Den nuværende protokol beskriver intratibia osteosarkomcelleinjektion for at generere musemodeller med ortotopisk osteosarkom og lungemetastaselæsioner.
Osteosarkom er den mest almindelige primære knoglekræft hos børn og unge, med lunger som det mest almindelige metastatiske sted. Den femårige overlevelsesrate for osteosarkompatienter med lungemetastase er mindre end 30%. Derfor er brugen af musemodeller, der efterligner osteosarkomudviklingen hos mennesker, af stor betydning for forståelsen af den grundlæggende mekanisme for osteosarkom carcinogenese og lungemetastase til at udvikle nye terapier. Her rapporteres detaljerede procedurer for at generere de primære osteosarkom- og lungemetastasemusemodeller via intratibia injektion af osteosarkomceller. Kombineret med bioluminescens eller røntgen levende billeddannelsessystem bruges disse levende musemodeller til at overvåge og kvantificere osteosarkomvækst og metastase. For at etablere denne model blev en kældermembranmatrix indeholdende osteosarkomceller indlæst i en mikrovolumensprøjte og injiceret i en skinneben af hver athymisk mus efter at være blevet bedøvet. Musene blev ofret, da det primære osteosarkom nåede størrelsesbegrænsningen i den IACUC-godkendte protokol. Benene med osteosarkom og lungerne med metastaselæsioner blev adskilt. Disse modeller er kendetegnet ved en kort inkubationsperiode, hurtig vækst, alvorlige læsioner og følsomhed ved overvågning af udviklingen af primære og lungemetasstatiske læsioner. Derfor er disse ideelle modeller til at udforske funktionerne og mekanismerne for specifikke faktorer i osteosarkom carcinogenese og lungemetastase, tumormikromiljøet og evaluering af den terapeutiske effekt in vivo.
Osteosarkom er den mest almindelige primære knoglekræft hos børn og unge 1,2, som hovedsageligt infiltrerer det omgivende væv og endda metastaserer til lungerne, når patienterne diagnosticeres. Lungemetastase er den største udfordring for osteosarkombehandling, og den femårige overlevelsesrate for osteosarkompatienter med lungemetastase forbliver så lav som 20% -30%3,4,5. Imidlertid er den femårige overlevelsesrate for primær osteosarkom blevet øget til ca. 70% siden 1970’erne på grund af indførelsen af kemoterapi6. Derfor er det presserende nødvendigt at forstå den grundlæggende mekanisme for osteosarkom carcinogenese og lungemetastase for at udvikle nye terapier. Anvendelsen af musemodeller, der bedst efterligner osteosarkomprogressionen hos mennesker, er af stor betydning7.
Osteosarkom dyremodellerne genereres ved spontan, induceret genteknologi, transplantation og andre teknikker. Den spontane osteosarkommodel anvendes sjældent på grund af den lange tumordannelsestid, inkonsekvent tumorforekomst, lav sygelighed og dårlig stabilitet 8,9. Selvom den inducerede osteosarkommodel er mere tilgængelig at opnå end det spontane osteosarkom, er anvendelsen af den inducerede osteosarkommodel begrænset, fordi den inducerende faktor vil påvirke mikro miljøet, patogenesen og patologiske egenskaber ved osteosarkom10. Transgene modeller hjælper med at forstå patogenesen af kræftformer, da de bedre kan simulere de menneskelige fysiologiske og patologiske miljøer; De transgene dyremodeller har imidlertid også deres begrænsninger på grund af vanskeligheden, de langsigtede og høje omkostninger ved transgen modifikation. Selv i de mest accepterede transgene dyremodeller genereret af p53 og Rb genmodifikation forekom kun 13,6% af sarkom i de fire lemmer knogler11,12.
Transplantation er en af de mest almindeligt anvendte primære og fjerne metastatiske kræftmodelproducerende metoder i de senere år på grund af dens enkle manøvrering, stabile tumordannelseshastighed og bedre homogenitet13. Transplantation omfatter heterotopisk transplantation og ortotopisk transplantation i henhold til transplantationsstederne. Ved osteosarkom heterotopisk transplantation injiceres osteosarkomcellerne uden for dyrenes primære osteosarkomsteder (knogle), almindeligvis under huden, subkutant14. Selvom den heterotopiske transplantation er ligetil uden behov for at udføre kirurgi hos dyr, repræsenterer de steder, hvor osteosarkomcellerne injiceres, ikke det faktiske humane osteosarkommikromiljø. Osteosarkom ortotopisk transplantation er, når osteosarkomcellerne injiceres i dyrs knogler, såsom tibia15,16. Sammenlignet med de heterotopiske transplantater er ortotopiske osteosarkomtransplantater kendetegnet ved en kort inkubationsperiode, hurtig vækst og stærk erosiv karakter; derfor er de ideelle dyremodeller til osteosarkomrelaterede undersøgelser17.
De mest anvendte dyr er mus, hunde og zebrafisk18,19. Den spontane model af osteosarkom anvendes normalt i hjørnetænder, fordi osteosarkom er en af de mest almindelige tumorer hos hjørnetænder. Anvendelsen af denne model er imidlertid begrænset på grund af den lange tumordannelsestid, den lave tumorgenesehastighed, dårlig homogenitet og stabilitet. Zebrafisk bruges ofte til at konstruere transgene eller knockout tumormodeller på grund af deres hurtige reproduktion20. Men zebrafiskgener er forskellige fra menneskelige gener, så deres anvendelser er begrænsede.
Dette arbejde beskriver de detaljerede procedurer, forholdsregler og repræsentative billeder til fremstilling af det primære osteosarkom i skinnebenet med lungemetastase via intratibia injektion af osteosarkomceller i athymiske mus. Denne metode blev anvendt til at skabe det primære osteosarkom i museskinneben til terapeutisk effektevaluering, som viste en høj reproducerbarhed 21,22.
Ortotopisk injektion af osteosarkomceller er en ideel model til at studere funktionen og mekanismen for specifikke faktorer i osteosarkom carcinogenese og udvikling for at evaluere den terapeutiske effekt. For at undgå forskelle i tumorvækst injiceres de fleste aktive osteosarkomceller ved 80% -90% sammenflydende med det samme antal omhyggeligt i skinnebenet på hver mus, og celleprøvepsiniseringstiden kontrolleres strengt uden at påvirke cellens levedygtighed. Da celleklumper påvirker celletællingen, hvilket føre…
The authors have nothing to disclose.
Denne undersøgelse blev støttet af tilskud fra (1) National Key R&D Program of China (2018YFC1704300 og 2020YFE0201600), (2) National Nature Science Foundation (81973877 og 82174408).
Automatic cell counter | Shanghai Simo Biological Technology Co., Ltd | IC1000 | Counting cells |
Anesthesia machine | Shenzhen RWD Life Technology Co., Ltd | R500IP | The Equipment of Anesthesia mice |
BALB/c athymic mice | Shanghai SLAC Laboratory Animal Co, Ltd. | / | animal |
Basement Membrane Matrix | Shanghai Uning Bioscience Technology Co., Ltd | 356234, BD, Matrigel | re-suspende cells |
Bioluminescence imaging system | Shanghai Baitai Technology Co., Ltd | Vieworks | tracking the tumor growth and pulmonary metastasis, if the injection cell is labeled by luciferase |
Centrifuge tube (15 mL) | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | 430790, Corning | Centrifuge the cells |
isoflurane | Shenzhen RWD Life Technology Co., Ltd | VETEASY | Anesthesia mice |
MEM media | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | LM-E1141 | Cell culture medium |
Micro-volume syringe | Shanghai high pigeon industry and trade Co., Ltd | 0-50 μL | Inject precise cells into the tibia |
Phosphate-buffered saline | Beyotime Biotechnology | ST447 | wash the human osteosarcoma cells |
1ml syringes | Shandong Weigao Group Medical Polymer Co., Ltd | 20200411 | drilling |
143B cell line | ATCC | CRL-8303 | osteosarcoma cell line |
Trypsin (0.25%) | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | 25200056, Gibco | trypsin treatment of cells |
Trypan blue | Beyotime Biotechnology | ST798 | Staining cells to assess activity |
vector (pLV-luciferase) | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | VL3613 | Plasmid |
Lipofectamine 2000 | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | 11668027,Thermo fisher | Plasmid transfection reagent |
X-ray imaging system | Brook (Beijing) Technology Co., Ltd | FX PRO | X-ray images were obtained to detect tumor growth |