السابقين فيفو الاستجواب البصري الجيني للانتقال المتشابك بعيد المدى واللدونة من القشرة الجبهية الإنسية إلى القشرة التورية الجانبية
Summary
نقدم هنا بروتوكولا يصف النقل الفيروسي لمناطق الدماغ المنفصلة ذات التركيبات البصرية الجينية للسماح بالتوصيف الكهروفسيولوجي الخاص بالمشابك العصبية في شرائح دماغ القوارض الحادة.
Abstract
تعد دراسة الخصائص الفسيولوجية لنقاط الاشتباك العصبي المحددة في الدماغ ، وكيفية خضوعها للتغيرات البلاستيكية ، تحديا رئيسيا في علم الأعصاب الحديث. تستخدم التقنيات الكهروفسيولوجية التقليدية في المختبر التحفيز الكهربائي لإثارة النقل المشبكي. العيب الرئيسي لهذه الطريقة هو طبيعتها غير المحددة. سيتم تنشيط جميع المحاور العصبية في منطقة القطب المحفز ، مما يجعل من الصعب عزو تأثير إلى اتصال معين قريب. يمكن التغلب على هذه المشكلة عن طريق استبدال التحفيز الكهربائي بالتحفيز القائم على البصريات الوراثية. نحن نصف طريقة للجمع بين علم البصريات الوراثي وتسجيلات المشبك في المختبر . هذه أداة قوية لدراسة كل من الانتقال المشبكي القاعدي واللدونة المشبكية للروابط المشبكية المحددة تشريحيا بدقة وتنطبق على أي مسار تقريبا في الدماغ. هنا ، نصف إعداد ومعالجة بروتين ناقل فيروسي يشفر قناة رودوبسين للحقن الجراحي في منطقة ما قبل المشبكي ذات الأهمية (قشرة الفص الجبهي الإنسية) في دماغ القوارض وصنع شرائح حادة من المناطق المستهدفة في المصب (القشرة الأنفية الجانبية). كما يتم تقديم إجراء مفصل للجمع بين تسجيلات المشبك التصحيحي والتنشيط المشبكي عن طريق التحفيز الضوئي لدراسة اللدونة المشبكية على المدى القصير والطويل. نناقش أمثلة على التجارب التي تحقق خصوصية المسار والخلية من خلال الجمع بين علم البصريات الوراثي ووضع العلامات على الخلايا المعتمدة على Cre. وأخيرا ، يتم وصف التأكيد النسيجي للمنطقة ما قبل المشبكي ذات الأهمية جنبا إلى جنب مع وضع العلامات البيوسيتين للخلية ما بعد المشبكية ، للسماح بمزيد من التحديد للموقع الدقيق ونوع الخلية.
Introduction
إن فهم فسيولوجيا نقاط الاشتباك العصبي وكيفية خضوعها للتغيرات البلاستيكية أمر أساسي لفهم كيفية عمل شبكات الدماغ في الدماغ السليم1 ، وكيف تتعطل في اضطرابات الدماغ. يسمح استخدام شرائح الدماغ الحادة خارج الجسم الحي بتسجيل النشاط الكهربائي للمشابك العصبية من الخلايا العصبية المفردة ذات نسبة إشارة إلى ضوضاء عالية باستخدام تسجيلات مشبك رقعة الخلية الكاملة. يسمح التحكم في إمكانات الغشاء والتلاعب الدوائي المباشر بعزل الأنواع الفرعية للمستقبلات. يمكن إجراء هذه التسجيلات بخصوصية رائعة لتحديد الخلايا العصبية ما بعد المشبكي ، بما في ذلك الموضع الرقائقي ودون الإقليمي2 ، والمورفولوجيا الخلوية3 ، ووجود علامات جزيئية4 ، وإسقاطاتهاالقريبة 5 ، أو حتى إذا كانت نشطة مؤخرا6.
ومع ذلك ، فإن تحقيق خصوصية المدخلات قبل المشبكي هو أكثر تحديا إلى حد ما. استخدمت الطريقة التقليدية أقطاب التحفيز لإثارة المحاور العصبية التي تعمل في صفيحة معينة. مثال على ذلك هو في الحصين حيث يقوم التحفيز المحلي في الطبقة الراديوية بتنشيط نقاط الاشتباك العصبي التي تنتقل من CA3 إلى الحقل الفرعي CA17. في هذه الحالة ، يتم تحقيق خصوصية ما قبل المشبكي حيث يمثل إدخال CA3 الإدخال المثير الوحيد الموجود داخل الطبقة المشعة التي تعرض على الخلايا الهرمية CA18. ومع ذلك ، فإن هذه الدرجة العالية من خصوصية المدخلات التي يمكن تحقيقها من خلال التنشيط الكهربائي التقليدي قبل المشبكي لمحاور CA3-CA1 هي استثناء ينعكس في الدراسة المكثفة التي خضع لها هذا المشبك. في مناطق الدماغ الأخرى ، تتعايش المحاور العصبية من مسارات متعددة في نفس الصفيحة ، على سبيل المثال ، في الطبقة 1 من القشرة المخية الجديدة9 ، مما يجعل التحفيز قبل المشبكي الخاص بالمدخلات مستحيلا مع أقطاب التحفيز التقليدية. هذا أمر إشكالي لأن المدخلات المشبكية المختلفة قد يكون لها خصائص فسيولوجية متباينة. لذلك ، قد يؤدي التحفيز المشترك إلى سوء توصيف علم وظائف الأعضاء المتشابك.
سمح ظهور علم البصريات الوراثي ، وهو الترميز الجيني لبروتينات الغشاء الحساسة للضوء (opsins) مثل channelrhodopsin-2 (ChR2) ، بتوسيع واسع في إمكانيات دراسة الإسقاطات المشبكية المعزولة بين مناطق الدماغ10,11. هنا نصف حلا قابلا للتعميم ومنخفض التكلفة لدراسة فسيولوجيا المشبكية طويلة المدى واللدونة. يتم تسليم التركيبات البصرية الجينية بطريقة محددة للغاية باستخدام ناقلات فيروسية تسمح بالتحكم الدقيق للغاية في المنطقة ما قبل المشبكي ذات الاهتمام. سوف تعبر الإسقاطات الساطعة عن القناة المنشطة بالضوء مما يسمح بتنشيط هذه الألياف في المنطقة المستهدفة. وبالتالي ، يمكن دراسة المسارات طويلة المدى والمنتشرة تشريحيا والتي لا يمكن تنشيطها بشكل مستقل عن طريق التحفيز الكهربائي التقليدي غير المحدد.
نحن نصف ، على سبيل المثال المسار ، نقل قشرة الفص الجبهي الإنسي (mPFC) مع الفيروسات المرتبطة بالغدية (AAVs) التي تشفر opsins قناة الكاتيون المثيرة. ثم نصف إعداد شرائح حادة من القشرة الداخلية الجانبية (LEC) ، وتسجيلات المشبك الرقعة من الخلايا العصبية الهرمية LEC من الطبقة 5 ، والتنشيط الخفيف لإسقاطات mPFC-LEC الغلوتاماتية (الشكل 1). كما نصف التقييم النسيجي لموقع الحقن لتأكيد موقع المنطقة ما قبل المشبكي ذات الأهمية وتحديد مورفولوجيا الخلايا ما بعد المشبكية.
Protocol
Representative Results
Discussion
يصف البروتوكول المعروض هنا طريقة لاستكشاف إسقاطات متشابكة طويلة المدى محددة للغاية باستخدام مزيج من الجراحة المجسمة لتقديم AAVs التي تشفر التركيبات البصرية الجينية ، والفيزيولوجيا الكهربية في شرائح الدماغ الحادة (الشكل 1). توفر هذه التقنيات مجتمعة أدوات لتوصيف فسيولوجيا و…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يتم دعم هذا العمل من خلال منحة Wellcome 206401 / Z / 17 / Z. نود أن نشكر ظفر بشير على إرشاده الخبير والدكتورة كلير بوث على المساعدة التقنية والتعليقات على المخطوطة.
Materials
| 0.2 mL tube | Fisher Scientific Ltd | 12134102 | |
| 10 µL pipette | Gilson | FD10001 | |
| 24 well plate | SARSTEDT | 83.3922 | |
| 3 way luer valve | Cole-Parmer | WZ-30600-02 | |
| 3,3′-Diaminobenzidine (DAB) substrate | Vector Laboratories | SK-4105 | |
| 40x objective | Olympus | LUMPLFLN40XW | |
| 4-aminopyridine | Hello Bio | HB1073 | |
| 4x objective | Olympus | PLN4X/0.1 | |
| AAV9-CaMKiia-hChR2(E123T/T159C)-mCherry | Addgene | 35512 | Viral titre: 3.3×1013 GC/ml |
| Achromatic lens | Edmund Optics | 49363 | Focusses visual spectrum and near-IR |
| Benchtop microcentrifuge | Benchmark Scientific | C1005* | |
| Biocytin | Sigma-Aldrich | B4261 | |
| Borosillicate glass capillary | Warner Instruments | G150F-6 | |
| Burr | Fine science tools | 19008-07 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C5670 | |
| Camera – Qimaging Retiga Electro | Photometrics | 01-ELECTRO-M-14-C | |
| Carbachol | Tocris | 2810 | |
| Chlorhexidine surgical scrub | Vetasept | XHG008 | |
| Clippers | Andis | 22445 | AGC Super 2-Speed Detachable Blade Clipper |
| Collimation condenser lens | ThorLabs | ACL2520-A | |
| Coverslips | Fisher Scientific Ltd | 10011913 | |
| Cryostat | Leica | CM3050 S | |
| CsMeSO4 | Sigma-Aldrich | C1426 | |
| Cyanoacrylate glue | Rapid Electronics Ltd | 84-4557 | |
| Data acquisition device | National Instruments | USB-6341 BNC | |
| D-glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| Dichroic mirror 500 nm long-pass | Edmund Optics | 69899 | |
| Dichroic mirror 600 nm long-pass | Edmund Optics | 69901 | |
| Dichroic mirror cube | ThorLabs | CM1-DCH/M | |
| EGTA | Millpore | 324626 | |
| Electrode holder with side port | HEKA | 895150 | |
| Emission filter | Chroma | 59022m | |
| Excitation filter | Chroma | ET570/20x | |
| Eye gel | Dechra | Lubrithal | |
| Fine paint brush | Scientific Laboratory Supplies | BRU2052 | |
| Guillotine | World Precision Instruments | DCAP | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Hydrogen peroxide solution | Sigma-Aldrich | H1009 | 30% (w/w) |
| Isoflurane | Henry Schein | 988-3245 | |
| Isopentane | Sigma-Aldrich | M32631 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| k-gluconate | Sigma-Aldrich | G4500 | |
| Kinematic fluorescence filter cube | ThorLabs | DFM1T1 | |
| LED driver | ThorLabs | LEDD1B | |
| Lidocaine ointment | Teva | 80007150 | |
| MgATP | Sigma-Aldrich | A9187 | |
| MgCl | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | M7506 | |
| Micro drill | Harvard Apparatus | 75-1887 | |
| Microelectrode puller | Sutter instruments | P-87 | |
| Microinjection syringe | Hamilton | 7634-01/00 | |
| Microinjection syringe needle | Hamilton | 7803-05 | Custom specification: gauge 33, length 15mm, point style 4 – 12° |
| Microinjection syringe pump | World Precision Instruments | UMP3T-1 | |
| Mounted blue LED | ThorLabs | M470L5 | |
| Mounted green LED | ThorLabs | M565L3 | |
| Na2HPO4.7H2O | Sigma-Aldrich | S9390 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| NaGTP | Sigma-Aldrich | G8877 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S0751 | |
| NaH2PO4.H2O | Sigma-Aldrich | S9638 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| NIR LED | OSRAM | SFH4550 | Used for refracted IR imaging of slice, differential interference contrast (DIC) optics is another commonly used method |
| OCT medium | VWR International | RAYLLAMB/OCT | Optimal cutting temperature medium |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Patch clamp amplifier | Molecular Devices | 700A | |
| Peristaltic pump | World Precision Instruments | Ministar | |
| Poly-L-lysine coated microscope slides | Fisher Scientific Ltd | 23-769-310 | |
| Recording chamber | Warner Instruments | RC-26G | |
| Scalpel blade | Swann Morton | #24 | |
| Slice anchor | Warner Instruments | SHD-26-GH/15 | |
| Stereotaxic frame | Kopf | Model 902 | |
| Stereotaxic holder for micro drill | Harvard Apparatus | 75-1874 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| Surgical Microscope | Carl Zeiss | OPMI 1 FR pro | |
| Suture | Ethicon | W577H | |
| Syringe filter for intracellular recording solution | Thermo Scientific Nalgene | 171-0020 | |
| Tetrodotoxin citrate | Hello Bio | HB1035 | |
| Transfer pipettes | Fisher Scientific Ltd | 10458842 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Upright fluorescence microscope | Leica | DM6 B | |
| VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200-10 | |
| VECTASTAIN ABC-HRP kit | Vector Laboratories | PK-4000 | |
| Vibratome | Campden Instruments | 7000smz-2 | |
| WinLTP | https://www.winltp.com/ | Version 2.32 | Data acquisition software |
| Solution | |||
| aCSF | |||
| sucrose cutting solution | |||
| PFA | |||
| Intracellular? |
Riferimenti
- Martin, S., Grimwood, P., Morris, R. Synaptic plasticity and memory: an evaluation of the hypothesis. Annual Review of Neuroscience. 23, 649-711 (2000).
- Poorthuis, R. B., et al. Layer-specific modulation of the prefrontal cortex by nicotinic acetylcholine receptors. Cerebral Cortex. 23 (1), 148-161 (2013).
- Scala, F., et al. Layer 4 of mouse neocortex differs in cell types and circuit organization between sensory areas. Nature Communications. 10 (1), 4174 (2019).
- Nassar, M., et al. Diversity and overlap of parvalbumin and somatostatin expressing interneurons in mouse presubiculum. Frontiers in Neural Circuits. 9, 20 (2015).
- Dembrow, N. C., Chitwood, R. A., Johnston, D. Projection-specific neuromodulation of medial prefrontal cortex neurons. Journal of Neuroscience. 30 (50), 16922-16937 (2010).
- Whitaker, L. R., et al. Bidirectional modulation of intrinsic excitability in rat prelimbic cortex neuronal ensembles and non-ensembles after operant learning. Journal of Neuroscience. 37 (36), 8845-8856 (2017).
- Skrede, K. K., Westgaard, R. H. The transverse hippocampal slice: a well-defined cortical structure maintained in vitro. Brain Research. 35 (2), 589-593 (1971).
- van Strien, N. M., Cappaert, N. L., Witter, M. P. The anatomy of memory: an interactive overview of the parahippocampal-hippocampal network. Nature Reviews Neuroscience. 10 (4), 272-282 (2009).
- Cruikshank, S. J., et al. Thalamic control of layer 1 circuits in prefrontal cortex. Journal of Neuroscience. 32 (49), 17813-17823 (2012).
- Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nature Neuroscience. 8 (9), 1263-1268 (2005).
- Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (24), 13940-13945 (2003).
- Berndt, A., et al. High-efficiency channelrhodopsins for fast neuronal stimulation at low light levels. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (18), 7595-7600 (2011).
- Cetin, A., Komai, S., Eliava, M., Seeburg, P. H., Osten, P. Stereotaxic gene delivery in the rodent brain. Nature Protocols. 1 (6), 3166-3173 (2006).
- Segev, A., Garcia-Oscos, F., Kourrich, S. Whole-cell patch-clamp recordings in brain slices. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (112), (2016).
- Booker, S. A. Preparing acute brain slices from the dorsal pole of the hippocampus from adult rodents. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (163), (2020).
- Anderson, W. W., Collingridge, G. L. Capabilities of the WinLTP data acquisition program extending beyond basic LTP experimental functions. Journal of Neuroscience Methods. 162 (1-2), 346-356 (2007).
- Basu, J., et al. Gating of hippocampal activity, plasticity, and memory by entorhinal cortex long-range inhibition. Science. 351 (6269), (2016).
- Zhang, Y. P., Oertner, T. G. Optical induction of synaptic plasticity using a light-sensitive channel. Nature Methods. 4 (2), 139-141 (2007).
- Banks, P. J., Warburton, E. C., Bashir, Z. I. Plasticity in prefrontal cortex induced by coordinated synaptic transmission arising from reuniens/rhomboid nuclei and hippocampus. Cerebral Cortex Communications. 2 (2), (2021).
- Petreanu, L., Mao, T., Sternson, S. M., Svoboda, K. The subcellular organization of neocortical excitatory connections. Nature. 457 (7233), 1142-1145 (2009).
- Swietek, B., Gupta, A., Proddutur, A., Santhakumar, V. Immunostaining of biocytin-filled and processed sections for neurochemical markers. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (118), (2016).
- Jones, B. F., Witter, M. P. Cingulate cortex projections to the parahippocampal region and hippocampal formation in the rat. Hippocampus. 17 (10), 957-976 (2007).
- Anastasiades, P. G., Collins, D. P., Carter, A. G. Mediodorsal and ventromedial thalamus engage distinct L1 circuits in the prefrontal cortex. Neuron. 109 (2), 314-330 (2021).
- Prakash, R., et al. Two-photon optogenetic toolbox for fast inhibition, excitation and bistable modulation. Nature Methods. 9 (12), 1171-1179 (2012).
- Mattis, J., et al. Principles for applying optogenetic tools derived from direct comparative analysis of microbial opsins. Nature Methods. 9 (2), 159-172 (2011).
- Klapoetke, N. C., et al. Independent optical excitation of distinct neural populations. Nature Methods. 11 (3), 338-346 (2014).
- Hochbaum, D. R., et al. All-optical electrophysiology in mammalian neurons using engineered microbial rhodopsins. Nature Methods. 11 (8), 825-833 (2014).
- Ting, J. T., Daigle, T. L., Chen, Q., Feng, G. Acute brain slice methods for adult and aging animals: application of targeted patch clamp analysis and optogenetics. Methods in Molecular Biology. 1183, 221-242 (2014).
- Marshel, J. H., et al. Cortical layer-specific critical dynamics triggering perception. Science. 365 (6453), (2019).
- Castle, M. J., Gershenson, Z. T., Giles, A. R., Holzbaur, E. L., Wolfe, J. H. Adeno-associated virus serotypes 1, 8, and 9 share conserved mechanisms for anterograde and retrograde axonal transport. Human Gene Therapy. 25 (8), 705-720 (2014).
- Aschauer, D. F., Kreuz, S., Rumpel, S. Analysis of transduction efficiency, tropism and axonal transport of AAV serotypes 1, 2, 5, 6, 8 and 9 in the mouse brain. PLoS One. 8 (9), 76310 (2013).
- Nathanson, J. L., Yanagawa, Y., Obata, K., Callaway, E. M. Preferential labeling of inhibitory and excitatory cortical neurons by endogenous tropism of adeno-associated virus and lentivirus vectors. Neuroscienze. 161 (2), 441-450 (2009).
- Dimidschstein, J., et al. A viral strategy for targeting and manipulating interneurons across vertebrate species. Nature Neuroscience. 19 (12), 1743-1749 (2016).
- Lavin, T. K., Jin, L., Lea, N. E., Wickersham, I. R. Monosynaptic tracing success depends critically on helper virus concentrations. Frontiers in Synaptic Neuroscience. 12, 6 (2020).
- Paxinos, G., Watson, C. . The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. 7th edn. , (2013).
- Paxinos, G., Franklin, K. B. J. . Paxinos and Franklin’s the Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates, Compact. 5th edn. , (2019).
- Nabavi, S., et al. Engineering a memory with LTD and LTP. Nature. 511 (7509), 348-352 (2014).
- Jackman, S. L., Beneduce, B. M., Drew, I. R., Regehr, W. G. Achieving high-frequency optical control of synaptic transmission. Journal of Neuroscience. 34 (22), 7704-7714 (2014).
- Xia, S. H., et al. Cortical and Thalamic Interaction with Amygdala-to-Accumbens Synapses. Journal of Neuroscience. 40 (37), 7119-7132 (2020).
- Anisimova, M., et al. Spike-timing-dependent plasticity rewards synchrony rather than causality. BioRxiv. , (2021).
- Takeuchi, T., et al. Locus coeruleus and dopaminergic consolidation of everyday memory. Nature. 537 (7620), 357-362 (2016).
