Il presente protocollo descrive come utilizzare l'optogenetica wireless combinata con la videografia ad alta velocità in un singolo compito di reach-to-grasp del pellet per caratterizzare i circuiti neurali coinvolti nell'esecuzione del comportamento motorio qualificato nei topi che si muovono liberamente.
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Articolo metodologico
In vivo Controllo optogenetico wireless del comportamento motorio qualificato
In questo articolo
Sommario
Abstract
Le capacità motorie sono essenziali nella vita di tutti i giorni e possono essere compromesse in diversi disturbi del sistema nervoso. L'acquisizione e l'esecuzione di questi compiti richiedono l'integrazione senso-motoria e comportano un controllo preciso dei circuiti cerebrali bilaterali. L'implementazione di paradigmi comportamentali unimanuali in modelli animali migliorerà la comprensione del contributo delle strutture cerebrali, come lo striato, al comportamento motorio complesso in quanto consente la manipolazione e la registrazione dell'attività neurale di nuclei specifici in condizioni di controllo e malattia durante l'esecuzione del compito.
Fin dalla sua creazione, l'optogenetica è stata uno strumento dominante per interrogare il cervello consentendo l'attivazione o l'inibizione selettiva e mirata delle popolazioni neuronali. La combinazione di optogenetica con saggi comportamentali fa luce sui meccanismi alla base di specifiche funzioni cerebrali. I sistemi wireless montati sulla testa con diodi a emissione di luce miniaturizzati (LED) consentono il controllo optogenetico remoto in un animale completamente libero. Ciò evita che le limitazioni di un sistema cablato siano meno restrittive per il comportamento degli animali senza compromettere l'efficienza dell'emissione luminosa. L'attuale protocollo combina un approccio optogenetico wireless con la videografia ad alta velocità in un compito di destrezza unimanuale per sezionare il contributo di specifiche popolazioni neuronali al comportamento motorio fine.
Introduzione
Il comportamento motorio qualificato è presente durante la maggior parte dei movimenti eseguiti da noi ed è noto per essere influenzato in diversi disturbi cerebrali 1,2,3,4,5,6. L'implementazione di compiti che consentano di studiare lo sviluppo, l'apprendimento e le prestazioni di movimenti qualificati è fondamentale per comprendere le basi neurobiologiche della funzione motoria, specialmente nei modelli di lesioni cerebrali, disturbi neurodegenerativi e dell....
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Protocollo
Le procedure che coinvolgono l'uso degli animali sono state condotte seguendo le linee guida locali e nazionali e approvate dal corrispondente Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali (Istituto di fisiologia cellulare protocollo IACUC VLH151-19). Nel protocollo corrente sono stati utilizzati topi maschi transgenici Drd1-Cre27, 35-40 giorni postnatali con background C57BL/6. I topi sono stati tenuti nelle seguenti condizioni: temperatura 22±1 °C; umidità 55%; orario luci 12/12 h con luci spente alle 19:00 e sono stati svezzati al giorno postnatale 21. I cuccioli svezzati erano ospitati in gruppi dello stesso sesso di 2-5. Gli ani....
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Risultati
Il compito reach-to-grasp è un paradigma ampiamente utilizzato per studiare la modellazione, l'apprendimento, le prestazioni e la cinematica del movimento delle abilità fini sotto diverse manipolazioni sperimentali. I topi imparano a eseguire l'attività in un paio di giorni e raggiungono una precisione superiore al 55% raggiungendo un plateau dopo 5 giorni di allenamento (Figura 2A, B). Analogamente a quanto riportato in precedenza, una percentuale di animali non svolge il c.......
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Discussione
L'uso della manipolazione optogenetica delle popolazioni neuronali in paradigmi comportamentali ben definiti sta facendo progredire le nostre conoscenze sui meccanismi alla base del controllo motorio 7,23. I metodi wireless sono particolarmente adatti per compiti che richiedono test su più animali o la libera circolazione34,35. Tuttavia, poiché le tecniche e i dispositivi sono perfezionati, dovrebbe esser.......
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Dichiarazioni
Gli autori non dichiarano alcuna divulgazione.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto dal progetto UNAM-PAPIIT IA203520. Ringraziamo la struttura per animali IFC per il loro aiuto nella manutenzione delle colonie di topi e l'unità computazionale per il supporto IT, in particolare a Francisco Perez-Eugenio.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Macchina per anestesia | RWD | R583S | Vaporizzatore di isoflurano |
| Anesket | PiSA | Ketamina | |
| Breadboard | Thorlabs | MB3090 / M | Breadboard ottico in alluminio solido |
| Obiettivo della fotocamera | Canon | 50mmf / 1.4 obiettivi con messa a fuoco manuale (c-mount) | |
| Sistema di telecamere | BrainVision | MiCAM02 | Controller della fotocamera e sincronizzatore |
| Tamponi di | |||
| Soluzione CS | PiSA | Soluzione di cloruro di sodio 9% | |
| Camera di allenamento personalizzata | In casa | ||
| Punta da trapano #105 | Dremel | 2 615 010 5AE | Taglierina per incisione |
| Pellet di cioccolato di precisione senza polvere Bio-Serv | F05301 | ||
| Alcool etilico | J. T. Baker | 9000-02 | Etanolo |
| Eyespears | Ultracell 40400-8 | Eyespears di materiale PVA assorbente | |
| Fluriso | VetOne | V1 502017-250 | Isoflurano |
| Capillari in vetro | Drumond Scientific | 3-000-203-G/X | Pipette per NanoJect II |
| Perossido di idrogeno | Farmacom | Antisettico | |
| Telecamera ad alta velocità | BrainVision | MiCAM02-CMOS | Telecamere monocromatiche ad alta velocità |
| Emitore a infrarossi | Teleopto | ||
| Siringa | |||
| Cannula LED | Teleopto | TelC-c-l-d | Cannula LED 250um 487nm luce |
| Micropipetta 10 uL | Eppendorf | Z740436 | |
| Estrattore per micropipette | Sutter | P-87 | Estrattore orizzontale |
| Microscopio LSM780 | Zeiss | Microscopio confocale | |
| Microtomo | |||
| Mock receiver | Teleopto | ||
| NanoJect II | Drumond Scientific | 3-000-204 | Micro iniettore |
| Serbatoio di ossigeno | Infra | na | |
| pAAV-EF1a-double.floxed-hChR2(H134R)-mCherry-WPRE- HGHpA | Addgene | 20297 | Vettore virale per l'espressione di ChR-2 |
| Parafilm | |||
| Paraformaldeide | Sigma | P-6148 | |
| Tampone salino fosfato | Sigma | P-4417 | Compresse tampone salino fosfato |
| Puntali per pipette 10 uL | ThermoFisher | AM12635 | 0,5-10 uL volume |
| Pisabental | PiSA | Pentobarbital di sodio | |
| Plexiglass | commerciale | Lastra acrilica | |
| Povidone iodio | Farmacom | Antisettico | |
| Procin | PiSA | Xilacino | |
| Puralube | Perrigo pharma | 1228112 | Lubrificante per gli occhi 15% olio minerale/85% petrolato |
| Utensile rotante | Kmoon | Mini grinder | Standard |
| Bisturi | |||
| Lama per | |||
| Apparecchio stereotassico | Stoelting | 51730D | Apparecchio digitale |
| Super-Bond C& B | Sun Medical | Cemento dentale | |
| Tappo chirurgico monouso Teleopto | |||
| telecomando Teleopto | |||
| Tg Drd1-Cre linea di topi | Gensat | 036916-UCD | Inserimento transgene FK150Gsat |
| Adesivo tissutale | 3M Vetbond | 1469SB | |
| TPI Vibratome 1000 plus | Peico | Microtomo | |
| Vectashield supporti di montaggio con DAPI | Vector laboratories | H-1200 | Supporti di montaggio |
| Ricevitore wireless | Teleopto | TELER-1-P |
Riferimenti
- Balbinot, G., et al. Post-stroke kinematic analysis in rats reveals similar reaching abnormalities as humans. Scientific Report. 8 (1), 8738(2018).
- Klein, A., Sacrey, L. A., Whishaw, I. Q., Dunnett, S. B.
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Ristampe e permessi
