Traitement des échantillons protéomiques Shotgun automatisé par un robot de laboratoire open source
Summary
Un protocole détaillé et trois scripts Python sont fournis pour l’exploitation d’un système de manipulation robotique de liquides open source permettant d’effectuer une préparation semi-automatisée d’échantillons de protéines pour des expériences de spectrométrie de masse, couvrant l’élimination des détergents, la digestion des protéines et les étapes de dessalement des peptides.
Abstract
Les expériences de protéomique au fusil de chasse basées sur la spectrométrie de masse nécessitent plusieurs étapes de préparation des échantillons, y compris la digestion et le nettoyage des protéines enzymatiques, ce qui peut prendre des heures importantes de travail de laboratoire et présenter une source de variabilité de lot à lot. L’automatisation des laboratoires avec des robots de pipetage peut réduire le travail manuel, maximiser le débit et augmenter la reproductibilité de la recherche. Pourtant, les prix de départ élevés des stations d’automatisation standard les rendent inabordables pour de nombreux laboratoires universitaires. Cet article décrit un flux de travail de préparation d’échantillons protéomiques à l’aide d’un système d’automatisation open source abordable (The Opentrons OT-2), y compris des instructions pour mettre en place des étapes semi-automatisées de réduction des protéines, d’alkylation, de digestion et de nettoyage; ainsi que des scripts Python open source pour programmer le système OT-2 via son interface de programmation d’applications.
Introduction
La protéomique au fusil de chasse basée sur la spectrométrie de masse est un outil puissant pour mesurer simultanément l’abondance de nombreuses protéines dans des échantillons biologiques. Les expériences protéomiques avec l’analyse bioinformatique sont couramment utilisées pour identifier les biomarqueurs et découvrir les complexes biologiques associés et les voies qui sous-tendent les mécanismes pathologiques. Avec sa grande spécificité d’analyte et sa précision quantitative potentielle, la protéomique des fusils de chasse a également un excellent potentiel pour être adoptée par les installations de recherche et les laboratoires de diagnostic pour l’analyse d’échantillons cliniques sans avoir besoin de s’appuyer sur des anticorps1,2.
Pour préparer des échantillons de protéines pour l’analyse protéomique au fusil de chasse, les protéines extraites d’échantillons biologiques (par exemple, les cellules et les tissus) doivent généralement d’abord être traitées à l’aide de longs protocoles, y compris la mesure de la concentration en protéines de l’échantillon, la réduction des protéines et l’alkylation, et la digestion enzymatique en peptides. De plus, les protéines extraites dans des tampons de lyse courants contenant des détergents nécessitent souvent des étapes supplémentaires d’échange de tampon ou d’élimination du détergent avant l’analyse, car le détergent peut interférer avec la digestion de la trypsine et dégrader considérablement les performances de l’analyse en aval par chromatographie liquide-spectrométrie de masse en tandem (LC-MS/MS)3. Les peptides sont généralement dessalés, séchés et reconstitués dans des solvants compatibles LC-MS/MS après digestion enzymatique. Ces procédures de biochimie des protéines peuvent être laborieuses et prendre beaucoup de temps. Ainsi, ils continuent de limiter le débit des flux de travail protéomiques et contribuent à la variabilité des données acquises4,5. Les erreurs et les biais humains ont été reconnus comme des facteurs cruciaux affectant la variance et la reproductibilité des données6,7. Pour minimiser les erreurs humaines dans les flux de travail de préparation des échantillons par spectrométrie de masse, des systèmes robotiques de pipetage automatisés ont été utilisés pour améliorer le débit et la reproductibilité de l’identification et de la quantification des protéines à partir de la protéomique au fusil de chasse et de l’analyse ciblée par spectrométrie de masse, où de telles avancées ont été saluées comme essentielles pour poursuivre la poussée en faveur de l’adoption généralisée des technologies protéomiques dans les domaines critiques de la recherche et des milieux cliniques8, 9,10,11,12,13. Cependant, la plupart des protocoles existants utilisent des plates-formes robotiques de manipulation de liquides qui nécessitent des investissements et une formation substantiels, ce qui limite leur utilité dans de nombreux laboratoires dans l’environnement universitaire ou autrement avec un budget limité.
Cet article décrit un protocole qui utilise un système de manipulation robotique de liquides à faible coût et open source, l’OT-2, pour semi-automatiser un flux de travail typique de préparation d’échantillons protéomiques de fusil de chasse. L’OT-2 a un coût inférieur à celui de nombreux autres systèmes robotiques de manipulation de liquides et, au moment de la rédaction de cet article, coûte environ 5 000 dollars américains. Si l’on tient compte des prix des différents modules et logiciels de laboratoire, le coût total de la mise en place d’expériences dans ce protocole au moment de la rédaction est d’environ 10 000 $, ce qui le rend plus abordable pour un ensemble considérablement plus large de laboratoires par rapport à des options plus coûteuses. L’OT-2 est compatible avec la programmation open-source via des scripts Python et offre une grande flexibilité dans la conception de protocoles DIY définis par l’utilisateur. À l’aide de trois scripts développés en interne, les protocoles ci-dessous couvrent l’exécution d’un flux de travail typique de préparation d’échantillons protéomiques de fusil de chasse sur la station OT-2 avec un étalon protéique archétypique (albumine sérique bovine; BSA) et un échantillon de protéine complexe d’un lysat cardiaque humain normal (Figure 1). Les procédures de traitement (1) d’un échantillon de BSA et (2) d’un échantillon de lysat cardiaque complexe sont détaillées dans les sections 1, 2, 5, 6 et 3, 4, 5, 6 du Protocole, respectivement. Les billes magnétiques modifiées par le carboxylate sera-Mag sont utilisées dans la préparation d’échantillons améliorés en phase solide (SP3) pour éliminer les détergents et les sels dans les échantillons de protéines et de peptides. Les digestions tryptiques de l’albumine sérique bovine et des protéines cardiaques humaines sont ensuite nettoyées par des billes SP3 et soumises à l’analyse LC-MS/MS. Les spectres de masse sont ensuite analysés à l’aide du logiciel MaxQuant pour l’identification des peptides et des protéines. Les résultats représentatifs que nous avons réalisés montrent que le protocole atteint d’excellents coefficients techniques de variation (CV) tout en économisant du temps de banc et n’est pas inférieur à la digestion à la main.
Protocol
Representative Results
Discussion
Étapes critiques du protocole
Pour de meilleures performances, des logiciels de laboratoire, des modules et des consommables compatibles avec OT-2 vérifiés par Opentrons doivent être utilisés. Des logiciels de laboratoire personnalisés peuvent être créés en suivant les instructions d’Opentrons à la référence 14. Assurez-vous de calibrer le pont OT-2, les pipettes et le matériel de laboratoire lorsqu’ils sont utilisés pour la première fois. Il est également e…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu en partie par les prix F32-HL149191 des NIH; R00-HL144829 à EL; R21-HL150456, R00-HL127302, R01-HL141278 à MPL. La figure 1, la figure 2 et la figure 3 sont créées à l’aide d’un outil d’illustration scientifique basé sur le Web, BioRender.com.
Materials
| 300 µL pipette tips | Opentrons | ||
| 4-in-1 tube rack set | Opentrons | Each set includes 2 base stands and 4 tube holder tops 1.5mL, 2mL, 15mL + 50mL, 15mL, and 50mL. We use 2mL and 15 mL + 50 mL tops in this study. | |
| Acclaim PepMap 100 C18 HPLC Column | Thermo Scientific | #164568 | 3 μm particle; 100 Å pore; 75 μm x 150 mm |
| Acetonitrile LC-MS grade | VWR | #JT9829 | |
| Aluminum block set | Opentrons | This block set includes 3 tops that are compatible with 96-well, 2.0 mL tubes and a PCR strip to use with the OT-2 temperature module. We use the 2.0mL tube holder in this manuscript. | |
| Ammonium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | # A6141 | |
| Bovine Serum Albumin Standard, 2 mg/mL | Thermo Scientific | #23210 | |
| Dimethylsulfoxide (DMSO) LC-MS grade | Thermo Scientific | #85190 | |
| Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | #D5545 | |
| EASY-Spray HPLC Columns | Thermo Scientific | #ES800A | |
| EasynLC 1200 Nano LC | Thermo Scientific | #LC140 | |
| Ethanol Proof 195-200 | Fisher | #04-355-720 | |
| Formic Acid LC-MS grade | Thermo Scientific | #85178 | |
| Human heart lysate | Novus Biologicals | NB820-59217 | |
| Iodoacetamide | Sigma-Aldrich | #I1149 | |
| Magnetic tube rack | Thermo Scientific | #MR02 | |
| MAXQuant v.1.6.10.43 | Tyanova et al., 2016 (https://www.maxquant.org/) | ||
| mySPIN 6 Mini Centrifuge | Thermo Scientific | #75004061 | benchtop mini centrifuge for quick spin |
| NEST 2 mL 96-Well Deep Well Plate, V Bottom | Opentrons | ||
| OT-2 magnetic module | Opentrons | GEN1 | |
| OT-2 P300 single channel pipette | Opentrons | GEN1 | |
| OT-2 P50 single channel pipette | Opentrons | GEN1 | |
| OT-2 robot pipetting robot | Opentrons | OT-2 | |
| OT-2 temperature module | Opentrons | GEN1 | |
| Pierce Quantitative Colorimetric Peptide Assay | Thermo Scientific | #23275 | |
| Protein LoBind tubes 2.0 mL | Eppendorf | #022431102 | |
| Protein Sequence Database | UniProt/SwissProt | https://www.uniprot.org/uniprot/?query=proteome:UP000005640% 20reviewed:yes |
|
| Sera-Mag SpeedBead Carboxylate-Modified Magnetic Particles, Hydrophobic | Cytiva | #65152105050250 | |
| Sera-Mag SpeedBead Carboxylate-Modified Magnetic Particles, Hydrophylic | Cytiva | #45152105050250 | |
| SpeedVac | Thermo Scientific | Vacuum evaporator | |
| Thermo Q Exactive HF Mass Spectrometer | Thermo Scientific | #IQLAAEGAAPFALGMBFZ | |
| Trypsin MS Grade | Thermo Scientific | #90057 | |
| Water LC-MS grade | VWR | #BDH83645.400 |
Riferimenti
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- . Web URL Available from: https://opentrons.com/ot-app/ (2021)
- . Web URL Available from: https://docs.opentrons.com/v2/ (2021)
- . Web URL Available from: https://www.cytivalifesciences.com/en/us/solutions/genomics/knowledge-center/cleanup-for-mass-spectrometry (2021)
- . Web URL Available from: https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/23275#/23275 (2021)
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