Questo studio presenta un protocollo di immunocitochimica delle cellule 3D vive applicato ad una linea cellulare di glioma diffuso pediatrico della linea mediana, utile per studiare in tempo reale l'espressione delle proteine sulla membrana plasmatica durante processi dinamici come l'invasione e la migrazione delle cellule 3D.
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Articolo metodologico
Saggi di immunocitochimica delle cellule 3D del glioma diffuso della linea mediana pediatrica
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
La migrazione e l'invasione cellulare sono caratteristiche specifiche dei tumori mutanti H3K27M del glioma diffuso della linea mediana (DMG). Abbiamo già modellato queste caratteristiche utilizzando saggi di invasione e migrazione tridimensionali (3D) basati su cellule. In questo studio, abbiamo ottimizzato questi saggi 3D per l'immunocitochimica delle cellule vive. Un antibody labeling reagent è stato utilizzato per rilevare in tempo reale l'espressione della molecola di adesione CD44, sulla membrana plasmatica delle cellule migranti e invasive di una linea cellulare primaria DMG H3K27M derivata dal paziente. CD44 è associato al fenotipo delle cellule staminali tumorali e alla migrazione e invasione delle cellule tumorali ed è coinvolto nelle interazioni dirette con la matrice extracellulare del sistema nervoso centrale (SNC). Le neurosfere (NS) della linea cellulare DMG H3K27M sono state incorporate nella matrice della membrana basale (BMM) o posizionate su un sottile strato di rivestimento di BMM, in presenza di un anticorpo anti-CD44 in combinazione con il reagente di etichettatura degli anticorpi (ALR). L'analisi dell'immagine immunocitochimica delle cellule 3D vive è stata eseguita su uno strumento di analisi delle cellule vive per misurare quantitativamente l'espressione complessiva di CD44, in particolare sulle cellule migratorie e invasori. Il metodo consente inoltre di visualizzare in tempo reale l'espressione intermittente di CD44 sulla membrana plasmatica delle cellule migratorie e invasori. Inoltre, il test ha anche fornito nuove informazioni sul potenziale ruolo di CD44 nella transizione da mesenchimale ad ameboide nelle cellule DMG H3K27M.
Introduzione
La capacità delle cellule tumorali di eludere e diffondersi attraverso il tessuto circostante è un segno distintivo del cancro1. In particolare, la motilità delle cellule tumorali è una caratteristica dei tumori maligni, sia che si tratti di un tipo di tumore metastatico come il cancro della mammella2 o del colon-retto3 o di un tipo localmente invasivo come il glioma diffuso 4,5.
L'imaging ha un ruolo centrale nello studio di molti aspetti dei fenotipi delle cellule tumorali; Tuttavia, l'imaging delle cellule vi....
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Protocollo
Questo protocollo segue le linee guida dei comitati etici per la ricerca umana delle istituzioni.
NOTA: Questo studio è stato eseguito utilizzando Incucyte S3 e/o SX5 Live-Cell Analysis Instrument (indicato come strumento di analisi delle cellule vive).
1. Generazione di sferoidi tumorali di dimensioni riproducibili
NOTA: Il protocollo (sezione 1) descritto da Vinci et al. 2015 7,12, è stato utilizzato come riportato di seguito, con alcune modifiche:
- Raccogliere le neurosfere (NS) mutanti DMG H3K27M e....
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Risultati
Il protocollo di immunocitochimica delle cellule 3D vive per l'invasione e la migrazione è riassunto in un flusso di lavoro semplice e riproducibile nella Figura 1. Seminando le celle DMG in piastre a fondo tondo ULA a 96 pozzetti, si ottengono NS di dimensioni riproducibili e vengono utilizzate nei passaggi visualizzati. Quando i NS hanno raggiunto la dimensione ideale di ~300 μm (circa 4 giorni dopo la semina) vengono avviati i saggi di invasione12 e migrazione
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Discussione
L'immunocitochimica delle cellule 3D vive che abbiamo adottato qui per l'invasione e la migrazione del DMG pediatrico potrebbe essere facilmente adattata anche per altri tipi di cellule tumorali altamente invasive, comprese le linee cellulari di cancro al seno e al colon.
A differenza dei saggi di immunocitochimica delle cellule 2D vive precedentemente eseguiti10, quando si lavora in 3D, si suggerisce di prestare attenzione ad alcuni passaggi critici. In particolare, p.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno affiliazioni rilevanti o coinvolgimento finanziario con qualsiasi organizzazione o entità con un interesse finanziario o un conflitto finanziario con l'argomento o i materiali discussi nel manoscritto.
Ringraziamenti
Si ringraziano la Dott.ssa Silvia Soddu e la Dott.ssa Giulia Federici (Unità di Reti Cellulari e Bersagli Terapeutici Molecolari, IRCCS-Istituto Nazionale Tumori Regina Elena, Roma, Italia) per l'accesso al sistema di imaging IncuCyte S3 Live Cell nell'impostazione preliminare del protocollo di imaging. Inoltre, ringraziamo Bernadett Kolozsvari per la consulenza tecnica. Lo studio è stato sostenuto dalla sovvenzione Children with Cancer UK (16-234) e dal Ministero della Salute italiano Ricerca Corrente. M Vinci è un Children with Cancer UK Fellow. R Ferretti è vincitore della Fondazione Veronesi Fellowship (2018 e 2019). Gli autori riconoscono Fondazione Heal per il l....
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Micropiastre trattate con TC a 96 pozzetti | Corning | 3595 | dimensione 96 pozzetti, piastra in polistirene, fondo piatto |
| Accutase | Euroclone | ECB3056D | soluzione per la dissociazione della neurosfera |
| Camera Burker | Mv camera di | conteggio cellulare | FFL16034 |
| CD-44 (156-3C11) | Tecnologia di segnalazione cellulare | 3570 | Mouse mAb IgG2a |
| Corning Matrigel Matrix | Corning | 356237 | Matrice della membrana basale (BMM), senza rosso fenolo, senza LDEV |
| Colorante per la marcatura degli anticorpi Fabfluor-488 | Incucyte | 4743 | Reagente per la marcatura degli anticorpi (ALR): anticorpo IgG2a 488 di topo per l'immunocitochimica a cellule vive |
| Incucyte S3 e/o strumento per l'analisi delle cellule vive SX5 | Sartorius | - | Lo strumento Incucyte S3 e/o SX5 viene utilizzato per il monitoraggio e la sorveglianza cellulare in tempo reale, la salute e la vitalità cellulare, la migrazione e l'invasione, oltre a un'ampia gamma di saggi fenotipici basati su cellule. |
| Microscopio | invertito-qualsiasi | microscopio invertito | |
| Opti-Green Background Suppressor Reagent | Incucyte | 6500-0045 | Backgroung suppressor reagent (BSR) |
| Tumor stem cell (TSM) medium | - | - | cell medium (vedere il riferimento nel testo per i dettagli) |
| Ultra-Low Attachment Multiple Well Plate | Corning Costar | 7007 | size 96 well, fondo rotondo chiaro |
Riferimenti
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
- Weigelt, B., Peterse, J. L., van’t Veer, L. J. Breast cancer metastasis: markers and models. Nature Reviews Cancer. 5 (8), 591-602 (2005).
- Magrì, A., Bardelli, A.
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Ristampe e permessi
