Shotgun Proteomics Sample Processing geautomatiseerd door een open-source labrobot
Summary
Gedetailleerd protocol en drie Python-scripts zijn voorzien voor het bedienen van een open-source robotisch vloeistofverwerkingssysteem om semi-geautomatiseerde eiwitmonstervoorbereiding uit te voeren voor massaspectrometrie-experimenten, met betrekking tot wasmiddelverwijdering, eiwitvertering en peptide-ontzoutingsstappen.
Abstract
Op massaspectrometrie gebaseerde shotgun proteomics-experimenten vereisen meerdere monstervoorbereidingsstappen, waaronder enzymatische eiwitvertering en -opruiming, die aanzienlijke persoonsuren bankarbeid kunnen kosten en een bron van batch-to-batch variabiliteit kunnen vormen. Laboratoriumautomatisering met pipetteerrobots kan handmatig werk verminderen, de doorvoer maximaliseren en de reproduceerbaarheid van onderzoek vergroten. Toch maken de hoge startprijzen van standaard automatiseringsstations ze onbetaalbaar voor veel academische laboratoria. Dit artikel beschrijft een proteomics monstervoorbereidingsworkflow met behulp van een betaalbaar, open-source automatiseringssysteem (The Opentrons OT-2), inclusief instructies voor het instellen van semi-geautomatiseerde eiwitreductie, alkylering, spijsvertering en opruimstappen; evenals bijbehorende open-source Python-scripts om het OT-2-systeem te programmeren via de application programming interface.
Introduction
Op massaspectrometrie gebaseerde shotgun proteomics is een krachtig hulpmiddel om de overvloed aan vele eiwitten in biologische monsters tegelijkertijd te meten. Proteomics-experimenten met bioinformatica-analyse worden routinematig gebruikt om biomarkers te identificeren en geassocieerde biologische complexen en paden te ontdekken die ten grondslag liggen aan pathologische mechanismen. Met zijn hoge analytspecificiteit en potentiële kwantitatieve nauwkeurigheid heeft shotgun proteomics ook een uitstekend potentieel om te worden overgenomen door onderzoeksfaciliteiten en diagnostische laboratoria voor klinische monsteranalyse zonder de noodzaak om te vertrouwen op antilichamen1,2.
Om eiwitmonsters voor te bereiden voor shotgun proteomics-analyse, moeten eiwitten geëxtraheerd uit biologische monsters (bijv. Cellen en weefsels) meestal eerst worden verwerkt met behulp van lange protocollen, waaronder het meten van de eiwitconcentratie van het monster, eiwitreductie en alkylering, en enzymatische spijsvertering tot peptiden. Bovendien vereisen eiwitten die worden geëxtraheerd in gewone lysisbuffers die detergentia bevatten, vaak extra stappen van bufferuitwisseling of verwijdering van detergentia vóór de analyse, omdat detergent de trypsinevertering kan verstoren en de prestaties van downstream vloeistofchromatografie-tandem massaspectrometrie (LC-MS / MS) -analyse aanzienlijk kan verslechteren3. Peptiden worden meestal verder ontzout, gedroogd en gereconstitueerd in LC-MS / MS-compatibele oplosmiddelen na enzymatische spijsvertering. Deze eiwitbiochemische procedures kunnen arbeidsintensief en tijdrovend zijn. Zo blijven ze de doorvoer van proteomics-workflows beperken en dragen ze bij aan de variabiliteit van de verkregen gegevens4,5. Menselijke fouten en vooroordelen zijn erkend als cruciale factoren die van invloed zijn op de variantie en reproduceerbaarheid van gegevens6,7. Om menselijke fouten in de monstervoorbereidingsworkflows voor massaspectrometrie tot een minimum te beperken, zijn geautomatiseerde pipetteerrobotsystemen gebruikt om de doorvoer en reproduceerbaarheid van eiwitidentificatie en kwantificering van shotgun-proteomics en gerichte massaspectrometrie-analyse te verbeteren, waar dergelijke vooruitgang is geprezen als instrumenteel voor het voortzetten van de drang naar wijdverspreide acceptatie van proteomics-technologieën in kritisch onderzoek en klinische omgevingen8, 9,10,11,12,13. De meeste bestaande protocollen maken echter gebruik van robotachtige vloeistofbehandelingsplatforms die aanzienlijke investeringen en training vereisen, waardoor hun nut in veel laboratoria in de academische omgeving of anderszins met een beperkt budget wordt beperkt.
Dit artikel beschrijft een protocol dat gebruik maakt van een goedkoop, open-source robotisch vloeistofverwerkingssysteem, de OT-2, om een typische shotgun proteomics monstervoorbereidingsworkflow semi-automatiseren. De OT-2 heeft lagere kosten dan veel andere robotachtige vloeistofbehandelingssystemen en kost op het moment van schrijven ongeveer $ 5.000 Amerikaanse dollars. Wanneer rekening wordt gehouden met de prijzen van verschillende modules en labware, zijn de totale kosten voor het opzetten van experimenten in dit protocol op het moment van schrijven ongeveer $ 10.000, waardoor het betaalbaarder is voor een aanzienlijk bredere set laboratoria dan duurdere opties. De OT-2 is compatibel met open-source programmeren via Python-scripts en biedt grote flexibiliteit in door de gebruiker gedefinieerd DIY-protocolontwerp. Met behulp van drie in eigen huis ontwikkelde scripts, dekken de onderstaande protocollen het uitvoeren van een typische shotgun proteomics monstervoorbereidingsworkflow op het OT-2-station met een archetypische eiwitstandaard (runderserumalbumine; BSA) en een complex eiwitmonster van een normaal menselijk hartlysaat (figuur 1). De procedures voor de verwerking van (1) een BSA-monster en (2) een complex cardiaal lysaatmonster worden beschreven in respectievelijk protocolsecties 1, 2, 5, 6 en 3, 4, 5, 6. Sera-Mag carboxylaat-gemodificeerde magnetische kralen worden gebruikt in eenpotige vaste-fase-verbeterde monstervoorbereiding (SP3) om detergenten en zouten in de eiwit- en peptidemonsters te verwijderen. Tryptische digesten van runderserumalbumine en menselijke harteiwitten worden verder gereinigd door SP3-kralen en ingediend voor LC-MS /MS-analyse. Massaspectra worden vervolgens geanalyseerd met behulp van de MaxQuant-software voor peptide- en eiwitidentificatie. Representatieve resultaten die door ons worden uitgevoerd, tonen aan dat het protocol uitstekende technische variatiecoëfficiënten (CV) bereikt, terwijl het banktijd bespaart en niet inferieur is aan de handvertering.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kritieke stappen binnen het protocol
Voor de beste prestaties moeten Opentrons-geverifieerde labware, modules en verbruiksartikelen worden gebruikt die compatibel zijn met OT-2. Aangepaste labware kan worden gemaakt volgens de instructies van Opentrons op Reference14. Zorg ervoor dat u het OT-2-dek, de pipetten en de labware kalibreert wanneer u het voor de eerste keer gebruikt. Het is ook van cruciaal belang om de richtlijnen van de fabrikant van SP3-kralen te volgen om kralen…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door NIH-awards F32-HL149191 aan YH; R00-HL144829 naar EL; R21-HL150456, R00-HL127302, R01-HL141278 naar MPL. Figuur 1, Figuur 2, Figuur 3 zijn gemaakt met behulp van een webgebaseerde wetenschappelijke illustratietool, BioRender.com.
Materials
| 300 µL pipette tips | Opentrons | ||
| 4-in-1 tube rack set | Opentrons | Each set includes 2 base stands and 4 tube holder tops 1.5mL, 2mL, 15mL + 50mL, 15mL, and 50mL. We use 2mL and 15 mL + 50 mL tops in this study. | |
| Acclaim PepMap 100 C18 HPLC Column | Thermo Scientific | #164568 | 3 μm particle; 100 Å pore; 75 μm x 150 mm |
| Acetonitrile LC-MS grade | VWR | #JT9829 | |
| Aluminum block set | Opentrons | This block set includes 3 tops that are compatible with 96-well, 2.0 mL tubes and a PCR strip to use with the OT-2 temperature module. We use the 2.0mL tube holder in this manuscript. | |
| Ammonium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | # A6141 | |
| Bovine Serum Albumin Standard, 2 mg/mL | Thermo Scientific | #23210 | |
| Dimethylsulfoxide (DMSO) LC-MS grade | Thermo Scientific | #85190 | |
| Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | #D5545 | |
| EASY-Spray HPLC Columns | Thermo Scientific | #ES800A | |
| EasynLC 1200 Nano LC | Thermo Scientific | #LC140 | |
| Ethanol Proof 195-200 | Fisher | #04-355-720 | |
| Formic Acid LC-MS grade | Thermo Scientific | #85178 | |
| Human heart lysate | Novus Biologicals | NB820-59217 | |
| Iodoacetamide | Sigma-Aldrich | #I1149 | |
| Magnetic tube rack | Thermo Scientific | #MR02 | |
| MAXQuant v.1.6.10.43 | Tyanova et al., 2016 (https://www.maxquant.org/) | ||
| mySPIN 6 Mini Centrifuge | Thermo Scientific | #75004061 | benchtop mini centrifuge for quick spin |
| NEST 2 mL 96-Well Deep Well Plate, V Bottom | Opentrons | ||
| OT-2 magnetic module | Opentrons | GEN1 | |
| OT-2 P300 single channel pipette | Opentrons | GEN1 | |
| OT-2 P50 single channel pipette | Opentrons | GEN1 | |
| OT-2 robot pipetting robot | Opentrons | OT-2 | |
| OT-2 temperature module | Opentrons | GEN1 | |
| Pierce Quantitative Colorimetric Peptide Assay | Thermo Scientific | #23275 | |
| Protein LoBind tubes 2.0 mL | Eppendorf | #022431102 | |
| Protein Sequence Database | UniProt/SwissProt | https://www.uniprot.org/uniprot/?query=proteome:UP000005640% 20reviewed:yes |
|
| Sera-Mag SpeedBead Carboxylate-Modified Magnetic Particles, Hydrophobic | Cytiva | #65152105050250 | |
| Sera-Mag SpeedBead Carboxylate-Modified Magnetic Particles, Hydrophylic | Cytiva | #45152105050250 | |
| SpeedVac | Thermo Scientific | Vacuum evaporator | |
| Thermo Q Exactive HF Mass Spectrometer | Thermo Scientific | #IQLAAEGAAPFALGMBFZ | |
| Trypsin MS Grade | Thermo Scientific | #90057 | |
| Water LC-MS grade | VWR | #BDH83645.400 |
Riferimenti
- Geyer, P. E., et al. Revisiting biomarker discovery by plasma proteomics. Molecular Systems Biology. 13 (9), 942 (2017).
- Coscia, F., et al. A streamlined mass spectrometry-based proteomics workflow for large-scale FFPE tissue analysis. The Journal of Pathology. 251 (1), 100-112 (2020).
- Yeung, Y. -. G., Neives, E., Angeletti, R., Stanley, E. R., et al. Removal of detergents from protein digests for mass spectrometry analysis. Analytical Biochemistry. 382 (2), 135-137 (2008).
- Addona, T. A., et al. Multi-site assessment of the precision and reproducibility of multiple reaction monitoring-based measurements of proteins in plasma. Nature Biotechnology. 27 (7), 633-641 (2009).
- Lowenthal, M. S., Liang, Y., Phinney, K. W., Stein, S. E. Quantitative bottom-up proteomics depends on digestion conditions. Analytical Chemistry. 86 (1), 551-558 (2014).
- Elliott, K. C., Resnik, D. B. Scientific reproducibility, human error, and public policy. Bioscience. 65 (1), 5-6 (2015).
- Brown, A. W., Kaiser, K. A., Allison, D. B. Issues with data and analyses: Errors, underlying themes, and potential solutions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (11), 2563-2570 (2018).
- van den Broek, I., et al. Automated multiplex LC-MS/MS assay for quantifying serum apolipoproteins A-I, B, C-I, C-II, C-III, and E with qualitative apolipoprotein E phenotypic. Clinical Chemistry. 62 (1), 188-197 (2016).
- Müller, T., et al. Automated sample preparation with SP3 for low-input clinical proteomics. Molecular Systems Biology. 16 (1), 9111 (2020).
- Fu, Q., et al. Highly reproducible automated proteomics sample preparation workflow for quantitative mass spectrometry. Journal of Proteome Research. 17 (1), 420-428 (2018).
- Liu, X., Gygi, S. P., Paulo, J. A. A semiautomated paramagnetic bead-based platform for isobaric tag sample preparation. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 32 (6), 1519-1529 (2021).
- Poulsen, K. M., Pho, T., Champion, J. A., Payne, C. K. Automation and low-cost proteomics for characterization of the protein corona: experimental methods for big data. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 412 (24), 6543-6551 (2020).
- Liang, Y., et al. Fully automated sample processing and analysis workflow for low-input proteome profiling. Analytical Chemistry. 93 (3), 1658-1666 (2021).
- . Web URL Available from: https://opentrons.com/ot-app/ (2021)
- . Web URL Available from: https://docs.opentrons.com/v2/ (2021)
- . Web URL Available from: https://www.cytivalifesciences.com/en/us/solutions/genomics/knowledge-center/cleanup-for-mass-spectrometry (2021)
- . Web URL Available from: https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/23275#/23275 (2021)
- Han, Y., Wright, J. M., Lau, E., Lam, M. P. Y. Determining alternative protein isoform expression using RNA sequencing and mass spectrometry. STAR Protocols. 1 (3), 100138 (2020).
