Tvärgående fraktur i musens lårben med stabiliserande stift
Summary
Detta protokoll beskriver en metod för att utföra frakturer på vuxna möss och övervaka läkningsprocessen.
Abstract
Frakturreparation är en väsentlig funktion hos skelettet som inte kan modelleras på ett tillförlitligt sätt in vitro. En musskademodell är ett effektivt tillvägagångssätt för att testa om en gen, genprodukt eller läkemedel påverkar benreparation eftersom murina ben rekapitulerar de stadier som observerats under mänsklig frakturläkning. När en mus eller människa bryter ett ben initieras ett inflammatoriskt svar, och periosteum, en stamcellsnisch som omger själva benet, aktiveras och expanderar. Celler som bor i periosteum differentierar sedan för att bilda en vaskulariserad mjuk callus. Övergången från den mjuka callus till en hård callus sker när de rekryterade skelettstamcellerna differentierar sig till mineraliserande celler, och överbryggningen av de brutna ändarna resulterar i benföreningen. Den mineraliserade callus genomgår sedan ombyggnad för att återställa den ursprungliga formen och strukturen hos det läkta benet. Frakturläkning har studerats hos möss med hjälp av olika skademodeller. Ändå är det bästa sättet att rekapitulera hela denna biologiska process att bryta igenom tvärsnittet av ett långt ben som omfattar båda kortikorna. Detta protokoll beskriver hur en stabiliserad, tvärgående lårbensfraktur säkert kan utföras för att bedöma läkning hos vuxna möss. Ett kirurgiskt protokoll inklusive detaljerade skörde- och avbildningstekniker för att karakterisera de olika stadierna av frakturläkning tillhandahålls också.
Introduction
Frakturer, raster i kontinuiteten i benytan, förekommer i alla segment av befolkningen. De blir allvarliga hos personer som har bräckliga ben på grund av åldrande eller sjukdom, och sjukvårdskostnaderna för bräcklighetsfrakturer förväntas överstiga 25 miljarder dollar om 5 år 1,2,3,4,5. Att förstå de biologiska mekanismerna som är involverade i frakturreparation skulle vara en utgångspunkt för att utveckla nya terapier som syftar till att förbättra läkningsprocessen. Tidigare forskning har visat att vid fraktur inträffar fyra signifikanta steg som gör det möjligt för ben att läka: (1) bildning av hematom; (2) bildning av en fibrobrosk kallus; (3) mineralisering av den mjuka callusen för att bilda ben; och (4) ombyggnad av det läkta benet 6,7. Många biologiska processer aktiveras för att läka frakturen framgångsrikt. Först initieras ett akut proinflammatoriskt svar omedelbart efter en fraktur 6,7. Därefter aktiveras periosteumet och expanderar, och periosteala celler differentieras till kondrocyter för att bilda en broskkallus som växer för att fylla gapet som lämnas av de störda bensegmenten 6,7,8,9. Neurala och vaskulära celler invaderar den nybildade callusen för att ge ytterligare celler och signalmolekyler som behövs för att underlätta reparation 6,7,8,9,10. Förutom att bidra till callusbildning differentieras periosteala celler också till osteoblaster som lägger ner vävt ben i den överbryggande callusen. Slutligen omformar osteoklaster det nybildade benet för att återgå till sin ursprungliga form och lamellära struktur 7,8,9,10,11. Många grupper utvecklade musmodeller av frakturreparation. En av de tidigare och mest använda frakturmodellerna hos möss är Einhorn-metoden, där en vikt tappas på benet från en viss höjd12. Bristen på kontroll över vinkeln och kraften som appliceras för att inducera frakturen skapar mycket variation i placeringen och storleken på bendiskontinuiteten. Därefter resulterar det i variationer i det specifika frakturläkningssvaret som observerats. Andra populära tillvägagångssätt är kirurgisk ingrepp för att producera en tibial monokortikal defekt eller stressfrakturer, procedurer som inducerar relativt mildare läkningssvar10,13. Variabilitet i dessa modeller beror främst på den person som utför proceduren14.
Här möjliggör en detaljerad modell för lårbensskada för mus kontroll över pausen för att ge en reproducerbar skada och möjliggöra kvantitativ och kvalitativ bedömning av lårbensfrakturreparation. Specifikt introduceras ett fullständigt genombrott i lårbenen hos vuxna möss och stabiliserar frakturändarna för att ta hänsyn till den roll som fysisk belastning spelar i benläkning. Metoderna för att skörda vävnader och avbilda de olika stegen i läkningsprocessen med histologi och mikrodatortomografi (microCT) tillhandahålls också i detalj.
Protocol
Representative Results
Discussion
Skademodellen som beskrivs i detta protokoll omfattar alla fyra signifikanta steg som observerats under läkning av spontana frakturer, inklusive (1) proinflammatoriskt svar med bildandet av hematom, (2) rekrytering av skelettstamfäder från periosteum för att bilda den mjuka callusen, (3) mineralisering av callus genom osteoblaster och (4) ombyggnad av benet med osteoklaster.
Det kirurgiska ingreppet som beskrivs i detta manuskript är optimerat för vuxna möss som är minst 12 veckor gaml…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar Dr. Vicki Rosen för ekonomiskt stöd och vägledning med projektet. Vi vill också tacka veterinär- och IACUC-personalen vid Harvard School of Medicine för samråd om steril teknik, djurs välbefinnande och de material som används för att utveckla detta protokoll.
Materials
| 23 G x 1 TW IM (0.6 mm x 2 5mm) needle | BD precision | 305193 | Use as guide needle |
| 27 G x 1 ¼ (0.4 mm x 30 mm) | BD precision | 305136 | Use as stabilizing pin |
| 9 mm wound autoclip applier/remover/clips kit | Braintree Scientific, INC | ACS-KIT | |
| Alcian Blue 8 GX | Electron Microscopy Sciences | 10350 | |
| Ammonium hydroxide | Millipore Sigma | AX1303 | |
| Circular blade X926.7 THIN-FLEX | Abrasive technologies | CELBTFSG633 | |
| DREMEL 7700-1/15, 7.2 V Rotary Tool Kit | Dremel | 7700 1/15 | |
| Eosin Y | ThermoScientific | 7111 | |
| Fine curved dissecting forceps | VWR | 82027-406 | |
| Hematoxulin Gill 2 | Sigma-Aldrich | GHS216 | |
| Hydrochloric acid | Millipore Sigma | HX0603-4 | |
| Isoflurane | Patterson Veterinary | 07-893-1389 | |
| Microsurgical kit | VWR | 95042-540 | |
| Orange G | Sigma-Aldrich | 1625 | |
| Phloxine B | Sigma-Aldrich | P4030 | |
| Povidone-Iodine Swabs | PDI | S23125 | |
| SCANCO Medical µCT35 | Scanco | ||
| Slow-release buprenorphine | Zoopharm |
Riferimenti
- Black, D. M., Rosen, C. J. Postmenopausal osteoporosis. The New England Journal of Medicine. 374, 2096-2097 (2016).
- Curtis, E. M., Moon, R. J., Harvey, N. C., Cooper, C. The impact of fragility fracture and approaches to osteoporosis risk assessment worldwide. Bone. 104, 29-38 (2017).
- Laurent, M. R., Dedeyne, L., Dupont, J., Mellaerts, B., Dejaeger, M., Gielen, E. Age-related bone loss and sarcopenia in men. Maturitas. 122, 51-56 (2019).
- NOF – Just for men. National Osteoporosis Foundation Available from: https://cdn.nof.org/wp-content/uploads/2015/12/Osteoporosis-Fast-Facts.pdf (2019)
- Williams, S. A., et al. Economic burden of osteoporotic fractures in US managed care enrollees. The American Journal of Managed Care. 26, 142-149 (2020).
- Sheen, J. R., Garla, V. V. Fracture healing overview. StatPearls. , (2021).
- Holmes, D. Closing the gap. Nature. 550, 194-195 (2017).
- Duchamp de Lageneste, O., et al. Periosteum contains skeletal stem cells with high bone regenerative potential controlled by Periostin. Nature Communications. 9, 773 (2018).
- Bahney, C. S., et al. Cellular biology of fracture healing. Journal of Orthopaedic Research. 37, 35-50 (2019).
- Li, Z., et al. Fracture repair requires TrkA signaling by skeletal sensory nerves. Journal of Clinical Investigation. 129, 5137-5150 (2019).
- Colnot, C., Thompson, Z., Miclau, T., Werb, Z., Helms, J. A. Altered fracture repair in the absence of MMP9. Development. 130, 4123-4133 (2003).
- Bonnarens, F., Einhorn, T. A. Production of a standard closed fracture in laboratory animal bone. Journal of Orthopaedic Research. 2, 97-101 (1984).
- Hu, K., Olsen, B. R. Osteoblast-derived VEGF regulates osteoblast differentiation and bone formation during bone repair. Journal of Clinical Investigation. 126, 509-526 (2016).
- Collier, C. D., et al. Characterization of a reproducible model of fracture healing in mice using an open femoral osteotomy. Bone Reports. 12, 100250 (2020).
- Glatt, V., Canalis, E., Stadmeyer, L., Bouxsein, M. L. Age-related changes in trabecular architecture differ in female and male C57BL/6J mice. Journal of Bone and Mineral Research. 22, 1197-1207 (2007).
- Garcia, P., et al. A new technique for internal fixation of femoral fractures in mice: impact of stability on fracture healing. Journal of Biomechanics. 41, 1689-1696 (2008).
- Holstein, J. H., et al. Advances in the establishment of defined mouse models for the study of fracture healing and bone regeneration. Journal of Orthopaedic Trauma. 23, 31-38 (2009).
- Garcia, P., et al. Rodent animal models of delayed bone healing and non-union formation: a comprehensive review. European Cells & Materials. 26 (1-12), 12-14 (2013).
- Histing, T., et al. Ex vivo analysis of rotational stiffness of different osteosynthesis techniques in mouse femur fracture. Journal of Orthopaedic Research. 27, 1152-1156 (2009).
- Williams, J. N., Li, Y., Valiya Kambrath, A., Sankar, U. The Generation of closed femoral fractures in mice: A model to study bone healing. Journal of Visualized Experiments. (138), e58122 (2018).
- Haffner-Luntzer, M., et al. A novel mouse model to study fracture healing of the proximal femur. Journal of Orthopaedic Research. 38, 2131-2138 (2020).
