Ensaios de imunocitoquímica de células 3D vivas de glioma difuso da linha média pediátrica
Summary
Este estudo apresenta um protocolo de imunocitoquímica de células vivas 3D aplicado a uma linhagem celular pediátrica de glioma difuso da linha média, útil para estudar em tempo real a expressão de proteínas na membrana plasmática durante processos dinâmicos como invasão e migração de células 3D.
Abstract
A migração e invasão celular são características específicas dos tumores mutantes H3K27M de glioma difuso da linha média (DMG). Já modelamos essas características usando ensaios tridimensionais (3D) de invasão e migração baseados em células. Neste estudo, otimizamos esses ensaios 3D para imunocitoquímica de células vivas. Um Antibody Labeling Reagent foi usado para detectar em tempo real a expressão da molécula de adesão CD44, na membrana plasmática de células migratórias e invasoras de uma linhagem celular primária derivada de paciente DMG H3K27M. O CD44 está associado ao fenótipo de células-tronco cancerígenas e à migração e invasão de células tumorais e está envolvido nas interações diretas com a matriz extracelular do sistema nervoso central (SNC). As neuroesferas (NS) da linhagem celular DMG H3K27M foram embutidas na matriz de membrana basal (BMM) ou colocadas em uma fina camada de revestimento de BMM, na presença de um anticorpo anti-CD44 em conjunto com o reagente de marcação de anticorpos (ALR). A análise de imagens imunocitoquímicas de células vivas em 3D foi realizada em um instrumento de análise de células vivas para medir quantitativamente a expressão global de CD44, especificamente nas células migrantes e invasoras. O método também permite visualizar em tempo real a expressão intermitente de CD44 na membrana plasmática de células migratórias e invasoras. Além disso, o ensaio também forneceu novos conhecimentos sobre o papel potencial do CD44 na transição mesenquimal para ameboide em células DMG H3K27M.
Introduction
A capacidade das células tumorais de evadir e disseminar-se através do tecido circundante é uma característica do câncer1. Em particular, a motilidade das células tumorais é uma característica dos tumores malignos, seja um tipo de tumor metastático, comoo câncer de mama2 ou colorretal3, ou um tipo localmente invasivo, como o gliomadifuso4,5.
Os exames de imagem têm um papel central na investigação de muitos aspectos dos fenótipos de células tumorais; No entanto, a imagem de células vivas é definitivamente preferida quando se estudam processos celulares dinâmicos, como migração e invasão, quando ocorrem mudanças na morfologia e na interaçãocélula-célula6,7 e podem ser mais facilmente examinadas ao longo do tempo. Para imagens de células vivas, diferentes sistemas de microscopia óptica podem ser usados, desde contraste de fase até microscópios confocais fluorescentes, e aquisição de imagens realizadas por um curto ou longo período de tempo em um microscópio invertido equipado com uma câmara para controle de temperatura e CO2, ou em sistemas de análise de imagem de alto conteúdo que possuem câmaras embutidas, ou alternativamente em sistemas de imagem que podem ficar na incubadora sem a necessidade de perturbar as células durante toda a duração do experimento. A escolha do sistema utilizado é frequentemente ditada por uma série de fatores, tais como a resolução necessária, a duração do tempo total de aquisição e intervalos de tempo, o tipo de vaso utilizado e o rendimento do ensaio (câmara única ou placa de poço múltiplo), a sensibilidade das células utilizadas (células preciosas e/ou raras) e a fototoxicidade das células se fluoroforóricos estiverem presentes.
No que diz respeito à imagem fluorescente em modo vivo, isso pode ser obtido pela transdução de células para a expressão de proteínas fluorescentes para expressão estável ou como um sistema induzível8, por transfecção celular transitória ou pelo uso de corantes celulares que agora estão disponíveis para marcação de células vivas7, para rastreamento de células vivas e para marcação de organelas subcelulares9.
Uma abordagem útil foi recentemente desenvolvida para imunocitoquímica de células vivas, onde um anticorpo reconhecendo um marcador de superfície de escolha pode ser ligado a um reagente de marcação e, após adição ao meio de cultura, as células que expressam o marcador específico podem ser prontamente imageadas em tempo real por imagens de células vivas. A visualização e quantificação da expressão de marcadores por este sistema podem ser facilmente obtidas quando as células são cultivadas em condições de cultura bidimensional (2D)10.
Neste estudo, otimizamos protocolos para invasão imunocitoquímica de células vivas 3D e migração de células pediátricas derivadas de glioma difuso da linha média (DMG)do paciente 11,12. DMG são tumores cerebrais altamente agressivos que afetam crianças, para a grande maioria associados com a mutação condutora K27M em variantes de histona H3. As DMG surgem no tronco cerebral e nas regiões da linha média do sistema nervoso central (SNC) e são caracterizadas por uma natureza altamente infiltrativa. Demonstrou-se que essa capacidade invasiva é, pelo menos em parte, mediada pela heterogeneidade intratumoral e pelas características cancerígenas das células DMG7.
Para exemplificar nossos ensaios, um reagente de marcação de anticorpos (ALR) foi usado em combinação com um anticorpo para CD44. CD44 é uma glicoproteína transmembrana e molécula de adesão expressa em células-tronco e outros tipos celulares, associada ao fenótipo de células-tronco cancerígenas e à migração e invasão de célulastumorais13. Os protocolos incluem a preparação da amostra, a aquisição da imagem em modo de campo claro e fluorescente e a análise em um instrumento de análise de células vivas que permitiu medir quantitativamente em tempo real a expressão global de CD44 na membrana celular DMG durante a invasão e migração 3D. Os ensaios também permitiram visualizar o sinal fluorescente intermitente de CD44 em células individuais durante a migração e a invasão. Curiosamente, um efeito do anticorpo anti-CD44 também foi observado, que potencialmente agindo como um anticorpo bloqueador, também pareceu reduzir a migração e invasão celular, bem como induzir uma mudança do padrão de invasão de um mesenquimal coletivo para um fenótipo amebóide-like de célula única.
Protocol
Representative Results
Discussion
A imunocitoquímica de células vivas 3D que adotamos aqui para invasão e migração de DMG pediátrica pode ser facilmente adaptada também para outros tipos de células tumorais altamente invasivas, incluindo linhagens de células de câncer de mama e cólon.
Diferentemente dos ensaios de imunocitoquímica de células vivas2D previamente realizados 10, quando se trabalha em 3D, sugere-se atentar para algumas etapas críticas. Em particular, para o ensaio de invasão…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gostaríamos de agradecer à Dra. Silvia Soddu e à Dra. Giulia Federici (Unidade de Redes Celulares e Alvos Terapêuticos Moleculares, IRCCS-Regina Elena National Cancer Institute, Roma, Itália) pelo acesso ao IncuCyte S3 Live Cell Imaging System na configuração preliminar do protocolo de imagem. Além disso, agradecemos a Bernadett Kolozsvari pela assessoria técnica. O estudo foi apoiado pela bolsa Children with Cancer UK (16-234) e pelo Ministério da Saúde italiano Ricerca Corrente. M Vinci é bolsista da Children with Cancer UK. R Ferretti recebeu a bolsa Fondazione Veronesi (2018 e 2019). Os autores agradecem à Fondazione Heal por seu apoio e à Children’s Hospital Foundation pelo financiamento do Queensland Children’s Tumor Bank.
Materials
| 96 Well TC-Treated Microplates | Corning | 3595 | size 96 wells, polystyrene plate, flat bottom |
| Accutase | Euroclone | ECB3056D | solution for neurosphere dissociation |
| Burker chamber | Mv medical | FFL16034 | cell counting chamber |
| CD-44 (156-3C11) | Cell Signaling Technology | 3570 | Mouse mAb IgG2a |
| Corning Matrigel Matrix | Corning | 356237 | Basement Membrane Matrix (BMM), Phenol Red-free, LDEV-free |
| Fabfluor-488 Antibody Labeling Dye | Incucyte | 4743 | Antibody labelling reagent (ALR): Mouse IgG2a 488 antibody for Live-Cell Immunocytochemistry |
| Incucyte S3 and/or SX5 Live-Cell Analysis Instrument | Sartorius | – | The Incucyte S3 and/or SX5 Instrument is used for real-time cell monitoring and surveillance, cell health and viability, migration and invasion, plus a wide range of phenotypic cell-based assays. |
| Inverted Microscope | – | any inverted microscope | |
| Opti-Green Background Suppressor Reagent | Incucyte | 6500-0045 | Backgroung suppressor reagent (BSR) |
| Tumor stem cell (TSM) medium | – | – | growth cell medium (see reference in the text for details) |
| Ultra-Low Attachment Multiple Well Plate | Corning Costar | 7007 | size 96 well, round bottom clear |
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