JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Risultati
Discussion
Divulgazioni
Acknowledgements
Materials
Riferimenti
Traduzione automatica
Biochimica

Uracil-DNA Glykosylaseanalyse ved matriseassistert laserdesorpsjon/ioniseringstid for massespektrometrianalyse

Published: April 22, 2022
doi:
10.3791/63089
, , , , , , ,
1Department of Clinical Laboratory Sciences and Medical Biotechnology, College of Medicine,National Taiwan University, 2Department of Laboratory Medicine,National Taiwan University Hospital, 3Center for Microbial Pathogenesis, Nationwide Children’s Hospital and the Department of Pediatrics,The Ohio State University

Summary

En ikke-merket, ikke-radio-isotopisk metode for å analysere uracil-DNA glykosylaseaktivitet ble utviklet ved hjelp av MALDI-TOF massespektrometri for direkte apurinic / apyrimidinisk produktanalyse. Analysen viste seg å være ganske enkel, spesifikk, rask og enkel å bruke til DNA glykosylasemåling.

Abstract

Uracil-DNA glykosylase (UDG) er en nøkkelkomponent i base excision reparasjonsveien for korreksjon av uracil dannet av hydrolytisk deaminering av cytosin. Dermed er det avgjørende for genomintegritetsvedlikehold. En svært spesifikk, ikke-merket, ikke-radio-isotopisk metode ble utviklet for å måle UDG-aktivitet. En syntetisk DNA-dupleks som inneholder en stedsspesifikk uracil ble spaltet av UDG og deretter utsatt for Matrix-assistert Laser Desorption / Ionization time-of-flight massespektrometri (MALDI-TOF MS) analyse. Det ble etablert en protokoll for å bevare det apurinic/apyrimidinic site (AP) produktet i DNA uten strandbrudd. Endringen i m/z-verdien fra substratet til produktet ble brukt til å evaluere uracilhydrolyse ved UDG. Et G:U-substrat ble brukt til UDG kinetisk analyse som ga Km = 50 nM, Vmax = 0,98 nM/s og Kcat = 9,31 s-1. Påføring av denne metoden til en uracil glykosylasehemmer (UGI) analyse ga en IC50-verdi på 7,6 pM. UDG-spesifisiteten ved hjelp av uracil i ulike posisjoner innen enkeltstrengede og dobbeltstrengede DNA-substrater viste forskjellig spaltingseffektivitet. Dermed kan denne enkle, raske og allsidige MALDI-TOF MS-metoden være en utmerket referansemetode for ulike monofunksjonelle DNA-glykosylaser. Det har også potensialet som et verktøy for DNA glykosylasehemmer screening.

Introduction

Selv om uracil er en normal base i RNA, er det en vanlig og svært mutagene lesjon i genomisk DNA. Uracil kan oppstå ved spontan/enzymatisk hydrolytisk deaminering av et deoksycytidin. I hver levende celle oppstår denne deaminering 100-500 ganger per dag under fysiologiske forhold1,2. Hvis disse endringene ikke repareres, kan det være en endring i DNA-sekvenssammensetningen, noe som forårsaker mutasjon. Som uracil i DNA foretrekker å parre med dATP under replikering, hvis cytosin deaminaterer til uracil, i to replikasjonshendelser, vil det være en ny G:C til A:T overgangsmutasjon i halvparten av avkom DNA3.

Blant de cellulære strategiene for å opprettholde genetisk stabilitet er base eksisjonsreparasjon (BER) en viktig mekanisme som reparerer skadede baser, for eksempel uracil, i DNA4. BER er en svært evolusjonært bevart prosess. Det er to generelle BER-veier: kortplasterveien som fører til en reparasjonskanal av et enkelt nukleotid og den lange patchbanen som produserer en reparasjonskanal på minst to nukleotider5. BER er en koordinert mekanisme som oppstår i flere trinn. Det første trinnet i BER er den enzymatiske hydrolysen til den skadede nukleotidbasen av et skadespesifikt DNA-glykosylase for å generere et apurinic / apyrimidinisk (AP) mellomliggende sted6. Dette etterfølges av spaltingen av sukkerfosfat-ryggraden på AP-anlegget av en endonuklease, opprydding av DNA-endene med en lyase, gapfylling av en DNA-polymerase og forseglet den endelige nick av en ligase5.

Uracil-DNA glykosylase (UDG) hydrolyserer uracil fra uracilholdig DNA for BER i Escherichia coli. Konvensjonelle UDG-analyser ved hjelp av radiomerket DNA som involverer forskjellige separasjonsteknikker6,7,8,9,10,11,12,13 er vanligvis tidkrevende, arbeidskrevende, med kostbare merkingsreagenser, kompliserte prosedyrer og krever intensiv trening og praksis for å redusere risikoen for eksponering for radioaktive materialer. Fluorometriske oligonukleotidanalyser er utviklet som en erstatning for radioisotopemerking14, i tillegg til molekylære beacons og Förster resonansenergioverføringsteknologi15,16,17,18,19,20. Det kreves imidlertid spesifikk merking for alle de nevnte metodene. Nylig etikettfrie biosensorer assays21,22,23 og kolorimetriske metoder basert på dannelsen av en G-quadruplex24,25,26 er utviklet. Imidlertid kompliserer flere A: U-par eller spesialdesignede sekvenser i sondene enzymenhetsdefinisjonen.

MALDI-TOF MS er en teknologi som kan være til stor nytte i DNA-analyse. Programmer utviklet inkluderer enkeltkjernepolymorfisme genotyping27,28, modifisert nukleotidanalyse29, og DNA-reparasjon mellomliggende identifikasjon30,31,32,33,34. MALDI-TOF MS bør lett vedtas for DNA glykosylaseanalyse for å oppdage AP-site-inneholdende DNA-produkter. Imidlertid er AP-nettsteder i DNA utsatt for strandbrudd under mange eksperimentelle forhold33. En UDG-analyse presenteres her ved hjelp av MALDI-TOF MS for direkte å måle AP-anleggsproduksjon uten betydelig strand-break støy. Denne etikettfrie metoden er enkel å jobbe med og har et høyt potensial for farmasøytisk anvendelse av DNA glykosylasehemmerscreening.

Protocol

1. Forberedelse av substrat/mal Design uracil substrat/ mal dupleks med et balansert G + C-innhold på ~ 50 ± 10% og minimum smeltetemperatur på 50 ° C for dupleksområdet.MERK: En nukleotidforskjell mellom 18 nt-substrater og 19 nt-maler (tabell 1 og figur 1) bidrar til bedre MS-signaltolkning og passende gløding. Malstrengen fungerer som komplementært DNA for å generere A-U- eller G-U-uoverensstemmelser (tabell 1), men …

Representative Results

Maler og underlagVed å ta syntetiske oligonukleotider med U i midten (U+9) sammen med en G-mal som eksempel (figur 1A), kan en blank kontroll av likevektsmengder av mal og uracilholdig substrat brukes til kvalitetskontroll av syntetisk oligonukleotidrenhet (figur 1B; signalene samsvarer med den angitte m/z og den lave bakgrunnsstøyen). For MS-dataanalysen ble topphøydene målt (figur 2). 19 nt mal DNA var for…

Discussion

Dette dokumentet gir en detaljert prosedyre for bruk av en UDG MALDI-TOF MS analysemetode for å direkte oppdage AP-inneholdende DNA-produkter. De viktigste fordelene med denne metoden er at uracilholdige substrater er etikettfrie, skalerbare, enkle å jobbe med og har større fleksibilitet i substratdesign.

Den UDG leverandør-anbefalte fenol / kloroform ekstraksjon muliggjør inaktivering av enzymet for å forhindre nedbrytning av produktet DNA. Fenolutvinningsprotokollen innebærer imidlert…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vi takker NCFPB Integrated Core Facility for Functional Genomics (Taipei, Taiwan) og NRPB Pharmacogenomics Lab (Taipei, Taiwan) for deres tekniske støtte. Dette arbeidet ble støttet av Vitenskaps- og teknologidepartementet, Taiwan, R.O.C. [tilskuddsnummer MOST109-2314-B-002 -186 til K.-Y.S., MOST 107-2320-B-002-016-MY3 til S.-Y.C., MOST 110-2320-B-002-043 til W.-h.F.]. H.-L.C. er mottaker av et doktorgradsstipend fra National Taiwan University. Støtte til åpen tilgang: Vitenskaps- og teknologidepartementet, R.O.C.

Materials

2-Amino-2-hydroxymethyl-propane-1,3-diol (Tris base) J.T baker Protocol 1,2
Autoclaved deionized water MILLIPORE Protocol 1,2
EDTA J.T Baker Protocol 1,2
Gloves AQUAGLOVE Protocol 1,2,3
Hydrochloric acid (HCl) SIGMA Protocol 1,2
Ice bucket Taiwan.Inc Protocol 2
Low retention pipette tips(0.5-10 µL) extra gene Protocol 1,2
Low retention pipette tips(1,250 µL) national scientific supply co, Inc. Protocol 1,2
Low retention pipette tips(200 µL) national scientific supply co, Inc. Protocol 1,2
MassARRAY  Agena Bioscience, CA Protocol 4, 5
Mass spectrometry control programs include Typer Chip Linker, SpectroACQUIRE, and Start RT Process.
MassARRAY Nanodispenser AAT Bioquest, Inc. RS1000 Protocol 3
Microcentrifuge Kubota Protocol 2
Microcentrifuge Clubio Protocol 2
Microcentrifuge tube (1.5 mL) National scientific supply co, Inc. Protocol 2
Microcentrifuge tube rack Taiwan.Inc Protocol 1,2
Micropipette  (P1000) Gilson Protocol 1,2
Micropipette  (P2) Gilson Protocol 1,2
Micropipette (P10) Gilson Protocol 1,2
Micropipette (P100) Gilson Protocol 1,2
Micropipette (P200) Gilson Protocol 1,2
Micropipette (SL2) Rainin Protocol 1,2
Oligonucleotides Integrated DNA Technologies (Singapore) Protocol 1,2
Quest Graph IC50 Calculator (v.1) AAT Bioquest, Inc. Fig. 4
https://www.aatbio.com/tools/ic50-calculator-v1
Sodium hydroxide (NaOH) WAKO Protocol 2
SpectroCHIP array  Agena Bioscience, CA #01509 Protocol 3, 5
Timer Taiwan.Inc Protocol 2
Typer 4.0 software  Agena Bioscience, CA #10145 Protocol 6
Typer 4.0 consists four programs including Assay Designer, Assay Editor, Plate Editor, and Typer Analyzer.
UDG Reaction Buffer (10x) New England Biolabs, MA B0280S Protocol 2
Uracil Glycosylase Inhibitor New England Biolabs, MA M0281S Protocol 2
Uracil-DNA Glycosylase New England Biolabs, MA M0280L Protocol 2
UV-VISBLE spectrophotometer UV-1601 SHIMADZU Protocol 1
Water bath ZETA ZC-4000 (Taiwan.Inc) Protocol 2
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Riferimenti

  1. Frederico, L. A., Kunkel, T. A., Shaw, B. R. A sensitive genetic assay for the detection of cytosine deamination: determination of rate constants and the activation energy. Biochimica. 29 (10), 2532-2537 (1990).
  2. Kavli, B., Otterlei, M., Slupphaug, G., Krokan, H. E. Uracil in DNA-General mutagen, but normal intermediate in acquired immunity. DNA Repair. 6 (4), 505-516 (2007).
  3. Duncan, B. K., Miller, J. H. Mutagenic deamination of cytosine residues in DNA. Nature. 287 (5782), 560-561 (1980).
  4. Gros, L., Saparbaev, M. K., Laval, J. Enzymology of the repair of free radicals-induced DNA damage. Oncogene. 21 (58), 8905-8925 (2002).
  5. Robertson, A. B., Klungland, A., Rognes, T., Leiros, I. Base excision repair: The long and short of it. Cellular and Molecular Life Sciences. 66 (6), 981-993 (2009).
  6. Lindahl, T. An N-glycosidase from Escherichia coli that releases free uracil from DNA containing deaminated cytosine residues. Proceedings of The National Academy of Sciences of the United States of America. 71 (9), 3649-3653 (1974).
  7. Caradonna, S. J., Cheng, Y. C. Uracil DNA-glycosylase. Purification and properties of this enzyme isolated from blast cells of acute myelocytic leukemia patients. Journal of Biological Chemistry. 255 (6), 2293-2300 (1980).
  8. Krokan, H., Urs Wittwer, C. Uracil DNA-glycosylase from HeLa cells: general properties, substrate specificity and effect of uracil analogs. Nucleic Acids Research. 9 (11), 2599-2614 (1981).
  9. Tchou, J., et al. 8-oxoguanine (8-hydroxyguanine) DNA glycosylase and its substrate specificity. Proceedings of The National Academy of Sciences of the United States of America. 88 (11), 4690-4694 (1991).
  10. Knævelsrud, I., et al. Excision of uracil from DNA by the hyperthermophilic Afung protein is dependent on the opposite base and stimulated by heat-induced transition to a more open structure. Mutation Research-DNA Repair. 487 (3-4), 173-190 (2001).
  11. Minko, I. G., et al. Recognition of DNA adducts by edited and unedited forms of DNA glycosylase NEIL1. DNA Repair. 85, 102741 (2020).
  12. Bennett, S. E., Sanderson, R. J., Mosbaugh, D. W. Processivity of Escherichia coli and rat liver mitochondrial uracil-DNA glycosylase is affected by NaCl concentration. Biochimica. 34 (18), 6109-6119 (1995).
  13. Xia, L., O’Connor, T. R. DNA glycosylase activity assay based on streptavidin paramagnetic bead substrate capture. Analytical Biochemistry. 298 (2), 322-326 (2001).
  14. Kreklau, E. L., et al. A novel fluorometric oligonucleotide assay to measure O(6)-methylguanine DNA methyltransferase, methylpurine DNA glycosylase, 8-oxoguanine DNA glycosylase and abasic endonuclease activities: DNA repair status in human breast carcinoma cells overexpressing methylpurine DNA glycosylase. Nucleic Acids Research. 29 (12), 2558-2566 (2001).
  15. Liu, B., et al. Real-time monitoring of uracil removal by uracil-DNA glycosylase using fluorescent resonance energy transfer probes. Analytical Biochemistry. 366 (2), 237-243 (2007).
  16. Zhang, L., Zhao, J., Jiang, J., Yu, R. A target-activated autocatalytic DNAzyme amplification strategy for the assay of base excision repair enzyme activity. Chemical Communications. 48 (70), 8820-8822 (2012).
  17. Zhou, D. M., et al. Graphene oxide-hairpin probe nanocomposite as a homogeneous assay platform for DNA base excision repair screening. Biosensors and Bioelectronics. 41, 359-365 (2013).
  18. Wang, X., Hou, T., Lu, T., Li, F. Autonomous exonuclease iii-assisted isothermal cycling signal amplification: A facile and highly sensitive fluorescence DNA glycosylase activity assay. Analytical Chemistry. 86 (19), 9626-9631 (2014).
  19. Wu, Y., Wang, L., Zhu, J., Jiang, W. A DNA machine-based fluorescence amplification strategy for sensitive detection of uracil-DNA glycosylase activity. Biosensors and Bioelectronics. 68, 654-659 (2015).
  20. Xi, Q., Li, J. J., Du, W. F., Yu, R. Q., Jiang, J. H. A highly sensitive strategy for base excision repair enzyme activity detection based on graphene oxide mediated fluorescence quenching and hybridization chain reaction. Analyst. 141 (1), 96-99 (2016).
  21. Liu, X., et al. A novel electrochemical biosensor for label-free detection of uracil DNA glycosylase activity based on enzyme-catalyzed removal of uracil bases inducing strand release. Electrochimica Acta. 113, 514-518 (2013).
  22. McWilliams, M. A., Anka, F. H., Balkus, K. J., Slinker, J. D. Sensitive and selective real-time electrochemical monitoring of DNA repair. Biosensors and Bioelectronics. 54, 541-546 (2014).
  23. Jiao, F., et al. A novel and label-free biosensors for uracil-DNA glycosylase activity based on the electrochemical oxidation of guanine bases at the graphene modified electrode. Talanta. 147, 98-102 (2016).
  24. Liu, X., et al. Label-free colorimetric assay for base excision repair enzyme activity based on nicking enzyme assisted signal amplification. Biosensors and Bioelectronics. 54, 598-602 (2014).
  25. Nie, H., Wang, W., Li, W., Nie, Z., Yao, S. A colorimetric and smartphone readable method for uracil-DNA glycosylase detection based on the target-triggered formation of G-quadruplex. Analyst. 140 (8), 2771-2777 (2015).
  26. Du, Y. C., Jiang, H. X., Huo, Y. F., Han, G. M., Kong, D. M. Optimization of strand displacement amplification-sensitized G-quadruplex DNAzyme-based sensing system and its application in activity detection of uracil-DNA glycosylase. Biosensors and Bioelectronics. 77, 971-977 (2016).
  27. Haff, L. A., Smirnov, I. P. Single-nucleotide polymorphism identification assays using a thermostable DNA polymerase and delayed extraction MALDI-TOF mass spectrometry. Genome Research. 7 (4), 378-388 (1997).
  28. Blondal, T., et al. A novel MALDI-TOF based methodology for genotyping single nucleotide polymorphisms. Nucleic Acids Research. 31 (24), 155 (2003).
  29. Cui, Z., Theruvathu, J. A., Farrel, A., Burdzy, A., Sowers, L. C. Characterization of synthetic oligonucleotides containing biologically important modified bases by matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry. Analytical Biochemistry. 379 (2), 196-207 (2008).
  30. Darwanto, A., Farrel, A., Rogstad, D. K., Sowers, L. C. Characterization of DNA glycosylase activity by matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry. Analytical Biochemistry. 394 (1), 13-23 (2009).
  31. Redrejo-Rodríguez, M., et al. New insights in the removal of the Hydantoins, oxidation product of pyrimidines, via the base excision and Nucleotide incision repair pathways. PLoS ONE. 6 (7), 21039 (2011).
  32. Prorok, P., et al. Uracil in duplex DNA is a substrate for the nucleotide incision repair pathway in human cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (39), 3695-3703 (2013).
  33. Alexeeva, M., et al. Excision of uracil from DNA by hSMUG1 includes strand incision and processing. Nucleic Acids Research. 47 (2), 779-793 (2019).
  34. Thapar, U., Demple, B. Deployment of DNA polymerases beta and lambda in single-nucleotide and multinucleotide pathways of mammalian base excision DNA repair. DNA Repair. 76, 11-19 (2019).
  35. Su, K. Y., et al. Proofreading and DNA repair assay using single nucleotide extension and MALDI-TOF mass spectrometry analysis. Journal of Visualized Experiments : JoVE. (136), e57862 (2018).
  36. Hillenkamp, F., Karas, M., Beavis, R. C., Chait, B. T. Matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry of biopolymers. Analytical Chemistry. 63 (24), 1193-1202 (1991).
  37. Brammer, K. W., Jones, A. S., Mian, A. M., Walker, R. T. Study of the use of alkaline degradation of DNA derivative as a procedure for the determination of nucleotide distribution. Biochimica et Biophysica Acta. 166 (3), 732-734 (1968).
  38. Lindahl, T., Ljungquist, S., Siegert, W., Nyberg, B., Sperens, B. DNA N-glycosidases: properties of uracil-DNA glycosidase from Escherichia coli. Journal of Biological Chemistry. 252 (10), 3286-3294 (1977).
  39. Rashtchian, A., Buchman, G. W., Schuster, D. M., Berninger, M. S. Uracil DNA glycosylase-mediated cloning of polymerasechain reaction-amplified DNA: Application to genomic and cDNA cloning. Analytical Biochemistry. 206 (1), 91-97 (1992).
  40. Varshney, U., van de Sande, J. H. Specificities and kinetics of uracil excision from uracil-containing DNA oligomers by Escherichia coli uracil DNA glycosylase. Biochimica. 30 (16), 4055-4061 (1991).
  41. Delort, A. M., et al. Excision of uracil residues in DNA: Mechanism of action of Escherichia coli and Micrococcus luteus uracil-DNA glycosylases. Nucleic Acids Research. 13 (2), 319-335 (1985).
  42. Wang, Z. G., Smith, D. G., Mosbaugh, D. W. Overproduction and characterization of the uracil-DNA glycosylase inhibitor of bacteriophage PBS2. Gene. 99 (1), 31-37 (1991).
  43. Chang, H. L., et al. Measurement of uracil-DNA glycosylase activity by matrix assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry technique. DNA Repair. 97, 103028 (2021).
  44. Minko, I. G., et al. Catalysts of DNA strand cleavage at apurinic/apyrimidinic sites. Scientific Reports. 6 (1), 28894 (2016).
  45. Lindahl, T. Uracil-DNA glycosylase from Escherichia coli. Methods in Enzymology. 65, 284-290 (1980).

Tags

Keywords: Uracil-DNA GlycosylaseMALDI-TOF Mass SpectrometryDNA RepairAP ProductLabel-freeEnzyme Activity AssayGuanine-uracil BaseReaction BufferSubstrate PreparationReaction Termination
check_url/it/63089?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citazione di questo articolo
Chang, H., Su, K., Goodman, S. D., Cheng, W., Lin, L., Yang, Y., Chang, S., Fang, W. Uracil-DNA Glycosylase Assay by Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-flight Mass Spectrometry Analysis. J. Vis. Exp. (182), e63089, doi:10.3791/63089 (2022).
Scarica citazione
Ristampe e autorizzazioni

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image