Ex vivo Optogenetische Befragung der synaptischen Übertragung und Plastizität über große Entfernungen vom medialen präfrontalen Kortex zum lateralen entohinalen Kortex
Summary
Hier stellen wir ein Protokoll vor, das die virale Transduktion diskreter Hirnregionen mit optogenetischen Konstrukten beschreibt, um eine synapsenspezifische elektrophysiologische Charakterisierung in akuten Nagetierhirnschnitten zu ermöglichen.
Abstract
Die Untersuchung der physiologischen Eigenschaften bestimmter Synapsen im Gehirn und wie sie plastische Veränderungen erfahren, ist eine zentrale Herausforderung in den modernen Neurowissenschaften. Traditionelle elektrophysiologische In-vitro-Techniken verwenden elektrische Stimulation, um eine synaptische Übertragung hervorzurufen. Ein großer Nachteil dieser Methode ist ihre unspezifische Natur; Alle Axone im Bereich der stimulierenden Elektrode werden aktiviert, was es schwierig macht, einen Effekt einer bestimmten afferenten Verbindung zuzuordnen. Dieses Problem kann überwunden werden, indem die elektrische Stimulation durch eine optogenetisch-basierte Stimulation ersetzt wird. Wir beschreiben eine Methode zur Kombination von Optogenetik mit in vitro Patch-Clamp-Aufnahmen. Dies ist ein leistungsfähiges Werkzeug für die Untersuchung sowohl der basalen synaptischen Übertragung als auch der synaptischen Plastizität präziser anatomisch definierter synaptischer Verbindungen und ist auf fast jeden Signalweg im Gehirn anwendbar. Hier beschreiben wir die Herstellung und Handhabung eines viralen Vektors, der für das Kanalrhodopsin-Protein kodiert, zur chirurgischen Injektion in eine präsynaptische Interessenregion (medialer präfrontaler Kortex) im Nagetiergehirn und zur Herstellung von akuten Schnitten nachgeschalteter Zielregionen (lateraler entorhinaler Kortex). Ein detailliertes Verfahren zur Kombination von Patch-Clamp-Aufnahmen mit synaptischer Aktivierung durch Lichtstimulation zur Untersuchung der kurz- und langfristigen synaptischen Plastizität wird ebenfalls vorgestellt. Wir diskutieren Beispiele von Experimenten, die durch die Kombination von Optogenetik und Cre-abhängiger Zellmarkierung Signalweg- und Zellspezifität erreichen. Schließlich wird die histologische Bestätigung der präsynaptischen Region von Interesse zusammen mit der Biocytin-Markierung der postsynaptischen Zelle beschrieben, um eine weitere Identifizierung des genauen Ortes und des Zelltyps zu ermöglichen.
Introduction
Das Verständnis der Physiologie von Synapsen und wie sie plastische Veränderungen erfahren, ist grundlegend für das Verständnis, wie Gehirnnetzwerke im gesunden Gehirn funktionieren1 und wie sie bei Hirnerkrankungen fehlfunktionieren. Die Verwendung von akuten ex vivo Gehirnschnitten ermöglicht die Aufzeichnung der elektrischen Aktivität von Synapsen einzelner Neuronen mit einem hohen Signal-Rausch-Verhältnis unter Verwendung von Ganzzell-Patch-Clamp-Aufnahmen. Die Kontrolle des Membranpotentials und die einfache pharmakologische Manipulation ermöglichen die Isolierung von Rezeptorsubtypen. Diese Aufnahmen können mit exquisiter Spezifität gemacht werden, um das postsynaptische Neuron zu identifizieren, einschließlich laminarer und subregionaler Position2, zellulärer Morphologie3, Vorhandensein molekularer Marker4, seiner afferenten Projektionen5 oder sogar, wenn es kürzlich aktiv war6.
Das Erreichen der Spezifität präsynaptischer Inputs ist jedoch etwas schwieriger. Die konventionelle Methode hat Stimulationselektroden verwendet, um die Axone anzuregen, die in einer bestimmten Lamina verlaufen. Ein Beispiel dafür ist der Hippocampus, wo lokale Stimulation im Stratum radiatum Synapsen aktiviert, die vom CA3 in das CA1-Teilfeld7 projizieren. In diesem Fall wird eine präsynaptische Spezifität erreicht, da der CA3-Input den einzigen exzitatorischen Input darstellt, der sich innerhalb des Stratum radiatum befindet, das auf CA1-Pyramidenzellen8 projiziert. Dieser hohe Grad an Eingangsspezifität, der mit konventioneller elektrischer präsynaptischer Aktivierung von CA3-CA1-Axonen erreicht werden kann, ist jedoch eine Ausnahme, die sich in der intensiven Studie widerspiegelt, der diese Synapse unterzogen wurde. In anderen Hirnregionen koexistieren Axone aus mehreren afferenten Signalwegen in derselben Lamina, beispielsweise in Schicht 1 des Neocortex9, so dass eine inputspezifische präsynaptische Stimulation mit herkömmlichen Stimulationselektroden unmöglich wird. Dies ist problematisch, da verschiedene synaptische Inputs unterschiedliche physiologische Eigenschaften haben können; Daher kann ihre Co-Stimulation zu einer Fehlcharakterisierung der synaptischen Physiologie führen.
Das Aufkommen der Optogenetik, der genetischen Kodierung von lichtempfindlichen Membranproteinen (Opsinen) wie Kanalrhodopsin-2 (ChR2), hat eine enorme Erweiterung der Möglichkeiten zur Untersuchung isolierter synaptischer Projektionen zwischen Gehirnregionen ermöglicht10,11. Hier beschreiben wir eine verallgemeinerbare und kostengünstige Lösung zur Untersuchung der synaptischen Physiologie und Plastizität mit großer Reichweite. Die optogenetischen Konstrukte werden hochspezifisch mit Hilfe viraler Vektoren geliefert, die eine äußerst präzise Kontrolle der präsynaptischen Region von Interesse ermöglichen. Efferente Projektionen drücken den lichtaktivierten Kanal aus, der die Aktivierung dieser Fasern in einer Zielregion ermöglicht. So können langreichweitige, anatomisch diffuse Signalwege untersucht werden, die durch herkömmliche, unspezifische, elektrische Stimulation nicht unabhängig aktiviert werden können.
Wir beschreiben als Beispielweg die Transduktion des medialen präfrontalen Kortex (mPFC) mit adeno-assoziierten Viren (AAVs), die exzitatorische Kationenkanal-Opsine kodieren. Wir beschreiben dann die Herstellung von akuten Schnitten aus lateralem entorhinalen Kortex (LEC), Patch-Clamp-Aufnahmen von LEC-Pyramidenneuronen der Schicht 5 und die lichtevozierte Aktivierung glutamaterger mPFC-LEC-Projektionen (Abbildung 1). Wir beschreiben auch die histologische Beurteilung der Injektionsstelle, um die Lage der präsynaptischen Region von Interesse zu bestätigen und die postsynaptische Zellmorphologie zu identifizieren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das hier vorgestellte Protokoll beschreibt eine Methode zur Erforschung hochspezifischer synaptischer Projektionen mit großer Reichweite unter Verwendung einer Kombination aus stereotaktischer Chirurgie, um AAVs zu liefern, die optogenetische Konstrukte kodieren, und Elektrophysiologie in akuten Hirnschnitten (Abbildung 1). Zusammen bieten diese Techniken Werkzeuge, um die Physiologie und Plastizität von Gehirnschaltkreisen mit hoher Präzision in weiträumigen und anatomisch diffusen Bahn…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wird durch das Wellcome-Stipendium 206401/Z/17/Z unterstützt. Wir danken Zafar Bashir für seine fachkundige Betreuung und Dr. Clair Booth für die technische Unterstützung und Kommentare zum Manuskript.
Materials
| 0.2 mL tube | Fisher Scientific Ltd | 12134102 | |
| 10 µL pipette | Gilson | FD10001 | |
| 24 well plate | SARSTEDT | 83.3922 | |
| 3 way luer valve | Cole-Parmer | WZ-30600-02 | |
| 3,3′-Diaminobenzidine (DAB) substrate | Vector Laboratories | SK-4105 | |
| 40x objective | Olympus | LUMPLFLN40XW | |
| 4-aminopyridine | Hello Bio | HB1073 | |
| 4x objective | Olympus | PLN4X/0.1 | |
| AAV9-CaMKiia-hChR2(E123T/T159C)-mCherry | Addgene | 35512 | Viral titre: 3.3×1013 GC/ml |
| Achromatic lens | Edmund Optics | 49363 | Focusses visual spectrum and near-IR |
| Benchtop microcentrifuge | Benchmark Scientific | C1005* | |
| Biocytin | Sigma-Aldrich | B4261 | |
| Borosillicate glass capillary | Warner Instruments | G150F-6 | |
| Burr | Fine science tools | 19008-07 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C5670 | |
| Camera – Qimaging Retiga Electro | Photometrics | 01-ELECTRO-M-14-C | |
| Carbachol | Tocris | 2810 | |
| Chlorhexidine surgical scrub | Vetasept | XHG008 | |
| Clippers | Andis | 22445 | AGC Super 2-Speed Detachable Blade Clipper |
| Collimation condenser lens | ThorLabs | ACL2520-A | |
| Coverslips | Fisher Scientific Ltd | 10011913 | |
| Cryostat | Leica | CM3050 S | |
| CsMeSO4 | Sigma-Aldrich | C1426 | |
| Cyanoacrylate glue | Rapid Electronics Ltd | 84-4557 | |
| Data acquisition device | National Instruments | USB-6341 BNC | |
| D-glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| Dichroic mirror 500 nm long-pass | Edmund Optics | 69899 | |
| Dichroic mirror 600 nm long-pass | Edmund Optics | 69901 | |
| Dichroic mirror cube | ThorLabs | CM1-DCH/M | |
| EGTA | Millpore | 324626 | |
| Electrode holder with side port | HEKA | 895150 | |
| Emission filter | Chroma | 59022m | |
| Excitation filter | Chroma | ET570/20x | |
| Eye gel | Dechra | Lubrithal | |
| Fine paint brush | Scientific Laboratory Supplies | BRU2052 | |
| Guillotine | World Precision Instruments | DCAP | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Hydrogen peroxide solution | Sigma-Aldrich | H1009 | 30% (w/w) |
| Isoflurane | Henry Schein | 988-3245 | |
| Isopentane | Sigma-Aldrich | M32631 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| k-gluconate | Sigma-Aldrich | G4500 | |
| Kinematic fluorescence filter cube | ThorLabs | DFM1T1 | |
| LED driver | ThorLabs | LEDD1B | |
| Lidocaine ointment | Teva | 80007150 | |
| MgATP | Sigma-Aldrich | A9187 | |
| MgCl | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | M7506 | |
| Micro drill | Harvard Apparatus | 75-1887 | |
| Microelectrode puller | Sutter instruments | P-87 | |
| Microinjection syringe | Hamilton | 7634-01/00 | |
| Microinjection syringe needle | Hamilton | 7803-05 | Custom specification: gauge 33, length 15mm, point style 4 – 12° |
| Microinjection syringe pump | World Precision Instruments | UMP3T-1 | |
| Mounted blue LED | ThorLabs | M470L5 | |
| Mounted green LED | ThorLabs | M565L3 | |
| Na2HPO4.7H2O | Sigma-Aldrich | S9390 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| NaGTP | Sigma-Aldrich | G8877 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S0751 | |
| NaH2PO4.H2O | Sigma-Aldrich | S9638 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| NIR LED | OSRAM | SFH4550 | Used for refracted IR imaging of slice, differential interference contrast (DIC) optics is another commonly used method |
| OCT medium | VWR International | RAYLLAMB/OCT | Optimal cutting temperature medium |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Patch clamp amplifier | Molecular Devices | 700A | |
| Peristaltic pump | World Precision Instruments | Ministar | |
| Poly-L-lysine coated microscope slides | Fisher Scientific Ltd | 23-769-310 | |
| Recording chamber | Warner Instruments | RC-26G | |
| Scalpel blade | Swann Morton | #24 | |
| Slice anchor | Warner Instruments | SHD-26-GH/15 | |
| Stereotaxic frame | Kopf | Model 902 | |
| Stereotaxic holder for micro drill | Harvard Apparatus | 75-1874 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| Surgical Microscope | Carl Zeiss | OPMI 1 FR pro | |
| Suture | Ethicon | W577H | |
| Syringe filter for intracellular recording solution | Thermo Scientific Nalgene | 171-0020 | |
| Tetrodotoxin citrate | Hello Bio | HB1035 | |
| Transfer pipettes | Fisher Scientific Ltd | 10458842 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Upright fluorescence microscope | Leica | DM6 B | |
| VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200-10 | |
| VECTASTAIN ABC-HRP kit | Vector Laboratories | PK-4000 | |
| Vibratome | Campden Instruments | 7000smz-2 | |
| WinLTP | https://www.winltp.com/ | Version 2.32 | Data acquisition software |
| Solution | |||
| aCSF | |||
| sucrose cutting solution | |||
| PFA | |||
| Intracellular? |
Riferimenti
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