Ex Vivo Оптогенетический опрос дальней синаптической передачи и пластичности от медиальной префронтальной коры к латеральной энторинальной коре
Summary
Здесь мы представляем протокол, описывающий вирусную трансдукцию дискретных областей мозга с оптогенетическими конструкциями, позволяющими синапсеспецифическую электрофизиологическую характеристику в острых срезах мозга грызунов.
Abstract
Изучение физиологических свойств специфических синапсов в мозге и того, как они претерпевают пластические изменения, является ключевой задачей в современной нейробиологии. Традиционные электрофизиологические методы in vitro используют электрическую стимуляцию, чтобы вызвать синаптическую передачу. Основным недостатком данного метода является его неспецифический характер; все аксоны в области стимулирующего электрода будут активированы, что затруднит приписывание эффекта конкретному афферентному соединению. Эту проблему можно преодолеть, заменив электрическую стимуляцию оптогенетической стимуляцией. Описан метод сочетания оптогенетики с записями патч-зажимов in vitro . Это мощный инструмент для изучения как базальной синаптической передачи, так и синаптической пластичности точных анатомически определенных синаптических связей и применим практически к любому пути в головном мозге. Здесь мы описываем подготовку и обработку вирусного вектора, кодирующего канально-мозговой белок, для хирургической инъекции в пресинаптическую область, представляющую интерес (медиальную префронтальную кору) в мозге грызунов и создание острых срезов нисходящих целевых областей (латеральная энторинальная кора). Также представлена подробная процедура комбинирования записей патч-зажима с синаптической активацией путем световой стимуляции для изучения краткосрочной и долгосрочной синаптической пластичности. Мы обсуждаем примеры экспериментов, которые достигают специфичности пути и клеток путем объединения оптогенетики и cre-зависимой маркировки клеток. Наконец, гистологическое подтверждение пресинаптической области, представляющей интерес, описано вместе с маркировкой биоцитина постсинаптической клетки, чтобы обеспечить дальнейшую идентификацию точного местоположения и типа клетки.
Introduction
Понимание физиологии синапсов и того, как они претерпевают пластические изменения, имеет основополагающее значение для понимания того, как мозговые сети функционируют в здоровом мозге1 и как они неисправны при расстройствах мозга. Использование острых срезов мозга ex vivo позволяет регистрировать электрическую активность синапсов от одиночных нейронов с высоким отношением сигнал/шум с использованием записей цельноклеточных патч-зажимов. Контроль мембранного потенциала и простые фармакологические манипуляции позволяют выделить подтипы рецепторов. Эти записи могут быть сделаны с изысканной специфичностью для идентификации постсинаптического нейрона, включая ламинарное и субрегиональное положение2, клеточную морфологию3, наличие молекулярных маркеров4, его афферентные проекции5 или даже если он был недавно активным6.
Достижение специфичности пресинаптических входов, однако, несколько сложнее. Традиционный метод использует стимулирующие электроды для возбуждения аксонов, которые работают в определенной пластине. Примером этого является гиппокамп, где локальная стимуляция в радиатном слое активирует синапсы, которые проецируются из CA3 в подполе CA17. В этом случае достигается пресинаптическая специфичность, поскольку вход CA3 представляет собой единственный возбуждающий вход, расположенный внутри радиатного слоя, который проецируется на пирамидальные ячейки CA18. Однако эта высокая степень входной специфичности, достижимая при обычной электрической пресинаптической активации аксонов CA3-CA1, является исключением, которое отражено в интенсивном исследовании, которому подвергался этот синапс. В других областях мозга аксоны из нескольких афферентных путей сосуществуют в одной и той же пластинке, например, в слое 1 неокортекса9, что делает невозможной пресинаптическую стимуляцию с помощью обычных стимулирующих электродов. Это проблематично, поскольку различные синаптические входы могут иметь расходящиеся физиологические свойства; поэтому их стимуляция может привести к неправильной характеристике синаптической физиологии.
Появление оптогенетики, генетического кодирования фоточувствительных мембранных белков (опсинов), таких как каналродопсин-2 (ChR2), позволило значительно расширить возможности для изучения изолированных синаптических проекций между областями мозга10,11. Здесь мы описываем обобщающее и недорогое решение для изучения долгосрочной синаптической физиологии и пластичности. Оптогенетические конструкции доставляются очень специфическим образом с использованием вирусных векторов, что позволяет чрезвычайно точно контролировать пресинаптическую область, представляющую интерес. Эфферентные проекции будут выражать светоактивированный канал, позволяющий активировать эти волокна в целевой области. Таким образом, могут быть изучены дальние, анатомически диффузные пути, которые не могут быть независимо активированы традиционной, неспецифической, электрической стимуляцией.
В качестве примера мы описываем трансдукцию медиальной префронтальной коры (mPFC) аденоассоциированными вирусами (AAV), кодирующими возбуждающие катион-канальные опсины. Затем мы описываем подготовку острых срезов из латеральной энторинальной коры (LEC), записей зажимов из пирамидных нейронов LEC слоя 5 и световой активации глутаматергических проекций mPFC-LEC (рисунок 1). Мы также описываем гистологическую оценку места инъекции для подтверждения местоположения пресинаптической области, представляющей интерес, и идентификации морфологии постсинаптических клеток.
Protocol
Representative Results
Discussion
Протокол, представленный здесь, описывает метод исследования высокоспецифичных синаптических проекций дальнего действия с использованием комбинации стереотаксической хирургии для доставки AAV, кодирующих оптогенетические конструкции, и электрофизиологии в острых срезах мозга (<strong …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа поддерживается грантом Wellcome 206401/Z/17/Z. Мы хотели бы поблагодарить Зафара Башира за его экспертное наставничество и доктора Клэра Бута за техническую помощь и комментарии к рукописи.
Materials
| 0.2 mL tube | Fisher Scientific Ltd | 12134102 | |
| 10 µL pipette | Gilson | FD10001 | |
| 24 well plate | SARSTEDT | 83.3922 | |
| 3 way luer valve | Cole-Parmer | WZ-30600-02 | |
| 3,3′-Diaminobenzidine (DAB) substrate | Vector Laboratories | SK-4105 | |
| 40x objective | Olympus | LUMPLFLN40XW | |
| 4-aminopyridine | Hello Bio | HB1073 | |
| 4x objective | Olympus | PLN4X/0.1 | |
| AAV9-CaMKiia-hChR2(E123T/T159C)-mCherry | Addgene | 35512 | Viral titre: 3.3×1013 GC/ml |
| Achromatic lens | Edmund Optics | 49363 | Focusses visual spectrum and near-IR |
| Benchtop microcentrifuge | Benchmark Scientific | C1005* | |
| Biocytin | Sigma-Aldrich | B4261 | |
| Borosillicate glass capillary | Warner Instruments | G150F-6 | |
| Burr | Fine science tools | 19008-07 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C5670 | |
| Camera – Qimaging Retiga Electro | Photometrics | 01-ELECTRO-M-14-C | |
| Carbachol | Tocris | 2810 | |
| Chlorhexidine surgical scrub | Vetasept | XHG008 | |
| Clippers | Andis | 22445 | AGC Super 2-Speed Detachable Blade Clipper |
| Collimation condenser lens | ThorLabs | ACL2520-A | |
| Coverslips | Fisher Scientific Ltd | 10011913 | |
| Cryostat | Leica | CM3050 S | |
| CsMeSO4 | Sigma-Aldrich | C1426 | |
| Cyanoacrylate glue | Rapid Electronics Ltd | 84-4557 | |
| Data acquisition device | National Instruments | USB-6341 BNC | |
| D-glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| Dichroic mirror 500 nm long-pass | Edmund Optics | 69899 | |
| Dichroic mirror 600 nm long-pass | Edmund Optics | 69901 | |
| Dichroic mirror cube | ThorLabs | CM1-DCH/M | |
| EGTA | Millpore | 324626 | |
| Electrode holder with side port | HEKA | 895150 | |
| Emission filter | Chroma | 59022m | |
| Excitation filter | Chroma | ET570/20x | |
| Eye gel | Dechra | Lubrithal | |
| Fine paint brush | Scientific Laboratory Supplies | BRU2052 | |
| Guillotine | World Precision Instruments | DCAP | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Hydrogen peroxide solution | Sigma-Aldrich | H1009 | 30% (w/w) |
| Isoflurane | Henry Schein | 988-3245 | |
| Isopentane | Sigma-Aldrich | M32631 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| k-gluconate | Sigma-Aldrich | G4500 | |
| Kinematic fluorescence filter cube | ThorLabs | DFM1T1 | |
| LED driver | ThorLabs | LEDD1B | |
| Lidocaine ointment | Teva | 80007150 | |
| MgATP | Sigma-Aldrich | A9187 | |
| MgCl | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | M7506 | |
| Micro drill | Harvard Apparatus | 75-1887 | |
| Microelectrode puller | Sutter instruments | P-87 | |
| Microinjection syringe | Hamilton | 7634-01/00 | |
| Microinjection syringe needle | Hamilton | 7803-05 | Custom specification: gauge 33, length 15mm, point style 4 – 12° |
| Microinjection syringe pump | World Precision Instruments | UMP3T-1 | |
| Mounted blue LED | ThorLabs | M470L5 | |
| Mounted green LED | ThorLabs | M565L3 | |
| Na2HPO4.7H2O | Sigma-Aldrich | S9390 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| NaGTP | Sigma-Aldrich | G8877 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S0751 | |
| NaH2PO4.H2O | Sigma-Aldrich | S9638 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| NIR LED | OSRAM | SFH4550 | Used for refracted IR imaging of slice, differential interference contrast (DIC) optics is another commonly used method |
| OCT medium | VWR International | RAYLLAMB/OCT | Optimal cutting temperature medium |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Patch clamp amplifier | Molecular Devices | 700A | |
| Peristaltic pump | World Precision Instruments | Ministar | |
| Poly-L-lysine coated microscope slides | Fisher Scientific Ltd | 23-769-310 | |
| Recording chamber | Warner Instruments | RC-26G | |
| Scalpel blade | Swann Morton | #24 | |
| Slice anchor | Warner Instruments | SHD-26-GH/15 | |
| Stereotaxic frame | Kopf | Model 902 | |
| Stereotaxic holder for micro drill | Harvard Apparatus | 75-1874 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| Surgical Microscope | Carl Zeiss | OPMI 1 FR pro | |
| Suture | Ethicon | W577H | |
| Syringe filter for intracellular recording solution | Thermo Scientific Nalgene | 171-0020 | |
| Tetrodotoxin citrate | Hello Bio | HB1035 | |
| Transfer pipettes | Fisher Scientific Ltd | 10458842 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Upright fluorescence microscope | Leica | DM6 B | |
| VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200-10 | |
| VECTASTAIN ABC-HRP kit | Vector Laboratories | PK-4000 | |
| Vibratome | Campden Instruments | 7000smz-2 | |
| WinLTP | https://www.winltp.com/ | Version 2.32 | Data acquisition software |
| Solution | |||
| aCSF | |||
| sucrose cutting solution | |||
| PFA | |||
| Intracellular? |
Riferimenti
- Martin, S., Grimwood, P., Morris, R. Synaptic plasticity and memory: an evaluation of the hypothesis. Annual Review of Neuroscience. 23, 649-711 (2000).
- Poorthuis, R. B., et al. Layer-specific modulation of the prefrontal cortex by nicotinic acetylcholine receptors. Cerebral Cortex. 23 (1), 148-161 (2013).
- Scala, F., et al. Layer 4 of mouse neocortex differs in cell types and circuit organization between sensory areas. Nature Communications. 10 (1), 4174 (2019).
- Nassar, M., et al. Diversity and overlap of parvalbumin and somatostatin expressing interneurons in mouse presubiculum. Frontiers in Neural Circuits. 9, 20 (2015).
- Dembrow, N. C., Chitwood, R. A., Johnston, D. Projection-specific neuromodulation of medial prefrontal cortex neurons. Journal of Neuroscience. 30 (50), 16922-16937 (2010).
- Whitaker, L. R., et al. Bidirectional modulation of intrinsic excitability in rat prelimbic cortex neuronal ensembles and non-ensembles after operant learning. Journal of Neuroscience. 37 (36), 8845-8856 (2017).
- Skrede, K. K., Westgaard, R. H. The transverse hippocampal slice: a well-defined cortical structure maintained in vitro. Brain Research. 35 (2), 589-593 (1971).
- van Strien, N. M., Cappaert, N. L., Witter, M. P. The anatomy of memory: an interactive overview of the parahippocampal-hippocampal network. Nature Reviews Neuroscience. 10 (4), 272-282 (2009).
- Cruikshank, S. J., et al. Thalamic control of layer 1 circuits in prefrontal cortex. Journal of Neuroscience. 32 (49), 17813-17823 (2012).
- Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nature Neuroscience. 8 (9), 1263-1268 (2005).
- Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (24), 13940-13945 (2003).
- Berndt, A., et al. High-efficiency channelrhodopsins for fast neuronal stimulation at low light levels. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (18), 7595-7600 (2011).
- Cetin, A., Komai, S., Eliava, M., Seeburg, P. H., Osten, P. Stereotaxic gene delivery in the rodent brain. Nature Protocols. 1 (6), 3166-3173 (2006).
- Segev, A., Garcia-Oscos, F., Kourrich, S. Whole-cell patch-clamp recordings in brain slices. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (112), (2016).
- Booker, S. A. Preparing acute brain slices from the dorsal pole of the hippocampus from adult rodents. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (163), (2020).
- Anderson, W. W., Collingridge, G. L. Capabilities of the WinLTP data acquisition program extending beyond basic LTP experimental functions. Journal of Neuroscience Methods. 162 (1-2), 346-356 (2007).
- Basu, J., et al. Gating of hippocampal activity, plasticity, and memory by entorhinal cortex long-range inhibition. Science. 351 (6269), (2016).
- Zhang, Y. P., Oertner, T. G. Optical induction of synaptic plasticity using a light-sensitive channel. Nature Methods. 4 (2), 139-141 (2007).
- Banks, P. J., Warburton, E. C., Bashir, Z. I. Plasticity in prefrontal cortex induced by coordinated synaptic transmission arising from reuniens/rhomboid nuclei and hippocampus. Cerebral Cortex Communications. 2 (2), (2021).
- Petreanu, L., Mao, T., Sternson, S. M., Svoboda, K. The subcellular organization of neocortical excitatory connections. Nature. 457 (7233), 1142-1145 (2009).
- Swietek, B., Gupta, A., Proddutur, A., Santhakumar, V. Immunostaining of biocytin-filled and processed sections for neurochemical markers. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (118), (2016).
- Jones, B. F., Witter, M. P. Cingulate cortex projections to the parahippocampal region and hippocampal formation in the rat. Hippocampus. 17 (10), 957-976 (2007).
- Anastasiades, P. G., Collins, D. P., Carter, A. G. Mediodorsal and ventromedial thalamus engage distinct L1 circuits in the prefrontal cortex. Neuron. 109 (2), 314-330 (2021).
- Prakash, R., et al. Two-photon optogenetic toolbox for fast inhibition, excitation and bistable modulation. Nature Methods. 9 (12), 1171-1179 (2012).
- Mattis, J., et al. Principles for applying optogenetic tools derived from direct comparative analysis of microbial opsins. Nature Methods. 9 (2), 159-172 (2011).
- Klapoetke, N. C., et al. Independent optical excitation of distinct neural populations. Nature Methods. 11 (3), 338-346 (2014).
- Hochbaum, D. R., et al. All-optical electrophysiology in mammalian neurons using engineered microbial rhodopsins. Nature Methods. 11 (8), 825-833 (2014).
- Ting, J. T., Daigle, T. L., Chen, Q., Feng, G. Acute brain slice methods for adult and aging animals: application of targeted patch clamp analysis and optogenetics. Methods in Molecular Biology. 1183, 221-242 (2014).
- Marshel, J. H., et al. Cortical layer-specific critical dynamics triggering perception. Science. 365 (6453), (2019).
- Castle, M. J., Gershenson, Z. T., Giles, A. R., Holzbaur, E. L., Wolfe, J. H. Adeno-associated virus serotypes 1, 8, and 9 share conserved mechanisms for anterograde and retrograde axonal transport. Human Gene Therapy. 25 (8), 705-720 (2014).
- Aschauer, D. F., Kreuz, S., Rumpel, S. Analysis of transduction efficiency, tropism and axonal transport of AAV serotypes 1, 2, 5, 6, 8 and 9 in the mouse brain. PLoS One. 8 (9), 76310 (2013).
- Nathanson, J. L., Yanagawa, Y., Obata, K., Callaway, E. M. Preferential labeling of inhibitory and excitatory cortical neurons by endogenous tropism of adeno-associated virus and lentivirus vectors. Neuroscienze. 161 (2), 441-450 (2009).
- Dimidschstein, J., et al. A viral strategy for targeting and manipulating interneurons across vertebrate species. Nature Neuroscience. 19 (12), 1743-1749 (2016).
- Lavin, T. K., Jin, L., Lea, N. E., Wickersham, I. R. Monosynaptic tracing success depends critically on helper virus concentrations. Frontiers in Synaptic Neuroscience. 12, 6 (2020).
- Paxinos, G., Watson, C. . The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. 7th edn. , (2013).
- Paxinos, G., Franklin, K. B. J. . Paxinos and Franklin’s the Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates, Compact. 5th edn. , (2019).
- Nabavi, S., et al. Engineering a memory with LTD and LTP. Nature. 511 (7509), 348-352 (2014).
- Jackman, S. L., Beneduce, B. M., Drew, I. R., Regehr, W. G. Achieving high-frequency optical control of synaptic transmission. Journal of Neuroscience. 34 (22), 7704-7714 (2014).
- Xia, S. H., et al. Cortical and Thalamic Interaction with Amygdala-to-Accumbens Synapses. Journal of Neuroscience. 40 (37), 7119-7132 (2020).
- Anisimova, M., et al. Spike-timing-dependent plasticity rewards synchrony rather than causality. BioRxiv. , (2021).
- Takeuchi, T., et al. Locus coeruleus and dopaminergic consolidation of everyday memory. Nature. 537 (7620), 357-362 (2016).
