Interfas fluorescens in situ Hybridisering av benmärgsfläckar av multipelt myelom
Summary
Här presenterar vi ett protokoll för att förbättra framgången för interphase fluorescence in situ hybridisering upptäckt på benmärg utstryk från flera myelom patienter.
Abstract
Fluorescens in situ hybridization (FISH) detektion är en oumbärlig metod i genetisk risk stratifiering i multipelt myelom (MM), som är en av de vanligaste hematologiska maligniteter. Den identifierande egenskapen hos MM är ackumulerade maligna plasmaceller i benmärgen. FISH rapporter för MM fokuserar främst på renade eller identifierade klonurvalet plasmaceller, snarare än alla nukleära celler, genom sortering med anti-CD138 magnetiska pärlor eller märkning med cytoplasmic immunoglobulin ljuskedje κ eller λ. Benmärg interphase atomkärnor erhålls vanligtvis från färska benmärg celler. Tillfredsställande anrikning av plasmacellsprover kräver dock stora mängder färsk heparin antikoagulerad benmärg, som inte kan erhållas vid svår benmärgsextraktion eller en benmärgstorr kran. Häri etablerar vi en ny metod för att förbättra framgången för FISH upptäckt på färgade eller unstained benmärg utstryk. Benmärgsfläckar är lättare att få tag på än antikoagulanerade benmärgsprover.
Introduction
Multipelt myelom (MM) är en elakartad plasmacellssjukdom (PC) med stark biologisk heterogenitet och stora individuella skillnader i klinisk effekt, med överlevnadsperioder som sträcker sig från månader till årtionden. Cytogenetiska egenskaper är viktiga prognostiska indikatorer på MM. Riskstratifieringssystemet och individualiserade behandlingar baserade på genetiska egenskaper har blivit föremål av stort intresse för klinisk forskning om MM1. Avvikelserna hos datorer som testats i en fluorescens in situ-hybridiseringspanel (FISH) av benmärg (BM) inkluderar del 13q14 (RB1), del 17p13 (TP53), t(4;14) (IGH/FGFR3), t(11;14) (IGH/MYEOV), t(14;16) (IGH/MAF), t(11;14) (IGH/MYEOV), t(14;16) (IGH/MAF), t(11;14) (IGH/MYEOV), t(14;16) (IGH/MAF), t(11;14) (IGH/MYEOV), t(14;16) (IGH/MAF), t(11;14) (IGH/MYEOV), t(14;16) (IGH/MAF), t(11;14) (IGH/MAF), t(11;14) (IGH/MYEOV), t(14;16) (IGH/MAF), t(11;14) (IGH/MAF), t(11;14) (IGH/FGFR3), t(11;14) (IGH/MYEOV), t(14;16) (IGH/MAF), t(11;14) (IGH/MAF), t(11;14) (IGH/MYEOV), t(14;16) (IGH/MAF), t(11;14 och 1p (CDKN2C) borttagning.
Standardmetafascytogenetik bör inkluderas i den första bedömningen av MM- patienter. Även om konventionella G-banded karyotyping erbjuder fördelen med en helkromosomanalys, leder det låga utbytet av denna metod till många falska negativa resultat2. Traditionellt har datorer betraktats som i stort sett oförmögna att dela eftersom de är slutfasen produkter av B lymfocyt differentiering. Detta gör det svårt att få delade bilder. Förbättrad cytogenetiska analys i MM med långsiktiga kulturer (6 dagar) och stimulering av kulturer av cytokiner kan vara en lovande metod för att identifiera cytogenetiska avvikelser hos nydiagnostiserade MM patienter3. Även när kulturtiden förlängdes till 6 dagar rapporterades dock cytogenetiska avvikelser korrekt i 30%-50% av MM patienter4. Dessutom kännetecknas MM av komplexa cytogenetiska avvikelser som återspeglar dess prognostiska heterogenitet. Upplösningen av traditionella kromosom ränder teknik är dock låg, vilket lätt kan leda till missad upptäckt av kromosomal avvikelser i MM.
Interfasfisk, helst efter CD138-positiv magnetisk pärlbaserad PC-sortering eller märkning med cytoplasmisk immunglobulin ljuskedja κ/λ, är oumbärlig vid analysen av MM5,6. Ett CD138-positivt valt prov rekommenderas starkt för optimerat utbyte av tumörceller. Korrekt mängd cytogenetiska avvikelser kräver dock minst 4 ml antikoagulerad BM för PC-sortering. Dessutom ökar kombinationerna av antingen CD138 immunomagnetisk pärlsortering med FISH eller cytoplasmic κ/λ ljuskedjeimglobulin med FISH-testning (cIg-FISH) många experimentella kostnader och är tidskrävande.
Vanligtvis bedöms PC-förhållandet först från morfologisk undersökning av färgade BM fläckar eller BM biopsi avsnitt7,8. BM-prover av högsta kvalitet (första märgaspiratprover) används för morfologiska tester, medan de som skickas för FISH eller annan detektion ofta är sekundära aspirationsprover med höga utspädningsförhållanden med perifert blod.
Redan på 1990-talet visade flera studier att BM-utstryk kan användas direkt för interstitiella FISH-undersökningar, vilket har visat sig vara en tillförlitlig och repeterbar metod9. En elegant studie baserad på cell morfologi och esterase cytochemistry i kombination med FISK av perifert blod och BM utstryk bekräftade dess stora kliniska betydelse för att klargöra kromosomal avvikelser hos patienter med granulocytic och lymfatisk leukemi10.
Häri tillhandahåller vi en ny metod för att förbättra framgången för interphase FISH upptäckt i MM patienter.
Protocol
Representative Results
Discussion
Tillämpningen av FISH på genetisk riskstratifiering i MM är avgörande. Den kritiska delen av FISH rapporter är inte alla nukleära celler, men kloniska datorer specifikt renas eller identifieras genom sortering med anti-CD138 magnetiska pärlor eller märkning med cytoplasmic immunoglobulin ljuskedje κ eller λ. Interphase FISH efter PC sortering eller cIg-FISH befanns vara betydande i diagnos av MM på grund av att den relativt lägre andelen datorer i BM. Dessa metoder har dock vissa brister, inklusive komplexa p…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta projekt stöddes av WNLO:s innovationsfond 2018WNLOKF023.
Materials
| automatic FISH machine | Leica Corporation | S500-24 | FINAL Assy Thermobrite 240V |
| DAPI | Abbott Molecular Inc. | 06J49-001 | DAPI Counterstain |
| FISH Analysis Software | IMSTAR Corporation | IMSTAR | FISH Analysis Software |
| FISH Probe | Abbott Molecular Inc. | 05N56-020 | Vysis Locus Specifc Identifer TP53 / CEP 17 FISH Probe Kit |
| Fixed volume pipette | Eppendorf China Ltd. | M33768H | 10 microliter |
| Fluorescence Microscope | Olympus Corporation | BX53 | Forward Fluorescence Microscope |
| Karyotype Analysis Software | IMSTAR Corporation | IMSTAR | Karyotype Analysis Software |
| Light Microscope | Olympus Corporation | BX41 | Forward Light Microscope |
| NP-40 | Abbott Molecular Inc. | 07J05-001 | NP-40 |
| Plastic staining dyeing rack | Guangzhou Kaixiu Trading Co., Ltd. | RSJ-501 | 24 slides |
| Plastic staining dyeing tank | Guangzhou Kaixiu Trading Co., Ltd. | RSJ-516 | 24 slides |
| Rubber Cement | Marabu GmbH & Co. KG | FixoGum | Rubber Cement |
| SSC | Abbott Molecular Inc. | 02J10-032 | 20×SSC |
| Water bath | Shanghai Boxun Medical Bio-Instrument Co., Ltd. | DK-8D | Multiple Temperature Water bath |
Riferimenti
- Sonneveld, P., et al. Treatment of multiple myeloma with high-risk cytogenetics: a consensus of the International Myeloma Working Group. Blood. 127, 2955-2962 (2016).
- Radbruch, A., et al. Competence and competition: the challenge of becoming a long-lived plasma cell. Nature Reviews Immunology. 6, 741-750 (2006).
- Lai, J. L., et al. Improved cytogenetics in multiple myeloma: a study of 151 patients including 117 patients at diagnosis. Blood. 85 (9), 2490-2497 (1995).
- Hallek, M., Bergsagel, P. L., Anderson, K. C. Multiple myeloma: increasing evidence for a multistep transformation process. Blood. 91, 3-21 (1998).
- Munsh, N. C., et al. Consensus recommendations for risk stratification in multiple myeloma: report of the International Myeloma Workshop Consensus Panel 2. Blood. 117, 4696-4700 (2011).
- Gole, L., et al. cIg-FISH On Patients with Multiple Myeloma – A Modified and Simple Technique Easily Incorporated Into Routine Clinical Service. Blood. 120, 4792-4792 (2012).
- Lee, S. H., Erber, W., Porwit, A., Tomonaga, M., Peterson, L. I. C. S. I. Hematology, ICSH guidelines for the standardization of bone marrow specimens and reports. International Journal of Laboratory Hematology. 30, 349-364 (2008).
- Štifter, S., et al. Combined evaluation of bone marrow aspirate and biopsy is superior in the prognosis of multiple myeloma. Diagnostic Pathology. 5, 30 (2010).
- Huegel, A., Coyle, L., McNeil, R., Smith, A. Evaluation of interphase fluorescence in situ hybridization on direct hematological bone marrow smears. Pathology. 27, 86-90 (1995).
- Jacobsson, B., Bernell, P., Arvidsson, I., Hast, R. Classical morphology, esterase cytochemistry, and interphase cytogenetics of peripheral blood and bone marrow smears. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 44, 1303-1309 (1996).
- Dunning, K., Safo, A. The ultimate Wright-Giemsa stain: 60 years in the making. Biotechnic & Histochemistry. 86, 69-75 (2011).
- Woronzoff-Dashkoff, K. K. The wright-giemsa stain. Secrets revealed. Clinics in Laboratory Medicine. 22, 15-23 (2002).
- McPherson, R. A., Pincus, M. R. Henry’s Clinical diagnosis and Management by Laboratory Methods E-book. Elsevier Health Sciences. , (2017).
- Ross, F. M., et al. Report from the European Myeloma Network on interphase FISH in multiple myeloma and related disorders. Haematologica. 97, 1272-1277 (2012).
