小児びまん性正中線神経膠腫の生3D細胞免疫細胞化学アッセイ
Summary
この研究は、小児びまん性正中線グリオーマ細胞株に適用される生3D細胞免疫細胞化学のプロトコルを提示し、3D細胞の浸潤や遊走などの動的プロセス中の原形質膜上のタンパク質の発現をリアルタイムで研究するのに役立ちます。
Abstract
細胞の移動と浸潤は、びまん性正中線神経膠腫(DMG)H3K27M変異腫瘍の特定の特徴です。これらの特徴は、3次元(3D)細胞ベースの浸潤および遊走アッセイを使用してすでにモデル化されています。本研究では、これらの3Dアッセイを生細胞免疫細胞化学用に最適化しました。抗体標識試薬を使用して、DMG H3K27M初代患者由来細胞株の遊走細胞および浸潤細胞の原形質膜上の接着分子CD44の発現をリアルタイムで検出しました。CD44は、癌幹細胞の表現型および腫瘍細胞の移動および浸潤に関連しており、中枢神経系(CNS)細胞外マトリックスとの直接的な相互作用に関与しています。DMG H3K27M細胞株由来のニューロスフェア(NS)を、抗体標識試薬(ALR)と併せて抗CD44抗体の存在下で、基底膜マトリックス(BMM)に埋め込むか、またはBMMの薄いコーティング層上に配置した。生細胞解析装置で生3D細胞免疫細胞化学画像解析を行い、CD44発現全体、特に遊走細胞と浸潤細胞を定量的に測定しました。この方法はまた、遊走および浸潤する細胞の原形質膜上のCD44の間欠的発現をリアルタイムで視覚化することを可能にする。さらに、このアッセイは、DMG H3K27M細胞の間葉系からアメーバへの移行におけるCD44の潜在的な役割に関する新しい洞察も提供しました。
Introduction
腫瘍細胞が周囲の組織を回避して拡散する能力は、癌の特徴です1。特に、腫瘍細胞の運動性は、乳房2や結腸直腸癌3などの転移性腫瘍型であろうと、びまん性神経膠腫4,5などの局所浸潤型であろうと、悪性腫瘍の特徴です。
イメージングは、腫瘍細胞の表現型の多くの側面の調査において中心的な役割を果たします。しかし、形態や細胞間相互作用の変化が起こり6,7、時間の経過とともにより簡単に調べることができる移動や浸潤などの動的な細胞プロセスを研究する場合は、生細胞イメージングが確実に好まれます。生細胞イメージングのために、位相差から共焦点蛍光顕微鏡まで、異なる光学顕微鏡システムを使用することができ、温度およびCO2制御用のチャンバーを備えた倒立顕微鏡、またはチャンバーを内蔵したハイコンテント画像解析システム、または全期間にわたって細胞を乱すことなくインキュベーター内に座ることができる画像システムにおいて、短期間または長期間にわたって画像取得を行うことができる実験の。使用するシステムの選択は、多くの場合、必要な分離能、全体的な取得時間と時間間隔の長さ、使用する容器の種類とアッセイのスループット(シングルチャンバーまたはマルチウェルプレート)、使用する細胞(貴細胞および/または希少細胞)の感度、蛍光色素が存在する場合の細胞の光毒性など、多くの要因によって決まります。
ライブモードでの蛍光イメージングに関しては、これは、安定した発現のために、または誘導可能なシステム8として蛍光タンパク質の発現のために細胞を形質導入することによって、一過性の細胞トランスフェクションによって、または生細胞標識7、生細胞追跡および細胞内オルガネラ9の標識のために現在利用可能な細胞色素を使用することによって達成することができる。
生細胞免疫細胞化学に有用なアプローチが最近開発されており、選択した表面マーカーを認識する抗体を標識試薬に結合させ、培地に添加すると、特異的マーカーを発現する細胞を生細胞イメージングによってリアルタイムで容易にイメージングできます。このようなシステムを用いたマーカー発現の可視化および定量化は、細胞が2次元(2D)培養条件下で増殖する場合に容易に達成することができる10。
この研究では、小児びまん性正中線神経膠腫(DMG)患者由来の細胞の生3D細胞免疫細胞化学の侵入と遊走のためのプロトコルを最適化しました11,12。DMGは、小児に影響を及ぼす非常に侵攻性の高い脳腫瘍であり、大多数はヒストンH3変異体におけるドライバー変異K27Mに関連する。DMGは、脳幹および中枢神経系(CNS)の正中線領域に発生し、非常に浸潤性の性質を特徴としています。この浸潤能力は、少なくとも部分的には、腫瘍内不均一性およびDMG細胞の癌幹様特徴によって媒介されることが示されている7。
アッセイを例示するために、抗体標識試薬(ALR)をCD44に対する抗体と組み合わせて使用しました。CD44は、幹細胞および他の細胞型に発現する膜貫通糖タンパク質および接着分子であり、癌幹細胞表現型ならびに腫瘍細胞の移動および浸潤に関連する13。プロトコルには、サンプル調製、明視野および蛍光モードでの画像取得、および3D侵入および遊走中のDMG細胞膜上の全体的なCD44発現をリアルタイムで定量的に測定できる生細胞分析装置での解析が含まれます。アッセイはまた、遊走および浸潤中の個々の細胞上のCD44の断続的な蛍光シグナルを視覚化する可能性を可能にしました。興味深いことに、抗CD44抗体の効果も観察され、これは潜在的にブロッキング抗体として作用し、細胞の移動と浸潤を減少させるだけでなく、集合間葉様からより単一細胞アメーバ様表現型への浸潤パターンの切り替えを誘導するようでした。
Protocol
Representative Results
Discussion
今回採用した小児DMGの浸潤および遊走に採用した生3D細胞免疫細胞化学は、乳がんや結腸がんの細胞株など、他の高侵襲性腫瘍細胞にも容易に適応できます。
以前に実施された生2D細胞免疫細胞化学アッセイ10とは異なり、3Dで作業する場合、いくつかの重要なステップに注意を払うことが示唆される。特に、ここで説明する浸潤アッセイでは、BMMを添?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
イメージングプロトコルの予備セットアップでIncuCyte S3ライブセルイメージングシステムにアクセスしてくださったSilvia Sodu博士とGiulia Federici博士(IRCCS-Regina Elena National Cancer Institute、ローマ、イタリア)に感謝します。さらに、技術的なアドバイスを提供してくれたBernadett Kolozsvariに感謝します。この研究は、Children with Cancer UK助成金(16-234)とイタリア保健省Ricerca Correnteの支援を受けた。Mヴィンチは、小児がん英国フェローです。Rフェレッティは、フォンダツィオーネヴェロネーゼフェローシップ(2018年および2019年)の受賞者です。著者らは、Fondazione Healの支援と、クイーンズランド小児腫瘍バンクへの資金提供を行った小児病院財団に感謝しています。
Materials
| 96 Well TC-Treated Microplates | Corning | 3595 | size 96 wells, polystyrene plate, flat bottom |
| Accutase | Euroclone | ECB3056D | solution for neurosphere dissociation |
| Burker chamber | Mv medical | FFL16034 | cell counting chamber |
| CD-44 (156-3C11) | Cell Signaling Technology | 3570 | Mouse mAb IgG2a |
| Corning Matrigel Matrix | Corning | 356237 | Basement Membrane Matrix (BMM), Phenol Red-free, LDEV-free |
| Fabfluor-488 Antibody Labeling Dye | Incucyte | 4743 | Antibody labelling reagent (ALR): Mouse IgG2a 488 antibody for Live-Cell Immunocytochemistry |
| Incucyte S3 and/or SX5 Live-Cell Analysis Instrument | Sartorius | – | The Incucyte S3 and/or SX5 Instrument is used for real-time cell monitoring and surveillance, cell health and viability, migration and invasion, plus a wide range of phenotypic cell-based assays. |
| Inverted Microscope | – | any inverted microscope | |
| Opti-Green Background Suppressor Reagent | Incucyte | 6500-0045 | Backgroung suppressor reagent (BSR) |
| Tumor stem cell (TSM) medium | – | – | growth cell medium (see reference in the text for details) |
| Ultra-Low Attachment Multiple Well Plate | Corning Costar | 7007 | size 96 well, round bottom clear |
Riferimenti
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