JoVE Journal > Neuroscience
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Risultati
Discussion
Divulgazioni
Acknowledgements
Materials
Riferimenti
Traduzione automatica
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Neuroscienze

Caenorhabditis elegans كنظام نموذجي لاكتشاف المركبات النشطة بيولوجيا ضد السمية العصبية بوساطة البولي جلوتامين

Published: September 21, 2021
doi:
10.3791/63081
, , , , , ,
1Institute for Food Nutrition and Human Health, School of Food Science and Engineering,South China University of Technology, 2School of Bioscience and Bioengineering,Hebei University of Economics and Business, 3Perfect Life & Health Institute

Summary

هنا ، نقدم بروتوكولا لتقييم أنشطة الحماية العصبية لمركبات الاختبار في Caenorhabditis elegans ، بما في ذلك تجميع polyglutamine ، وموت الخلايا العصبية ، وسلوك تجنب العلاج الكيميائي ، بالإضافة إلى تكامل مثالي للأنماط الظاهرية المتعددة.

Abstract

سوء الطي المرتبط بالعمر وتجميع البروتينات المسببة للأمراض هي المسؤولة عن العديد من الأمراض العصبية التنكسية. على سبيل المثال ، مرض هنتنغتون (HD) مدفوع بشكل أساسي بتكرار نيوكليوتيد CAG الذي يشفر قناة الجلوتامين الموسعة في بروتين هنتنغتين. وبالتالي ، فإن تثبيط تراكم polyglutamine (polyQ) ، وعلى وجه الخصوص ، السمية العصبية المرتبطة بالتجميع هو استراتيجية مفيدة للوقاية من HD وغيرها من الحالات المرتبطة ب polyQ. يقدم هذا البحث بروتوكولات تجريبية معممة لتقييم القدرة على الحماية العصبية لمركبات الاختبار ضد HD باستخدام نماذج Caenorhabditis elegans المعدلة وراثيا متعددة الأضلاع الراسخة. يتم اختيار سلالة AM141 لفحص تجميع polyQ كنمط ظاهري مرتبط بالعمر من المجاميع الفلورية المنفصلة يمكن ملاحظته بسهولة في جدار جسمه في مرحلة البلوغ بسبب التعبير الخاص بالعضلات عن بروتينات الاندماج polyQ::YFP. في المقابل ، يتم استخدام نموذج HA759 مع التعبير القوي عن المسالك الموسعة polyQ في الخلايا العصبية ASH لفحص موت الخلايا العصبية وسلوك تجنب الكيميائي. لتقييم شامل لقدرة الحماية العصبية للمركبات المستهدفة ، يتم تقديم نتائج الاختبار المذكورة أعلاه في النهاية كمخطط راداري مع تنميط الأنماط الظاهرية المتعددة بطريقة المقارنة المباشرة والمشاهدة المباشرة.

Introduction

يتضمن التنكس العصبي التدريجي في HD هنتينجتين المتحور المسبب للأمراض مع امتداد غير طبيعي من polyQ مشفر بواسطة CAG ثلاثي النوكليوتيد يكرر1،2،3. بروتينات هنتينجتين الطافرة التي تحتوي على أكثر من 37 تكرارا للجلوتامين عرضة للتجميع والتراكم في أدمغة مرضى HD والنماذج الحيوانية 4,5 ، مما يؤدي في النهاية إلى التنكس العصبي6. على الرغم من عدم الوضوح بشأن أدوار مجاميع polyQ في علم أمراض الأمراض5 ، فإن تثبيط تراكم polyQ والسمية المرتبطة به هو استراتيجية علاجية مفيدة ل HD وأمراض polyQ الأخرى 4,7,8.

نظرا للحفظ في مسارات الإشارات العصبية ونماذج الأمراض المعدلة وراثيا سهلة البناء ، تم استخدام Caenorhabditis elegans على نطاق واسع ككائن حي نموذجي رئيسي للتحقيق في الاضطرابات العصبية9،10،11،12. على سبيل المثال ، يمكن لنماذج C. elegans المعدلة وراثيا التي تعبر عن توسعات polyQ المعرضة للتجميع أن تحاكي بشكل موضوعي ميزات تشبه HD مثل فقدان الخلايا العصبية الانتقائي ، وتكوين المجموع السيتوبلازمي ، والعيوب السلوكية13. وقد أدى التحقيق في الآثار المحتملة لعينات الاختبار لعكس هذه الأنماط الظاهرية في نماذج الديدان الخيطية متعددة الكيماويات الراسخة إلى تحديد مجموعة متنوعة من المرشحين العلاجيين الواعدين ، على سبيل المثال ، السكريات المتعددة7،14،15 ، السكريات القليلة16 ، الجزيئات الصغيرة الطبيعية17،18 ، والمستخلصات والصيغ العشبية19،20.

فيما يلي نموذجان رئيسيان ل polyQ C. elegans وبروتوكولات ذات صلة بالتطبيقات المحتملة كما يتضح من الدراسة على استراغالان ، وهو عديد السكاريد المعزول من Astragalus membranaceus7. بالنسبة لفحص تجميع polyQ في C. elegans ، فإن النموذج المستخدم هو السلالة المعدلة وراثيا AM141 ، والتي تظهر بونكتا فلورسنت مشتتة في عضلة جدار الجسم عند الوصول إلى مرحلة البلوغ بسبب التعبير عن بروتين الانصهار Q40::YFP ، وهو مسار polyQ من 40 بقايا (polyQ40) تنصهر في البروتين الفلوري الأصفر (YFP)21,22 . تم استخدام السلالة HA759 لفحص سلوك البقاء على قيد الحياة العصبية وتجنب العلاج الكيميائي لأنها تعبر عن كل من بروتين الفلورسنت الأخضر (GFP) و Htn-Q150 (وهو مسار polyQ مشتق من الصيد البشري من 150 بقايا) بقوة في الخلايا العصبية ASH ولكن بشكل ضعيف في الخلايا العصبية الأخرى ، مما أدى إلى تنكس عصبي تدريجي وموت خلايا ASH 7,13. يتم توفير ملخص شامل للإمكانات العصبية للمرشحين العلاجيين من خلال دمج النتائج من الفحوصات المختلفة.

Protocol

ملاحظة: راجع الجدول 1 للاطلاع على وصفات الحلول المستخدمة في هذا البروتوكول. 1. إعداد المواد اللازمة لفحص Caenorhabditis elegans صيانة سلالات C. elegans احصل على سلالات C. elegans (AM141 و HA759) والإشريكية القولونية (OP50 و NA22) (انظر جدول المواد). حافظ على الديدان الخيطية على صفيحة وسائط نمو الديدان الخيطية (NGM) المزروعة بالإشريكية القولونية OP50 عند 20 درجة مئوية ل AM14121 أو 15 درجة مئوية ل HA75923. تحضير ثقافة بكتيريا E. coli OP50 اختر مستعمرة واحدة من E. coli OP50 من لوحة خط Luria-Bertani (LB) وقم بتلقيحها في 50 مل من ثقافة LB السائلة. احتضن بكتيريا OP50 في شاكر عند 37 درجة مئوية و 200 دورة في الدقيقة حتى كثافة بصرية ~ 0.5 عند 570 نانومتر (OD570). تخزين الثقافة البكتيرية OP50 في 4 درجة مئوية واستخدامها في غضون أسبوعين. تحضير ألواح NGM مع بكتيريا OP50 أضف 20 جم من الأجار و 2.5 جم من الببتون و 3.0 جم من كلوريد الصوديوم و 975 مل من الماء منزوع الأيونات إلى زجاجة قابلة للتعقيم سعة 1 لتر. الأوتوكلاف عند 121 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. ضع زجاجة أجار NGM السائلة على المقعد لتبرد إلى ~ 60 درجة مئوية ، ثم أضف محاليل المخزون المعقمة التالية: 1 مل من 1 M CaCl2 ، و 1 مل من 1 M MgSO4 ، و 1 مل من 5 mg / mL cholesterol ، و 25 مل من 1 M فوسفات البوتاسيوم (الرقم الهيدروجيني 6.0). صب 20 مل من NGM في طبق بتري معقم 90 مم ، واترك الأطباق على المقعد لتبرد وتصلب. الحفاظ على لوحات رأسا على عقب والسماح لهم لتجف على مقاعد البدلاء في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 أيام. وزع 200 ميكرولتر من المستزرعة البكتيرية OP50 على كل صفيحة NGM وانتشر بالتساوي باستخدام قضيب طلاء زجاجي معقم. أغلق الأغطية واحتضن الألواح بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية. قم بتخزين ألواح NGM المزروعة ب OP50 في صندوق بلاستيكي مع غطاء في درجة حرارة الغرفة واستخدمها في غضون أسبوعين. إعداد سكان C. elegans المتزامنين مع العمر اجمع الديدان الخيطية البالغة الوراثية في أنبوب طرد مركزي دقيق معقم سعة 1.5 مل وأجهزة طرد مركزي بسرعة 1000 × جم لمدة دقيقة واحدة. اغسل ثلاث مرات وأعد تعليق الديدان الخيطية في المخزن المؤقت M9. أضف حجما متساويا من محلول التبييض وحرك بلطف لمدة 3-5 دقائق. راقب التبييض كل 15 ثانية تحت مجهر تشريح.ملاحظة: يجب تحضير محلول التبييض طازجا قبل الاستخدام عن طريق خلط كميات متساوية من 10٪ NaOCl و 1 M NaOH (الجدول 1)20. بمجرد كسر معظم الديدان الخيطية ، أوقف عملية الهضم عن طريق التخفيف باستخدام المخزن المؤقت M9. جهاز طرد مركزي بسرعة لإزالة supernatant وإعادة تعليق الكريات في المخزن المؤقت M9 لتكرار الغسيل ثلاث مرات. أعد تعليق الكريات في وسط S. دع بقايا الديدان الخيطية تستقر عن طريق الجاذبية لمدة 2-3 دقائق بينما يبقى البيض في السوبرناتانت. شفط supernatant في أنبوب جديد معقم microcentrigege. جمع البيض عن طريق الطرد المركزي في 1000 × غرام لمدة 1 دقيقة. تخلص من ~ 80٪ من supernatant ونقل البيض إلى قارورة معقمة تحتوي على 20 مل من S المتوسطة. ضع القارورة في شاكر واحتضن البيض طوال الليل بدون طعام عند 120 دورة في الدقيقة للحصول على نيماتودا L1 متزامنة. 2. فحص تجميع PolyQ تحضير الديدان الخيطية لفحص تجميع polyQ نقل 300-500 يرقات L1 متزامنة من AM141 إلى كل بئر من صفيحة 48 بئرا مع 500 ميكرولتر من وسط S يحتوي على OP50 (OD570 من 0.7-0.8) و 5 ملغ / مل من استراغالان ، وعادة ما يكون بئر واحد لكل علاج لنقطة زمنية واحدة. أغلق اللوحة باستخدام البارافيلم واحتضنها عند 20 درجة مئوية و 120 دورة في الدقيقة لمدة 24 و 48 و 72 و 96 ساعة. حصاد الديدان الخيطية في أنبوب جهاز طرد مركزي دقيق معقم 1.5 مل وغسلها باستخدام المخزن المؤقت M9 >3 مرات عن طريق الطرد المركزي (1000 × غرام لمدة دقيقة واحدة) لإزالة OP50 المتبقية. أعد تعليق الديدان الخيطية AM141 في المخزن المؤقت M9، واجعلها جاهزة للحصول على الصور. الحصول على صور الفلورسنت وتحليل البياناتملاحظة: يتم تحليل البيانات تلقائيا باستخدام نظام التصوير عالي المحتوى هذا. في حالة عدم توفر جهاز تصوير آلي، يمكن استخدام طريقة تقليدية لإعداد لوحة الأغاروز للحصول على الصور لتحقيق أداء مماثل باستخدام مجهر فلورسنت شائع7،15،17 (انظر الخطوتين 3.2 و 3.3). انقل 10-15 ديدان خيطية إلى كل بئر في صفيحة 384 بئرا (الحجم النهائي 80 ميكرولتر لكل بئر). تعيين 10 آبار مكررة لكل علاج. أضف 10 ميكرولتر من 200 مللي متر من أزيد الصوديوم إلى كل بئر لشل الديدان الخيطية والسماح لها بالاستقرار في القاع (5-10 دقائق). ضع اللوحة في نظام تصوير عالي المحتوى للحصول على صور فلورسنت (انظر جدول المواد للحصول على معلومات الجهاز والبرامج). افتح برنامج الحصول على الصور وقم بإعداد المعلمات التالية. افتح نافذة إعداد اكتساب اللوحة وقم بإنشاء مجموعة تجارب جديدة واسمها. حدد التكبير ك 2x، وربط الكاميرا ك 1، ونوع اللوحة كلوحة 384 بئر. تعيين الآبار والمواقع (موقع واحد) لزيارتها. حدد مرشح إيزوثيوسيانات الفلوريسين (FITC) وقم بتمكين خيارات التركيز البؤري المستندة إلى الصورة. اضبط التعريض الضوئي على 300 مللي ثانية.ملاحظة: يمكن اختبار الإعدادات المذكورة أعلاه وتعديلها لتحسين معلمات التصوير. احفظ إعدادات الحصول على الصور وانقر على زر الحصول على لوحة لتشغيلها. تحليل بيانات الصورة باستخدام برنامج تحليل الصور. افتح نافذة مراجعة بيانات اللوحة وحدد لوحة الاختبار لتحليل الصور. انقر نقرا مزدوجا فوق بئر اختبار لعرض صورته. حدد نوى العد كطريقة تحليل وانقر فوق الزر تكوين الإعدادات لإخراج نافذة للإعدادات التالية. حدد الصورة المصدر من قناة FITC وحدد الخوارزمية القياسية. اضبط معلمات تحليل الصور على النحو التالي: الحد الأدنى التقريبي للعرض = 10 ميكرومتر (= 2 بكسل) ؛ الحد الأقصى التقريبي للعرض = 50 ميكرومتر (= 12 بكسل) ؛ الكثافة فوق الخلفية المحلية = 1000-2000 مستوى رمادي. اختبر الإعدادات الحالية لتحسين طريقة التحليل. حفظ الإعدادات وتشغيل التحليل على جميع الآبار.ملاحظة: يستغرق الأمر حوالي 20 دقيقة لإنهاء التحليل للوحة واحدة من 384 بئرا. تصدير إجمالي النوى كإجمالي عدد مجاميع Q40::YFP في كل بئر. عد عدد الديدان الخيطية في كل بئر. احسب متوسط عدد مجاميع Q40::YFP لكل ديدان خيطية في كل مجموعة، وطبق منحنى غير خطي يتناسب مع البيانات من كل نقطة زمنية. احسب مؤشر التثبيط باستخدام eq (1) أدناه:مؤشر التثبيط = (1)حيث تكونعينة N وعينة N هي متوسط عدد مجاميع Q40::YFP في مجموعتي التحكم والعلاج ، على التوالي. 3. مقايسات السمية العصبية بوساطة PolyQ علاج C. elegans بعينات اختبار لإعداد الديدان الخيطية لفحص السمية العصبية polyQ ، انقل 300-500 يرقات L1 المتزامنة من HA759 إلى كل بئر من صفيحة 48 بئرا مع 500 ميكرولتر من وسط S يحتوي على OP50 (OD570 من 0.7-0.8) و 5 ملغ / مل من أستراغالان ، وعادة ما تكون ثلاثة آبار مكررة لكل علاج. ختم اللوحة مع parafilm وحضانتها عند 15 درجة مئوية و 120 دورة في الدقيقة لمدة 3 أيام23. جمع الديدان الخيطية عن طريق الطرد المركزي وغسل 3-5 مرات مع المخزن المؤقت M9. أعد تعليق الديدان الخيطية في المخزن المؤقت M9 لاستخدامها في اختبارات البقاء على قيد الحياة وتجنب الخلايا العصبية. تحضير وسادة الأغاروز أضف 2 غرام من الأغاروز إلى 100 مل من المخزن المؤقت M9 (2٪ ، ث / v) وقم بتسخين محلول الأغاروز في الميكروويف حتى يقترب من الغليان. قم بتوزيع 0.5 مل من الأغاروز المذاب على وسط شريحة زجاجية مجهرية بسماكة 1 مم موضوعة بين قطعتين من الألواح الزجاجية بسمك 2 مم. يغطى بشريحة أخرى عموديا. بمجرد أن يبرد الأغاروز ويتصلب ، قم بإزالة الشريحة العلوية برفق. اختبار البقاء على قيد الحياة العصبية ASH أضف قطرة من 20 مللي متر من أزيد الصوديوم على وسادة الأغاروز. نقل 15-20 الديدان الخيطية HA759 إلى أسفل لشل حركتها. ضع غطاء بلطف فوق الديدان الخيطية. احتفظ بالانزلاق تحت مجهر فلوري مزود بكاميرا رقمية. حدد عدسة موضوعية 40x ومرشح FITC للكشف عن الخلايا العصبية ASH إيجابية GFP في منطقة الرأس من الديدان الخيطية. اختر أكثر من 50 نيماتودا في كل مجموعة عشوائيا لحساب عدد الديدان الخيطية ذات الخلايا العصبية الثنائية ASH التي تحمل علامة GFP في منطقة رأسها7. احسب معدل البقاء على قيد الحياة للخلايا العصبية ASH باستخدام eq (2) أدناه.بقاء الخلايا العصبية (٪) = (2)حيث البقاء علىقيد الحياة N و N الإجمالي هما عدد الديدان الخيطية ذات الخلايا العصبية ASH الإيجابية GFP والعددالإجمالي للديدان الخيطية المختبرة في كل مجموعة ، على التوالي. فحص التجنب الأسموزي قسم صفيحة NGM الخالية من الطعام (9 سم) إلى مناطق عادية (N) وفخ (T) بواسطة خط جليسيرول 8 M (~ 30 ميكرولتر) في المنتصف. انشر خط أزيد الصوديوم 200 mM (~ 20 ميكرولتر) على بعد ~ 1 سم من خط الجلسرين لشل الديدان الخيطية التي تعبر حاجز الجلسرين إلى المنطقة T. نقل ~ 200 نيماتودا كل منها إلى المنطقة N من ثلاث لوحات مكررة لكل مجموعة. أضف قطرة من 1٪ بيوتانديون (~ 2 ميكرولتر) إلى المنطقة T (1 سم من حافة اللوحة) لجذب الديدان الخيطية. غطي غطاء طبق بتري على الفور ، واحتضنيه عند 23 درجة مئوية لمدة 90 دقيقة. سجل عدد الديدان الخيطية على منطقتي N و T تحت المجهر. احسب مؤشر التجنب باستخدام eq (3)20.مؤشر التجنب = (3)حيث N و T هما عدد الديدان الخيطية في منطقتي N و T ، على التوالي. يتم تقديم البيانات كوسيلة ± الانحراف المعياري (SD) لثلاث نسخ متماثلة ، تمثل >3 تجارب مستقلة. قم بإجراء اختبار t غير مقترن وثنائي الذيل لمقارنة البيانات من مجموعات استراغالان والتحكم. 4. إنشاء مخطط رادار افتح برنامج الرسوم البيانية واستورد البيانات من مقايسات مختلفة إلى ورقة جديدة. أدخل العمود A(X) كعناوين للمحاور الشعاعية، والعمود A(Y) كبيانات من المجموعة الضابطة، والعمود B(Y) كبيانات من مجموعة المعالجة. حدد البيانات المطلوبة وانقر على مخطط | متخصص: زر الرادار في قائمة شريط الأدوات لإنشاء مخطط رادار. انقر نقرا مزدوجا فوق المحور الشعاعي واضبط تسميات المقياس والتجزئة والقراد لكل محور حسب الحاجة. انقر فوق ملف في القائمة وحدد تصدير الرسوم البيانية لحفظ الصورة ك *.tiff.ملاحظة: توفر مواقع الويب البرمجية في جدول المواد مستندات مساعدة مفصلة ومقاطع فيديو تعليمية حول إنشاء مخططات الرادار.

Representative Results

تعبر سلالة polyQ المعدلة وراثيا AM141 بقوة عن بروتينات الاندماج Q40::YFP في خلايا عضلات جدار الجسم 7,21. كما هو موضح في الشكل 1A ، يمكن تحديد النمط الظاهري الكلي المنفصل لهذه السلالة بواسطة بروتوكول التصوير والتحليل الآلي الموضح في هذه المقالة. زادت كمية مجاميع Q40::YFP في الديدان الخيطية AM141 بشكل كبير بعد 48 ساعة من مرحلة L1. ومع ذلك ، تم تثبيط هذا الميل إلى الزيادة من خلال علاج استراغالان (الشكل 1B) ، مما يدل على الإمكانات الحمائية للاستراغالان ضد تراكم polyQ. عادة ما يمكن استخدام 72 ساعة أو 96 ساعة بشكل ملائم كنقاط زمنية لحساب مجاميع Q40::YFP لتقييم التأثير المضاد للتجميع لعينات الاختبار. في هذا البروتوكول ، تم التقاط المجاميع الفلورية للديدان الخيطية AM141 بواسطة نظام تصوير آلي ، على الرغم من أنه يمكن أيضا استخدام المجاهر الفلورية لهذا الغرض7. تعبر سلالة C. elegans HA759 عن كل من علامة GFP و Htn-Q150 في الخلايا العصبية ASH الحسية ، مما يؤدي إلى فقدان تدريجي وخلل وظيفي في هذه الخلايا العصبية11,13. تم تركيب الديدان الخيطية على منصات أغاروز بنسبة 2٪ لتحديد الجدوى العصبية ASH (الشكل 2A) وتصورها مجهريا للكشف عن الخلايا العصبية ASH. يشير فقدان تألق GFP في الخلايا العصبية الثنائية ASH في مناطق الرأس من الديدان الخيطية إلى موت الخلايا العصبية ASH (الشكل 2B). معدل البقاء على قيد الحياة من الخلايا العصبية ASH في الديدان الخيطية HA759 هو <40٪ في المجموعة الضابطة بعد الحضانة عند 15 درجة مئوية لمدة 3 أيام 7,20 ، مما يشير إلى السمية العصبية بوساطة polyQ. وبالتالي ، يمكن استخدام اختبار البقاء على قيد الحياة العصبي ASH هذا لتقييم تأثيرات مركبات الاختبار بصريا على الخلايا العصبية C. elegans ، على سبيل المثال ، التأثير العصبي الوقائي للاستراغالان ولكن ليس Poria glycan (الشكل 2C). نظرا لأن الخلل الوظيفي السلوكي هو أحد الأعراض السريرية الرئيسية في أمراض polyQ ، فقد تم تصميم اختبار التجنب الحسي الكيميائي (الشكل 3A) باستخدام أعداد كبيرة من الديدان الخيطية HA759 كاختبار مبسط لفحص تأثير عينات الاختبار على الخسارة الوظيفية للخلايا العصبية ASH بوساطة تجميع polyQ. كما هو موضح في الشكل 3B ، كان مؤشر تجنب الديدان الخيطية HA759 في المجموعة الضابطة غير المعالجة ~ 0.5 ، على غرار ما تم الإبلاغ عنه سابقا14. ومن المثير للاهتمام أن مؤشر التجنب ارتفع إلى >0.6 في الديدان الخيطية المعالجة بالاستراغالان عند 15 درجة مئوية لمدة 3 أيام (الشكل 3B) ، مما يدل على تأثير وقائي عصبي من عديد السكاريد ضد الإعاقات السلوكية. لتقييم القدرة الوقائية العصبية الإجمالية لمركبات الاختبار ، يمكن دمج البيانات من الفحوصات الفردية المذكورة أعلاه وتقديمها كمخطط رادار لأنماط ظاهرية متعددة ، مما يجعلها ميزة موحدة للأنماط الظاهرية polyQ مناسبة للمقارنة المباشرة والعرض المباشر. كما هو موضح في الشكل 4 ، فإن مساحة المثلث في مجموعة معالجة استراغالان أكبر من مساحة المجموعة الضابطة ، مما يشير إلى التأثيرات المضادة ل polyQ من السكريات. الشكل 1: تأثير استراغالان على تجميع polyQ40 . (أ) صور تمثيلية للديدان الخيطية AM141 بعد المعالجة مع أو بدون استراغالان لمدة 96 ساعة عند 20 درجة مئوية. تم الحصول على الصور الفلورية (الألواح اليسرى) من لوحات 384 بئرا باستخدام نظام تصوير وتحليل عالي المحتوى ، وتم تحديد مجاميع Q40::YFP (الألواح اليمنى) تلقائيا بواسطة النظام. Insets هي طرق العرض المكبرة لصور الديدان الخيطية التي تظهر مجاميع polyQ. أشرطة المقياس = 500 ميكرومتر (B) القياس الكمي لمجاميع Q40::YFP. تمت مراقبة عدد مجاميع Q40::YFP في الديدان الخيطية AM141 باستخدام نظام التصوير عالي المحتوى كل 24 ساعة لمدة 4 أيام بعد العلاج مع أو بدون استراغالان عند 20 درجة مئوية. تم تسجيل ما يقرب من 100-150 ديدان خيطية في كل مجموعة للمجاميع في كل نقطة زمنية. تظهر النتائج على شكل منحنيات ملائمة استنادا إلى متوسط عدد المجاميع لكل ديدان خيطية. الاختصارات: polyQ = polyglutamine; YFP = بروتين الفلورسنت الأصفر. FITC = الفلوريسين إيزوثيوسيانات. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 2: تأثير استراغالان على موت الخلايا العصبية ASH بوساطة Htn-Q150 . (أ) مخطط تخطيطي لإعداد شريحة الأغاروز. (ب) صور مجهرية تمثيلية للديدان الخيطية HA759 مع بقاء وموت الخلايا العصبية ASH باستخدام تكبير 400x. أشرطة المقياس = 20 ميكرومتر. تم تصوير الديدان الخيطية HA759 باستخدام مجهر فلوري بعد العلاج مع أو بدون استراغالان عند 15 درجة مئوية لمدة 3 أيام من L1. (ج) التأثير الوقائي للاستراغالان ضد موت الخلايا العصبية ASH بوساطة polyQ. تم استخدام بوريا غليكان ، وهو عديد السكاريد من بوريا كوكوس ، كعنصر تحكم. يتم تقديم البيانات كوسيلة ± SD من ثلاث نسخ متماثلة ، تمثل أكثر من ثلاث تجارب مستقلة. تم إجراء التحليل الإحصائي باستخدام اختبار t غير مقترن وثنائي الذيل لمقارنة بيانات المجموعة الضابطة مع بيانات مجموعات استراغالان وبوريا غليكان. * ص < 0.05 ؛ ns = لا يوجد شيء. اختصار: GFP = بروتين الفلورسنت الأخضر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 3: تأثير استراغالان على الخلل السلوكي بوساطة Htn-Q150 . (أ) مخطط تخطيطي للوحة فحص التجنب. (ب) النتائج التمثيلية لفحص الإبطال. تم تعريف مؤشر التجنب على أنه نسبة الديدان الخيطية في المنطقة N إلى العدد الإجمالي للديدان الخيطية على اللوحة. يتم تقديم النتائج كوسيلة ± SD من ثلاث نسخ متماثلة ، تمثل ثلاث تجارب مستقلة. تم إجراء التحليل الإحصائي لمؤشر التجنب باستخدام اختبار t غير مقترن وثنائي الذيل. **ص < 0.01. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 4: القدرة العامة على الحماية العصبية للأستراغالان. يتم استيراد البيانات من ثلاثة اختبارات مختلفة إلى برنامج OriginPro لإنشاء مخطط رادار ، والذي يتم تقديمه لتحديد التأثير العام ل astragalan على أنماط ظاهرية متعددة بوساطة polyQ. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الجدول 1. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الجدول.

Discussion

نظرا لأن تجميع polyQ والسمية البروتينية من السمات المهمة لاضطرابات polyQ ، مثل مرض هنتنغتون13 ، فإننا نوصي باستخدام نماذج وطرق متعددة لتقييم شامل لقدرة الحماية العصبية لمركبات الاختبار ، بما في ذلك اختبار تجميع polyQ في سلالة AM141 ، واختبار البقاء على قيد الحياة العصبي ASH في سلالة HA759 ، واختبار التجنب الحسي الكيميائي في سلالة HA759. تم استخدام البروتوكولات المعروضة هنا لتقييم القدرات الوقائية العصبية لعينات الاختبار ضد سمية polyQ ، بما في ذلك التأثيرات المثبطة على كل من تراكم polyQ والسمية العصبية المرتبطة به7،14،15،16،17،19،20 ، مما يدل على إمكاناتها في اكتشاف الأدوية ل HD وأمراض polyQ الأخرى.

تم إدخال نظام تصوير وتحليل آلي للكشف عن مجاميع polyQ وعدها في اختبار تجميع polyQ. تتميز هذه الطريقة بكونها عالية الإنتاجية وفعالة من حيث الوقت وتؤدي إلى تقليل الأخطاء الذاتية بشكل كبير في عملية العد الشاقة. بالنسبة للوحة كاملة من 384 بئرا ، لا يستغرق الأمر سوى <1 ساعة لإنهاء الحصول على الصور وتحليلها. ومع ذلك ، فقد أظهرت طريقة التصوير المجهري التقليدية أيضا أداء مماثلا في هذا المختبر دون استخدام جهاز التصوير الآلي7.

يوصى بما مجموعه 100-150 نيماتودا لكل علاج في اختبار تجميع Q40::YFP النموذجي لكل نقطة زمنية ، والتي يمكن إجراؤها في آبار مكررة تحتوي على 10-15 نيماتودا لكل منها. ومع ذلك ، تجدر الإشارة إلى أن يرقات L1 قد تكون أكثر حساسية لبعض العلاجات أو تركيزات أعلى. لذلك ، قد تمنع الجرعات العالية من مركبات الاختبار نموها ، مما يؤدي إلى نتائج إيجابية كاذبة بسبب النمو البطيء ، وبالتالي تأخير تجميع polyQ. عادة ، يمكن إجراء فحص إزالة الأغذية لمعالجة هذا القلق وضمان نطاق التركيز المناسب لمركبات الاختبار23.

الديدان الخيطية المعدلة وراثيا HA759 المستخدمة في اختبارات السمية العصبية polyQ coexpress OSM-10::GFP و Htn-Q150 ، مما يجعل من الممكن تحديد الخلايا العصبية الحسية الثنائية ASH بشكل لا لبس فيه. وبالتالي ، يتم تقييم بقاء الخلايا العصبية ASH من خلال وجود أو عدم وجود تعبير GFP. عادة ، ~ 40-75 ٪ من الخلايا العصبية ASH في الديدان الخيطية السيطرة ميتة23,24. ومن المثير للاهتمام ، أن pqe-1 (محسن الجلوتامين متعدد الجلوتامين-1) الخلفية الجينية المتحورة في سلالة HA759 (pqe-1; Htn-Q150) يسرع السمية بوساطة polyQ ، مما يؤدي إلى وفاة معظم الخلايا العصبية ASH في غضون ثلاثة أيام ، حتى عند 15 درجة مئوية ، وبالتالي تزرع هذه السلالة عند 15 درجة مئوية لفحص البقاء على قيد الحياة العصبية ، كما ذكر سابقا23,24.

قد يحدث فقدان وظيفي للخلايا العصبية ASH في الديدان الخيطية HA759 قبل الكشف عن موت الخلايا ومجاميع البروتين13 ؛ لذلك ، فإن اختبار سلوك التجنب الأسموزي ضروري لتقييم السمية بوساطة polyQ. لتقليل التأثير المحتمل للديدان الخيطية HA759 الأقل نشاطا عند درجة حرارة منخفضة على التجارب السلوكية ، يتم احتضان ألواح فحص التجنب في حاضنة رطبة تبلغ 23 درجة مئوية بدلا من 15 درجة مئوية كما هو الحال في فحص البقاء على قيد الحياة العصبي باستخدام هذه السلالة. بالإضافة إلى ذلك ، تم الإبلاغ عن أن الديدان الخيطية المعدلة وراثيا Htn-Q150/OSM-10::GFP حساسة للغاية للمس الأنف. وبالتالي ، فإن الكشف البديل عن وظيفة الخلايا العصبية ASH هو فحص لمس الأنف13.

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

نشكر الأعضاء السابقين في مختبر هوانغ الذين ساعدوا في تطوير وتحسين البروتوكولات المستخدمة في هذه الورقة ، ولا سيما هانروي تشانغ ، ولينغيون شياو ، ويانشيا شيانغ. تم دعم هذا العمل من قبل مشروع 111 (رقم المنحة B17018) ومؤسسة العلوم الطبيعية في مقاطعة خبي (رقم المنحة H2020207002).

Materials

C. elegans strains
AM141
rmIs133 [unc-54p::Q40::YFP]		 Caenorhabditis Genetics Center (CGC) https://cgc.umn.edu/strain/AM141
HA759
rtIs11 [osm-10p::GFP + osm-10p::HtnQ150 + dpy-20(+)]		 Caenorhabditis Genetics Center (CGC) https://cgc.umn.edu/strain/HA759
E. coli strains
NA22 Caenorhabditis Genetics Center (CGC) https://cgc.umn.edu/strain/NA22
OP50 Caenorhabditis Genetics Center (CGC) https://cgc.umn.edu/strain/OP50
Reagent
Agar Shanghai EKEAR Bio-Technology Co., Ltd. EQ1001-500G https://www.ekear.com
Agarose Biowest 111860
Butanedione Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. 80042427 https://www.reagent.com.cn/goodsDetail/d027c00e64c9404d9aa41391fbb59
5d0
Cholesterol Sigma-Aldrich C8667 https://www.sigmaaldrich.cn/CN/zh/product/sigma/c8667?context=product
Glycerol Aladdin Co., Ltd. G116203 https://www.aladdin-e.com/zh_cn/g116203.html
Peptone Guangdong HuanKai Microbial Science and Technology Co., Ltd. 050170B https://www.huankai.com/show/21074.html
Sodium azide Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. 80115560 https://www.reagent.com.cn/goodsDetail/5e981aa807664e26af
551e96ff5f07cd
Sodium hydroxide Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. 10019718 https://www.reagent.com.cn/goodsDetail/450dfdb1132a4d8a817
d3d8c68ec25e6
Sodium hypochlorite solution Guangzhou Chemical Reagent Factory 7681-52-9 http://www.chemicalreagent.com/product/DetailProduct.aspx?id=125
Tryptone Oxoid Ltd. LP0042B https://www.thermofisher.cn/order/catalog/product/LP0042B#/LP0042B
Yeast extract Oxoid Ltd. LP0021B https://www.thermofisher.cn/order/catalog/product/LP0021B#/LP0021B
Equipment
384-well cell culture plate Nest Biotechnology Co., Ltd. 761001 https://www.cell-nest.com/page94?_l=en&product_id=85
48-well cell culture plate Nest Biotechnology Co., Ltd. 748001 https://www.cell-nest.com/page94?_l=en&product_id=85
90 mm Petri dish Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. F611003 https://www.sangon.com/productDetail?productInfo.code=F611003
Autoclave Panasonic MLS-3781L-PC
Dissecting microscope ChongQing Optical Co., Ltd. ZSA0745 http://www.coicuop.com/plus/view.php?aid=64
Fluorescence microscope Guangzhou Micro-shot Optical Technology Co., Ltd. Mshot MF31-LED https://www.mshot.com/article/442.html
High-content imaging system Molecular Devices ImageXpress Pico https://www.moleculardevices.com/products/cellular-imaging-systems#High-Content-Imaging
Microcentrifuge GeneCompany GENESPEED X1 https://www.genecompany.com/index.php/Home/Goods/goodsdetails/gid/189.html
Microscope digital camera Guangzhou Micro-shot Optical Technology Co., Ltd. MS60 https://www.mshot.com/article/677.html
Microwave Midea Corp.  M1-211A https://www.midea.cn/10000/10000000001
00511264425.html
Parafilm M Sigma-Aldrich P7793-1EA https://www.sigmaaldrich.cn/CN/en/product/sigma/p7793?context=product
Shaker Zhicheng Inc. ZWY-2102C http://www.zhicheng.net/Product/0865291356.html
Software
Image acquisition and analysis software Molecular Devices MetaXpress https://www.moleculardevices.com/products/cellular-imaging-systems/acquisition-and-analysis-software/metaxpress
OriginPro OriginLab Corp. Version 9.8.5.204 1. Software introduction: https://www.originlab.com/index.aspx?go=Products/Origin
2. Instruction for creating a radar chart: https://www.originlab.com/doc/Origin-Help/RadarChart-Graph
3. Video tutorial for creating a radar chart: https://www.originlab.com/videos/details.aspx?pid=1813
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Riferimenti

  1. The Huntington’s Disease Collaborative Research Group. A novel gene containing a trinucleotide repeat that is expanded and unstable on Huntington’s disease chromosomes. Cell. 72 (6), 971-983 (1993).
  2. Bauer, P. O., et al. Harnessing chaperone-mediated autophagy for the selective degradation of mutant huntingtin protein. Nature Biotechnology. 28 (3), 256-263 (2010).
  3. Lieberman, A. P., Shakkottai, V. G., Albin, R. L. Polyglutamine repeats in neurodegenerative diseases. Annual Review of Pathology. 14, 1-27 (2019).
  4. Sakahira, H., Breuer, P., Hayer-Hartl, M. K., Hartl, F. U. Molecular chaperones as modulators of polyglutamine protein aggregation and toxicity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 16412-16418 (2002).
  5. Bäuerlein, F., Fernández-Busnadiego, R., Baumeister, W. Investigating the structure of neurotoxic protein aggregates inside cells. Trends in Cell Biology. 30 (12), 951-966 (2020).
  6. Tu, Z., Yang, W., Yan, S., Guo, X., Li, X. J. CRISPR/Cas9: a powerful genetic engineering tool for establishing large animal models of neurodegenerative diseases. Molecular Neurodegeneration. 10, 35 (2015).
  7. Zhang, H., et al. Inhibition of polyglutamine-mediated proteotoxicity by Astragalus membranaceus polysaccharide through the DAF-16/FOXO transcription factor in Caenorhabditis elegans. Biochemical Journal. 441 (1), 417-424 (2012).
  8. Koyuncu, S., et al. The ubiquitin ligase UBR5 suppresses proteostasis collapse in pluripotent stem cells from Huntington’s disease patients. Nature Communications. 9 (1), 2886 (2018).
  9. Dimitriadi, M., Hart, A. C. Neurodegenerative disorders: insights from the nematode Caenorhabditis elegans. Neurobiology of Disease. 40 (1), 4-11 (2010).
  10. Li, J., Le, W. Modeling neurodegenerative diseases in Caenorhabditis elegans. Experimental Neurology. 250, 94-103 (2013).
  11. Wang, Q., et al. Caenorhabditis elegans in Chinese medicinal studies: making the case for aging and neurodegeneration. Rejuvenation Research. 17 (2), 205-208 (2014).
  12. Hassan, W. M., Dostal, V., Huemann, B. N., Yerg, J. E., Link, C. D. Identifying Aβ-specific pathogenic mechanisms using a nematode model of Alzheimer’s disease. Neurobiology of Aging. 36 (2), 857-866 (2015).
  13. Faber, P. W., Alter, J. R., MacDonald, M. E., Hart, A. C. Polyglutamine-mediated dysfunction and apoptotic death of a Caenorhabditis elegans sensory neuron. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (1), 179-184 (1999).
  14. Zhang, J., et al. Antioxidant and neuroprotective effects of Dictyophora indusiata polysaccharide in Caenorhabditis elegans. Journal of Ethnopharmacology. 192, 413-422 (2016).
  15. Xiang, Y., et al. Epimedium polysaccharide alleviates polyglutamine-induced neurotoxicity in Caenorhabditis elegans by reducing oxidative stress. Rejuvenation Research. 20 (1), 32-41 (2017).
  16. Zhong, G., et al. Physicochemical and geroprotective comparison of Nostoc sphaeroides polysaccharides across colony growth stages and with derived oligosaccharides. Journal of Applied Phycology. 33 (2), 939-952 (2021).
  17. Xiao, L., et al. Salidroside protects Caenorhabditis elegans neurons from polyglutamine-mediated toxicity by reducing oxidative stress. Molecules. 19 (6), 7757-7769 (2014).
  18. Cordeiro, L. M., et al. Rutin protects Huntington’s disease through the insulin/IGF1 (IIS) signaling pathway and autophagy activity: Study in Caenorhabditis elegans model. Food and Chemical Toxicology. 141, 111323 (2020).
  19. Yang, X., et al. The neuroprotective and lifespan-extension activities of Damnacanthus officinarum extracts in Caenorhabditis elegans. Journal of Ethnopharmacology. 141 (1), 41-47 (2012).
  20. Xiao, L., et al. The traditional formula Kai-Xin-San alleviates polyglutamine-mediated neurotoxicity by modulating proteostasis network in Caenorhabditis elegans. Rejuvenation Research. 23 (3), 207-216 (2020).
  21. Morley, J. F., Brignull, H. R., Weyers, J. J., Morimoto, R. I. The threshold for polyglutamine-expansion protein aggregation and cellular toxicity is dynamic and influenced by aging in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (16), 10417-10422 (2002).
  22. Gidalevitz, T., Ben-Zvi, A., Ho, K. H., Brignull, H. R., Morimoto, R. I. Progressive disruption of cellular protein folding in models of polyglutamine diseases. Science. 311 (5766), 1471-1474 (2006).
  23. Voisine, C., et al. Identification of potential therapeutic drugs for huntington’s disease using Caenorhabditis elegans. PLoS One. 2 (6), 504 (2007).
  24. Faber, P. W., Voisine, C., King, D. C., Bates, E. A., Hart, A. C. Glutamine/proline-rich PQE-1 proteins protect Caenorhabditis elegans neurons from huntingtin polyglutamine neurotoxicity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (26), 17131-17136 (2002).

Tags

Keywords: C. ElegansPolyglutamineNeurotoxicityHuntington’s DiseaseAnimal ModelHigh-throughput ScreeningPolyglutamine AggregatesFluorescence ImagingImage Analysis
check_url/it/63081?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citazione di questo articolo
Wang, Q., Zhang, J., Jiang, Y., Xiao, Y., Li, X., Mao, X., Huang, Z. Caenorhabditis elegans as a Model System for Discovering Bioactive Compounds Against Polyglutamine-Mediated Neurotoxicity. J. Vis. Exp. (175), e63081, doi:10.3791/63081 (2021).
Scarica citazione
Ristampe e autorizzazioni

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image