Ex Vivo Optogenetisk forhør av langdistanse synaptisk overføring og plastisitet fra medial prefrontal cortex til lateral entorhinal cortex
Summary
Her presenterer vi en protokoll som beskriver viral transduksjon av diskrete hjernegrupper med optogenetiske konstruksjoner for å tillate synapsespesifikk elektrofysiologisk karakterisering i akutte gnagerhjerneskiver.
Abstract
Å studere de fysiologiske egenskapene til spesifikke synapser i hjernen, og hvordan de gjennomgår plastiske endringer, er en sentral utfordring i moderne nevrovitenskap. Tradisjonelle in vitro elektrofysiologiske teknikker bruker elektrisk stimulering for å fremkalle synaptisk overføring. En stor ulempe ved denne metoden er dens uspesifikke natur; Alle aksoner i regionen av den stimulerende elektroden vil bli aktivert, noe som gjør det vanskelig å tilskrive en effekt til en bestemt afferente forbindelse. Dette problemet kan løses ved å erstatte elektrisk stimulering med optogenetisk basert stimulering. Vi beskriver en metode for å kombinere optogenetikk med in vitro patch-clamp opptak. Dette er et kraftig verktøy for studier av både basal synaptisk overføring og synaptisk plastisitet av presise anatomisk definerte synaptiske forbindelser og gjelder for nesten hvilken som helst vei i hjernen. Her beskriver vi forberedelse og håndtering av et viralt vektorkodingskanalrhodopsinprotein for kirurgisk injeksjon i et presynaptisk interesseområde (medial prefrontal cortex) i gnagerhjernen og fremstilling av akutte skiver av nedstrøms målregioner (lateral entorhinal cortex). En detaljert prosedyre for å kombinere patch-clamp-opptak med synaptisk aktivering ved lysstimulering for å studere kort- og langsiktig synaptisk plastisitet presenteres også. Vi diskuterer eksempler på eksperimenter som oppnår vei- og cellespesifisitet ved å kombinere optogenetikk og Cre-avhengig cellemerking. Endelig beskrives histologisk bekreftelse av den presynaptiske interesseområdet sammen med biocytinmerking av den postsynaptiske cellen, for å muliggjøre ytterligere identifisering av den nøyaktige plasseringen og celletypen.
Introduction
Å forstå synapsenes fysiologi og hvordan de gjennomgår plastiske endringer er grunnleggende for å forstå hvordan hjernenettverk fungerer i den sunne hjernen1, og hvordan de svikter i hjernesykdommer. Bruken av akutte ex vivo hjerneskiver muliggjør registrering av den elektriske aktiviteten til synapser fra enkeltneuroner med høyt signal-til-støy-forhold ved bruk av helcelle-patch-klemmeopptak. Kontroll av membranpotensial og enkel farmakologisk manipulasjon tillater isolering av reseptorsubtyper. Disse opptakene kan gjøres med utsøkt spesifisitet for å identifisere det postsynaptiske nevronet, inkludert laminær og subregional posisjon2, cellulær morfologi3, tilstedeværelse av molekylære markører4, dens afferente fremspring5, eller selv om den nylig var aktiv6.
Å oppnå spesifisitet av presynaptiske innganger er imidlertid noe mer utfordrende. Den konvensjonelle metoden har brukt stimuleringselektroder for å opphisse aksonene som kjører i en bestemt lamina. Et eksempel på dette er i hippocampus hvor lokal stimulering i stratum radiatum aktiverer synapser som projiserer fra CA3 til CA1-underfeltet7. I dette tilfellet oppnås presynaptisk spesifisitet da CA3-inngang representerer den eneste eksitatoriske inngangen som ligger innenfor stratum radiatum som projiserer til CA1-pyramideceller8. Denne høye graden av inngangsspesifisitet som kan oppnås med konvensjonell elektrisk presynaptisk aktivering av CA3-CA1-aksoner, er imidlertid et unntak som gjenspeiles i den intense studien som denne synapsen har vært utsatt for. I andre hjernegrupper eksisterer aksoner fra flere afferente veier i samme lamina, for eksempel i lag 1 av neocortex9, noe som gjør inngangsspesifikk presynaptisk stimulering umulig med konvensjonelle stimulerende elektroder. Dette er problematisk da forskjellige synaptiske innganger kan ha divergerende fysiologiske egenskaper; Derfor kan deres samstimulering føre til feilkarakterisering av synaptisk fysiologi.
Fremkomsten av optogenetikk, den genetiske kodingen av lysfølsomme membranproteiner (opsiner) som channelrhodopsin-2 (ChR2), har gitt en stor utvidelse av mulighetene for å studere isolerte synaptiske fremskrivninger mellom hjernegrupper10,11. Her beskriver vi en generaliserbar og rimelig løsning for å studere langtrekkende synaptisk fysiologi og plastisitet. De optogenetiske konstruksjonene leveres på en svært spesifikk måte ved bruk av virale vektorer som muliggjør ekstremt presis kontroll av det presynaptiske interesseområdet. Efferente fremspring vil uttrykke den lysaktiverte kanalen som muliggjør aktivering av disse fibrene i et målområde. Dermed kan langtrekkende, anatomisk diffuse veier som ikke kan aktiveres uavhengig av tradisjonell, ikke-spesifikk, elektrisk stimulering studeres.
Vi beskriver, som eksempelvei, transduksjon av medial prefrontal cortex (mPFC) med adenoassosierte virus (AAV) som koder for eksitatoriske kationkanalopsiner. Deretter beskriver vi fremstilling av akutte skiver fra lateral entorhinal cortex (LEC), patch-clamp-opptak fra lag 5 LEC pyramidale nevroner, og lysfremkalt aktivering av glutamaterge mPFC-LEC-projeksjoner (figur 1). Vi beskriver også den histologiske vurderingen av injeksjonsstedet for å bekrefte lokalisering av det presynaptiske interesseområdet og identifisering av postsynaptisk cellemorfologi.
Protocol
Representative Results
Discussion
Protokollen som presenteres her beskriver en metode for å utforske svært spesifikke langtrekkende synaptiske projeksjoner ved hjelp av en kombinasjon av stereotaksisk kirurgi for å levere AAV-er som koder for optogenetiske konstruksjoner, og elektrofysiologi i akutte hjerneskiver (figur 1). Sammen tilbyr disse teknikkene verktøy for å karakterisere fysiologien og plastisiteten til hjernekretser med høy presisjon i langdistanse og anatomisk diffuse veier som tidligere var utilgjengelige…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet støttes av Wellcome grant 206401/Z/17/Z. Vi vil gjerne takke Zafar Bashir for hans ekspertmentorskap og Dr. Clair Booth for teknisk assistanse og kommentarer til manuskriptet.
Materials
| 0.2 mL tube | Fisher Scientific Ltd | 12134102 | |
| 10 µL pipette | Gilson | FD10001 | |
| 24 well plate | SARSTEDT | 83.3922 | |
| 3 way luer valve | Cole-Parmer | WZ-30600-02 | |
| 3,3′-Diaminobenzidine (DAB) substrate | Vector Laboratories | SK-4105 | |
| 40x objective | Olympus | LUMPLFLN40XW | |
| 4-aminopyridine | Hello Bio | HB1073 | |
| 4x objective | Olympus | PLN4X/0.1 | |
| AAV9-CaMKiia-hChR2(E123T/T159C)-mCherry | Addgene | 35512 | Viral titre: 3.3×1013 GC/ml |
| Achromatic lens | Edmund Optics | 49363 | Focusses visual spectrum and near-IR |
| Benchtop microcentrifuge | Benchmark Scientific | C1005* | |
| Biocytin | Sigma-Aldrich | B4261 | |
| Borosillicate glass capillary | Warner Instruments | G150F-6 | |
| Burr | Fine science tools | 19008-07 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C5670 | |
| Camera – Qimaging Retiga Electro | Photometrics | 01-ELECTRO-M-14-C | |
| Carbachol | Tocris | 2810 | |
| Chlorhexidine surgical scrub | Vetasept | XHG008 | |
| Clippers | Andis | 22445 | AGC Super 2-Speed Detachable Blade Clipper |
| Collimation condenser lens | ThorLabs | ACL2520-A | |
| Coverslips | Fisher Scientific Ltd | 10011913 | |
| Cryostat | Leica | CM3050 S | |
| CsMeSO4 | Sigma-Aldrich | C1426 | |
| Cyanoacrylate glue | Rapid Electronics Ltd | 84-4557 | |
| Data acquisition device | National Instruments | USB-6341 BNC | |
| D-glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| Dichroic mirror 500 nm long-pass | Edmund Optics | 69899 | |
| Dichroic mirror 600 nm long-pass | Edmund Optics | 69901 | |
| Dichroic mirror cube | ThorLabs | CM1-DCH/M | |
| EGTA | Millpore | 324626 | |
| Electrode holder with side port | HEKA | 895150 | |
| Emission filter | Chroma | 59022m | |
| Excitation filter | Chroma | ET570/20x | |
| Eye gel | Dechra | Lubrithal | |
| Fine paint brush | Scientific Laboratory Supplies | BRU2052 | |
| Guillotine | World Precision Instruments | DCAP | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Hydrogen peroxide solution | Sigma-Aldrich | H1009 | 30% (w/w) |
| Isoflurane | Henry Schein | 988-3245 | |
| Isopentane | Sigma-Aldrich | M32631 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| k-gluconate | Sigma-Aldrich | G4500 | |
| Kinematic fluorescence filter cube | ThorLabs | DFM1T1 | |
| LED driver | ThorLabs | LEDD1B | |
| Lidocaine ointment | Teva | 80007150 | |
| MgATP | Sigma-Aldrich | A9187 | |
| MgCl | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | M7506 | |
| Micro drill | Harvard Apparatus | 75-1887 | |
| Microelectrode puller | Sutter instruments | P-87 | |
| Microinjection syringe | Hamilton | 7634-01/00 | |
| Microinjection syringe needle | Hamilton | 7803-05 | Custom specification: gauge 33, length 15mm, point style 4 – 12° |
| Microinjection syringe pump | World Precision Instruments | UMP3T-1 | |
| Mounted blue LED | ThorLabs | M470L5 | |
| Mounted green LED | ThorLabs | M565L3 | |
| Na2HPO4.7H2O | Sigma-Aldrich | S9390 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| NaGTP | Sigma-Aldrich | G8877 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S0751 | |
| NaH2PO4.H2O | Sigma-Aldrich | S9638 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| NIR LED | OSRAM | SFH4550 | Used for refracted IR imaging of slice, differential interference contrast (DIC) optics is another commonly used method |
| OCT medium | VWR International | RAYLLAMB/OCT | Optimal cutting temperature medium |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Patch clamp amplifier | Molecular Devices | 700A | |
| Peristaltic pump | World Precision Instruments | Ministar | |
| Poly-L-lysine coated microscope slides | Fisher Scientific Ltd | 23-769-310 | |
| Recording chamber | Warner Instruments | RC-26G | |
| Scalpel blade | Swann Morton | #24 | |
| Slice anchor | Warner Instruments | SHD-26-GH/15 | |
| Stereotaxic frame | Kopf | Model 902 | |
| Stereotaxic holder for micro drill | Harvard Apparatus | 75-1874 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| Surgical Microscope | Carl Zeiss | OPMI 1 FR pro | |
| Suture | Ethicon | W577H | |
| Syringe filter for intracellular recording solution | Thermo Scientific Nalgene | 171-0020 | |
| Tetrodotoxin citrate | Hello Bio | HB1035 | |
| Transfer pipettes | Fisher Scientific Ltd | 10458842 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Upright fluorescence microscope | Leica | DM6 B | |
| VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200-10 | |
| VECTASTAIN ABC-HRP kit | Vector Laboratories | PK-4000 | |
| Vibratome | Campden Instruments | 7000smz-2 | |
| WinLTP | https://www.winltp.com/ | Version 2.32 | Data acquisition software |
| Solution | |||
| aCSF | |||
| sucrose cutting solution | |||
| PFA | |||
| Intracellular? |
Riferimenti
- Martin, S., Grimwood, P., Morris, R. Synaptic plasticity and memory: an evaluation of the hypothesis. Annual Review of Neuroscience. 23, 649-711 (2000).
- Poorthuis, R. B., et al. Layer-specific modulation of the prefrontal cortex by nicotinic acetylcholine receptors. Cerebral Cortex. 23 (1), 148-161 (2013).
- Scala, F., et al. Layer 4 of mouse neocortex differs in cell types and circuit organization between sensory areas. Nature Communications. 10 (1), 4174 (2019).
- Nassar, M., et al. Diversity and overlap of parvalbumin and somatostatin expressing interneurons in mouse presubiculum. Frontiers in Neural Circuits. 9, 20 (2015).
- Dembrow, N. C., Chitwood, R. A., Johnston, D. Projection-specific neuromodulation of medial prefrontal cortex neurons. Journal of Neuroscience. 30 (50), 16922-16937 (2010).
- Whitaker, L. R., et al. Bidirectional modulation of intrinsic excitability in rat prelimbic cortex neuronal ensembles and non-ensembles after operant learning. Journal of Neuroscience. 37 (36), 8845-8856 (2017).
- Skrede, K. K., Westgaard, R. H. The transverse hippocampal slice: a well-defined cortical structure maintained in vitro. Brain Research. 35 (2), 589-593 (1971).
- van Strien, N. M., Cappaert, N. L., Witter, M. P. The anatomy of memory: an interactive overview of the parahippocampal-hippocampal network. Nature Reviews Neuroscience. 10 (4), 272-282 (2009).
- Cruikshank, S. J., et al. Thalamic control of layer 1 circuits in prefrontal cortex. Journal of Neuroscience. 32 (49), 17813-17823 (2012).
- Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nature Neuroscience. 8 (9), 1263-1268 (2005).
- Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (24), 13940-13945 (2003).
- Berndt, A., et al. High-efficiency channelrhodopsins for fast neuronal stimulation at low light levels. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (18), 7595-7600 (2011).
- Cetin, A., Komai, S., Eliava, M., Seeburg, P. H., Osten, P. Stereotaxic gene delivery in the rodent brain. Nature Protocols. 1 (6), 3166-3173 (2006).
- Segev, A., Garcia-Oscos, F., Kourrich, S. Whole-cell patch-clamp recordings in brain slices. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (112), (2016).
- Booker, S. A. Preparing acute brain slices from the dorsal pole of the hippocampus from adult rodents. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (163), (2020).
- Anderson, W. W., Collingridge, G. L. Capabilities of the WinLTP data acquisition program extending beyond basic LTP experimental functions. Journal of Neuroscience Methods. 162 (1-2), 346-356 (2007).
- Basu, J., et al. Gating of hippocampal activity, plasticity, and memory by entorhinal cortex long-range inhibition. Science. 351 (6269), (2016).
- Zhang, Y. P., Oertner, T. G. Optical induction of synaptic plasticity using a light-sensitive channel. Nature Methods. 4 (2), 139-141 (2007).
- Banks, P. J., Warburton, E. C., Bashir, Z. I. Plasticity in prefrontal cortex induced by coordinated synaptic transmission arising from reuniens/rhomboid nuclei and hippocampus. Cerebral Cortex Communications. 2 (2), (2021).
- Petreanu, L., Mao, T., Sternson, S. M., Svoboda, K. The subcellular organization of neocortical excitatory connections. Nature. 457 (7233), 1142-1145 (2009).
- Swietek, B., Gupta, A., Proddutur, A., Santhakumar, V. Immunostaining of biocytin-filled and processed sections for neurochemical markers. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (118), (2016).
- Jones, B. F., Witter, M. P. Cingulate cortex projections to the parahippocampal region and hippocampal formation in the rat. Hippocampus. 17 (10), 957-976 (2007).
- Anastasiades, P. G., Collins, D. P., Carter, A. G. Mediodorsal and ventromedial thalamus engage distinct L1 circuits in the prefrontal cortex. Neuron. 109 (2), 314-330 (2021).
- Prakash, R., et al. Two-photon optogenetic toolbox for fast inhibition, excitation and bistable modulation. Nature Methods. 9 (12), 1171-1179 (2012).
- Mattis, J., et al. Principles for applying optogenetic tools derived from direct comparative analysis of microbial opsins. Nature Methods. 9 (2), 159-172 (2011).
- Klapoetke, N. C., et al. Independent optical excitation of distinct neural populations. Nature Methods. 11 (3), 338-346 (2014).
- Hochbaum, D. R., et al. All-optical electrophysiology in mammalian neurons using engineered microbial rhodopsins. Nature Methods. 11 (8), 825-833 (2014).
- Ting, J. T., Daigle, T. L., Chen, Q., Feng, G. Acute brain slice methods for adult and aging animals: application of targeted patch clamp analysis and optogenetics. Methods in Molecular Biology. 1183, 221-242 (2014).
- Marshel, J. H., et al. Cortical layer-specific critical dynamics triggering perception. Science. 365 (6453), (2019).
- Castle, M. J., Gershenson, Z. T., Giles, A. R., Holzbaur, E. L., Wolfe, J. H. Adeno-associated virus serotypes 1, 8, and 9 share conserved mechanisms for anterograde and retrograde axonal transport. Human Gene Therapy. 25 (8), 705-720 (2014).
- Aschauer, D. F., Kreuz, S., Rumpel, S. Analysis of transduction efficiency, tropism and axonal transport of AAV serotypes 1, 2, 5, 6, 8 and 9 in the mouse brain. PLoS One. 8 (9), 76310 (2013).
- Nathanson, J. L., Yanagawa, Y., Obata, K., Callaway, E. M. Preferential labeling of inhibitory and excitatory cortical neurons by endogenous tropism of adeno-associated virus and lentivirus vectors. Neuroscienze. 161 (2), 441-450 (2009).
- Dimidschstein, J., et al. A viral strategy for targeting and manipulating interneurons across vertebrate species. Nature Neuroscience. 19 (12), 1743-1749 (2016).
- Lavin, T. K., Jin, L., Lea, N. E., Wickersham, I. R. Monosynaptic tracing success depends critically on helper virus concentrations. Frontiers in Synaptic Neuroscience. 12, 6 (2020).
- Paxinos, G., Watson, C. . The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. 7th edn. , (2013).
- Paxinos, G., Franklin, K. B. J. . Paxinos and Franklin’s the Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates, Compact. 5th edn. , (2019).
- Nabavi, S., et al. Engineering a memory with LTD and LTP. Nature. 511 (7509), 348-352 (2014).
- Jackman, S. L., Beneduce, B. M., Drew, I. R., Regehr, W. G. Achieving high-frequency optical control of synaptic transmission. Journal of Neuroscience. 34 (22), 7704-7714 (2014).
- Xia, S. H., et al. Cortical and Thalamic Interaction with Amygdala-to-Accumbens Synapses. Journal of Neuroscience. 40 (37), 7119-7132 (2020).
- Anisimova, M., et al. Spike-timing-dependent plasticity rewards synchrony rather than causality. BioRxiv. , (2021).
- Takeuchi, T., et al. Locus coeruleus and dopaminergic consolidation of everyday memory. Nature. 537 (7620), 357-362 (2016).
