Live-3D-celle immuncytokemiske assays af pædiatrisk diffust midterliniegliom
Summary
Denne undersøgelse præsenterer en protokol for live-3D-celleimmunocytokemi anvendt på en pædiatrisk diffus midterliniegliomcellelinje, nyttig til i realtid at studere ekspressionen af proteiner på plasmamembranen under dynamiske processer som 3D-celleinvasion og migration.
Abstract
Cellemigration og invasion er specifikke kendetegn ved diffus midterliniegliom (DMG) H3K27M-mutante tumorer. Vi har allerede modelleret disse funktioner ved hjælp af tredimensionelle (3D) cellebaserede invasions- og migrationsanalyser. I denne undersøgelse har vi optimeret disse 3D-assays til levende celleimmuncytokemi. Et antistofmærkningsreagens blev brugt til i realtid at detektere ekspressionen af adhæsionsmolekylet CD44 på plasmamembranen i migrerende og invaderende celler i en DMG H3K27M primær patientafledt cellelinje. CD44 er forbundet med kræft stamcelle fænotype og tumorcelle migration og invasion og er involveret i de direkte interaktioner med centralnervesystemet (CNS) ekstracellulære matrix. Neurosfærer (NS) fra DMG H3K27M-cellelinjen blev indlejret i basalmembranmatrixen (BMM) eller anbragt på et tyndt belægningslag af BMM i nærvær af et anti-CD44-antistof i forbindelse med antistofmærkningsreagenset (ALR). Live-3D-celle immuncytokemi billedanalysen blev udført på et levende celleanalyseinstrument for kvantitativt at måle den samlede CD44-ekspression, specifikt på de migrerende og invaderende celler. Metoden tillader også visualisering i realtid af den intermitterende ekspression af CD44 på plasmamembranen i migrerende og invaderende celler. Desuden gav analysen også ny indsigt i CD44’s potentielle rolle i den mesenkymale til amoeboide overgang i DMG H3K27M-celler.
Introduction
Tumorcellernes evne til at undvige og sprede sig gennem det omgivende væv er et kendetegn ved kræft1. Især tumorcellemotilitet er et karakteristisk træk ved maligne tumorer, uanset om det er en metastatisk tumortype såsom bryst2 eller kolorektal cancer3 eller en lokalt invasiv type såsom diffust gliom 4,5.
Billeddannelse har en central rolle i undersøgelsen af mange aspekter af tumorcellefænotyper; Imidlertid er levende cellebilleddannelse absolut at foretrække, når man studerer dynamiske cellulære processer som migration og invasion, når ændringer i morfologi og celle-celle-interaktion 6,7 forekommer og lettere kan undersøges over tid. Til levende cellebilleddannelse kan forskellige optiske mikroskopisystemer anvendes, fra fasekontrast til konfokale fluorescerende mikroskoper, og billedoptagelse udføres over en kort eller lang periode på et omvendt mikroskop udstyret med et kammer til temperatur og CO2 -kontrol eller i billedanalysesystemer med højt indhold, der har indbyggede kamre, eller alternativt i billedsystemer, der kan sidde i inkubatoren uden behov for at forstyrre cellerne under hele varigheden af eksperimentet. Valget af det anvendte system dikteres ofte af en række faktorer såsom nødvendig opløsning, længden af den samlede anskaffelsestid og tidsintervaller, anvendt beholdertype og analysens gennemstrømning (enkeltkammer eller multibrøndplade), følsomheden af de anvendte celler (ædle og/eller sjældne celler) og cellernes fototoksicitet, hvis fluoroforer er til stede.
Med hensyn til fluorescerende billeddannelse i levende tilstand kan dette opnås ved transducering af celler til ekspression af fluorescerende proteiner enten til stabil ekspression eller som et inducerbart system8, ved forbigående celletransfektion eller ved at bruge cellefarvestoffer, som nu er tilgængelige til mærkning af levende celler7, til sporing af levende celler samt til mærkning af subcellulære organeller9.
En nyttig tilgang er for nylig blevet udviklet til levende celleimmuncytokemi, hvor et antistof, der genkender en overflademarkør efter eget valg, kan bindes til et mærkningsreagens, og ud over kulturmediet kan celler, der udtrykker den specifikke markør, let afbildes i realtid ved levende cellebilleddannelse. Visualisering og kvantificering af markørekspression ved hjælp af et sådant system kan let opnås, når celler dyrkes i todimensionelle (2D) kulturbetingelser10.
I denne undersøgelse optimerede vi protokoller for live-3D-celle immuncytokemi invasion og migration af pædiatrisk diffust midline gliom (DMG) patientafledte celler11,12. DMG er meget aggressive hjernetumorer, der påvirker børn, for langt de fleste forbundet med drivermutationen K27M i histon H3-varianter. DMG opstår i hjernestammen og midterlinjeregionerne i centralnervesystemet (CNS) og er kendetegnet ved en meget infiltrativ karakter. Denne invasive kapacitet har vist sig at være i det mindste delvist medieret af intratumorheterogeniteten og de kræftstammelignende træk ved DMG-celler7.
For at eksemplificere vores analyser blev der anvendt et antistofmærkningsreagens (ALR) i kombination med et antistof mod CD44. CD44 er et transmembranglycoprotein og adhæsionsmolekyle udtrykt på stamceller og andre celletyper, forbundet med kræftstamcellefænotype og tumorcellemigration og invasion13. Protokollerne omfatter prøveforberedelsen, billedoptagelsen i brightfield og fluorescerende tilstand og analysen på et live-celleanalyseinstrument, der gjorde det muligt kvantitativt at måle i realtid det samlede CD44-udtryk på DMG-cellemembranen under 3D-invasion og migration. Assays tillod også muligheden for at visualisere det intermitterende fluorescerende signal fra CD44 på individuelle celler under migrering og invasion. Interessant nok blev der også observeret en effekt af anti-CD44-antistoffet, som potentielt fungerede som et blokerende antistof, også syntes at reducere cellemigration og invasion samt at fremkalde et skift af invasionsmønsteret fra en kollektiv mesenkymallignende til en mere enkeltcelle amoeboidlignende fænotype.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den levende 3D-celle immuncytokemi, vi har vedtaget her til pædiatrisk DMG invasion og migration, kunne let tilpasses også til andre meget invasive tumorcelletyper, herunder bryst- og tyktarmskræftcellelinjer.
Forskellig fra tidligere udførte live-2D-celle immunocytokemiske assays10, når man arbejder i 3D, foreslås det at være opmærksom på nogle kritiske trin. Især til den invasionsanalyse, vi beskriver, anbefales det at tilføje ALR / antistofblandingen dire…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vil gerne takke Dr. Silvia Soddu og Dr. Giulia Federici (Unit of Cellular Networks and Molecular Therapeutic Targets, IRCCS-Regina Elena National Cancer Institute, Rom, Italien) for adgang til IncuCyte S3 Live Cell Imaging System i den foreløbige opsætning af billeddannelsesprotokollen. Desuden takker vi Bernadett Kolozsvari for den tekniske rådgivning. Undersøgelsen blev støttet af Children with Cancer UK-tilskuddet (16-234) og det italienske sundhedsministerium Ricerca Corrente. M Vinci er en Børn med Cancer UK Fellow. R Ferretti er modtager af Fondazione Veronesi Fellowship (2018 og 2019). Forfatterne anerkender Fondazione Heal for deres støtte og Children’s Hospital Foundation for finansiering af Queensland Children’s Tumor Bank.
Materials
| 96 Well TC-Treated Microplates | Corning | 3595 | size 96 wells, polystyrene plate, flat bottom |
| Accutase | Euroclone | ECB3056D | solution for neurosphere dissociation |
| Burker chamber | Mv medical | FFL16034 | cell counting chamber |
| CD-44 (156-3C11) | Cell Signaling Technology | 3570 | Mouse mAb IgG2a |
| Corning Matrigel Matrix | Corning | 356237 | Basement Membrane Matrix (BMM), Phenol Red-free, LDEV-free |
| Fabfluor-488 Antibody Labeling Dye | Incucyte | 4743 | Antibody labelling reagent (ALR): Mouse IgG2a 488 antibody for Live-Cell Immunocytochemistry |
| Incucyte S3 and/or SX5 Live-Cell Analysis Instrument | Sartorius | – | The Incucyte S3 and/or SX5 Instrument is used for real-time cell monitoring and surveillance, cell health and viability, migration and invasion, plus a wide range of phenotypic cell-based assays. |
| Inverted Microscope | – | any inverted microscope | |
| Opti-Green Background Suppressor Reagent | Incucyte | 6500-0045 | Backgroung suppressor reagent (BSR) |
| Tumor stem cell (TSM) medium | – | – | growth cell medium (see reference in the text for details) |
| Ultra-Low Attachment Multiple Well Plate | Corning Costar | 7007 | size 96 well, round bottom clear |
Riferimenti
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
- Weigelt, B., Peterse, J. L., van’t Veer, L. J. Breast cancer metastasis: markers and models. Nature Reviews Cancer. 5 (8), 591-602 (2005).
- Magrì, A., Bardelli, A. Does early metastatic seeding occur in colorectal cancer. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 16 (11), 651-653 (2019).
- Cuddapah, V. A., Robel, S., Watkins, S., Sontheimer, H. A neurocentric perspective on glioma invasion. Nature Reviews Neuroscience. 15 (7), 455-465 (2014).
- Caretti, V., et al. Subventricular spread of diffuse intrinsic pontine glioma. Acta Neuropathologica. 128 (4), 605-607 (2014).
- Pericoli, G., et al. Integration of multiple platforms for the analysis of multifluorescent marking technology applied to pediatric GBM and DIPG. International Journal of Molecular Sciences. 21 (18), 6763 (2020).
- Vinci, M., et al. Functional diversity and cooperativity between subclonal populations of pediatric glioblastoma and diffuse intrinsic pontine glioma cells. Nature Medicine. 24 (8), 1204-1215 (2018).
- Shuen, W. H., Kan, R., Yu, Z., Lung, H. L., Lung, M. L. Novel lentiviral-inducible transgene expression systems and versatile single-plasmid reporters for in vitro and in vivo cancer biology studies. Cancer Gene Therapy. 22 (4), 207-214 (2015).
- Huang, C. C., et al. Autophagy-regulated ROS from xanthine oxidase acts as an early effector for triggering late mitochondria-dependent apoptosis in cathepsin s-targeted tumor cells. PLoS One. 10 (6), 0128045 (2015).
- Prudner, B. C., et al. Arginine starvation and docetaxel induce c-Myc-driven hENT1 surface expression to overcome gemcitabine resistance in ASS1-negative tumors. Clinical Cancer Research. 25 (16), 5122-5134 (2019).
- Ferretti, R., et al. Tumor cell invasion into Matrigel: optimized protocol for RNA extraction. Biotechniques. 70 (6), 327-335 (2021).
- Vinci, M., Box, C., Eccles, S. A. Three-dimensional (3D) tumor spheroid invasion assay. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (99), e52686 (2015).
- Chen, C., Zhao, S., Karnad, A., Freeman, J. W. The biology and role of CD44 in cancer progression: therapeutic implications. Journal of Hematology & Oncology. 11 (1), 64 (2018).
- Vinci, M., Box, C., Zimmermann, M., Eccles, S. A. Tumor spheroid-based migration assays for evaluation of therapeutic agents. Methods in Molecular Biology. 986, 253-266 (2013).
- Taylor, K. R., et al. Recurrent activating ACVR1 mutations in diffuse intrinsic pontine glioma. Nature Genetics. 46 (5), 457-461 (2014).
- Mount, C. W., et al. Potent antitumor efficacy of anti-GD2 CAR T cells in H3-K27M. Nature Medicine. 24 (5), 572-579 (2018).
- Louis, D. N., et al. The 2016 World Health Organization classification of tumors of the central nervous system: A summary. Acta Neuropathologica. 131 (6), 803-820 (2016).
- Czabanka, M., et al. Junctional adhesion molecule-C mediates the recruitment of embryonic-endothelial progenitor cells to the perivascular niche during tumor angiogenesis. International Journal of Molecular Sciences. 21 (4), 1209 (2020).
- Pardoll, D. M. The blockade of immune checkpoints in cancer immunotherapy. Nature Reviews Cancer. 12 (4), 252-264 (2012).
- Panková, K., Rösel, D., Novotný, M., Brábek, J. The molecular mechanisms of transition between mesenchymal and amoeboid invasiveness in tumor cells. Cellular and Molecular Life Sciences. 67 (1), 63-71 (2010).
- Cheung, K. J., Gabrielson, E., Werb, Z., Ewald, A. J. Collective invasion in breast cancer requires a conserved basal epithelial program. Cell. 155 (7), 1639-1651 (2013).
