientific | P-DW-11-C | microplate for 96 well deepwell device biofilm cultivation |
Axygen Filter tips, 350 µL tips racked, 96/rack, 10 racks, low retention barrier tips | Fisher Scientific | TF-350-L-R-S | sterile pipettor tips for media aliquoting |
Basin/reservoir natural PS 50 mL, Sterile, 5/bag, 40 bags, CS200 | Avantor/ VWR | 89094-676 | sterile basins/ reservoirs for microplate preparation |
BD Difco Dehydrated Culture Media: Granulated Agar, 500 g | Fisher Scientific | DF0145-17-0 | materials for LB agar preparation |
Biotek Synergy Neo2 multimode plate reader | Biotek | NEO2MB | microplate UV/Vis region plate reader |
Branson M3800 Ultrasonic Bath, 117 V | Avantor/ VWR | CPX-952-316R | sonicating water bath |
crystal violet (CV), ACS grade, 100 g | Fisher Scientific | C581-100 | biofilm biomass stain |
Dimethyl sulfoxide (DMSO), 1 L, ACS grade 99.9%, poly bottle, BDH | Avantor/ VWR | CABDH1115-1LP | media components for cryopreservation |
Easypet 3, pipet controller | Avantor/ VWR | CA11027-980 | serological pipettor for aseptic media/ culture transfer |
Eppendorf Research Plus 8 multi-channel pipettor , 10-100 µL | Avantor/ VWR | CA89125-338 | multichannel pipettes for aseptic media/ culture transfer |
Eppendorf Research Plus 8 multi-channel pipettor , 30-300 µL | Avantor/ VWR | CA89125-340 | multichannel pipettes for aseptic media/ culture transfer |
Glacial acetic acid, CAS 64-19-7, 2.5L, ACS grade | Fisher Scientific | A38-212 | CV destain |
Glass test tubes, 150 mm x 18 mm, 72/Pack, PYREX | Fisher Scientific | 14957H/ 9820-18 | materials for cell culturing |
Glycerol, 4 L glass bottle ACS | Fisher Scientific | BP229-4 | media components for cryopreservation |
L-Cysteine, 98%, 250 g | Avantor/ VWR | 97061-204 | universal neutralizing solution |
L-glutathione reduced, 98%, 25 g | Fisher Scientific | AAJ6216614 | universal neutralizing solution |
L-Hisitidine, 98%, 100 g | Avantor/ VWR | CA97062-598 | universal neutralizing solution |
MBEC Assay Inoculator with 96 well tray, 100/CS | Innovotech | 19112 | material for 96 well MBEC device biofilm cultivation |
McFarland Standard, 0.5 EA | Fisher Scientific | R20410 | cell culture standardization |
McFarland Standard, 1.0 EA | Fisher Scientific | R20411 | cell culture standardization |
NUNC 96-well microtiter plates, w/lid, 50/CS | Fisher Scientific | 167008 | microplate for 96 well MBEC device biofilm cultivation and OD measurements |
PCR plate, semi-skirted 96 well, fast PCR, polypropylene, 25ea/PK | Sarstedt | 72.1981.202 | pegged lid for 96 well deepwell device biofilm cultivation |
Petri dish, 100 mm x 15 mm, semi-TK CS/500 | Fisher Scientific | FB0875712 | materials for LB agar preparation |
Potassium phosphate dibasic, ACS 500 g | Fisher Scientific | P288-500 | PBS component/ buffer |
Sodium chloride, ACS grade, 3 kg | Fisher Scientific | S2713 | media components for LB broth and PBS |
sodium phosphate monobasic, 1 kg | Fisher Scientific | S369-1 | PBS component/ buffer |
Syringe filters, Sterile, PES 0.45 um, 25 mm, PK50 | Avantor/ VWR | 28145-505 | non-autoclavable solution sterilization |
Tin foil, heavy duty, 50 feet | Grocery store | — | materials for deepwell device sterilization |
Tryptone (peptone from casein), 2.2 kg/EA | Fisher Scientific | B11922 | media components for LB broth |
Tween-20, 100 mL | Fisher Scientific | BP337-100 | recovery media solution |
Ultra-deepwell, 2.5 mL deep well plates (square well), with lid, polypropylene, 10/CS | Avantor/ VWR | 37001-520 | materials for biofilm dilution preparation |
Yeast Extract, Fisher Bioreagents, 500 g | Fisher Scientific | BP1422-500 | media components for LB broth |