Shotgun Proteomics Probenverarbeitung automatisiert durch einen Open-Source-Laborroboter
Summary
Detailliertes Protokoll und drei Python-Skripte werden für den Betrieb eines Open-Source-Roboter-Liquid-Handling-Systems bereitgestellt, um eine halbautomatische Proteinprobenvorbereitung für Massenspektrometrie-Experimente durchzuführen, die die Entfernung von Reinigungsmitteln, die Proteinverdauung und die Peptidentsalzungsschritte abdecken.
Abstract
Massenspektrometrie-basierte Shotgun-Proteomik-Experimente erfordern mehrere Probenvorbereitungsschritte, einschließlich enzymatischer Proteinverdauung und -reinigung, die erhebliche Arbeitsstunden am Labor in Anspruch nehmen und eine Quelle der Variabilität von Charge zu Charge darstellen können. Die Laborautomatisierung mit Pipettierrobotern kann die manuelle Arbeit reduzieren, den Durchsatz maximieren und die Reproduzierbarkeit der Forschung erhöhen. Dennoch machen die hohen Startpreise von Standard-Automatisierungsstationen sie für viele akademische Labore unerschwinglich. Dieser Artikel beschreibt einen Proteomik-Probenvorbereitungs-Workflow unter Verwendung eines erschwinglichen Open-Source-Automatisierungssystems (The Opentrons OT-2), einschließlich Anweisungen zum Einrichten von halbautomatischen Proteinreduktions-, Alkylierungs-, Verdauungs- und Reinigungsschritten; sowie begleitende Open-Source-Python-Skripte zur Programmierung des OT-2-Systems über seine Anwendungsprogrammierschnittstelle.
Introduction
Die auf Massenspektrometrie basierende Shotgun-Proteomik ist ein leistungsfähiges Werkzeug, um die Häufigkeit vieler Proteine in biologischen Proben gleichzeitig zu messen. Proteomik-Experimente mit bioinformatischer Analyse werden routinemäßig eingesetzt, um Biomarker zu identifizieren und assoziierte biologische Komplexe und Signalwege zu entdecken, die pathologischen Mechanismen zugrunde liegen. Mit ihrer hohen Analytspezifität und potenziellen quantitativen Genauigkeit hat die Shotgun-Proteomik auch ein hervorragendes Potenzial, von Forschungseinrichtungen und diagnostischen Labors für die klinische Probenanalyse übernommen zu werden, ohne sich auf Antikörper verlassen zu müssen1,2.
Um Proteinproben für die Shotgun-Proteomik-Analyse vorzubereiten, müssen Proteine, die aus biologischen Proben (z. B. Zellen und Geweben) extrahiert werden, typischerweise zuerst unter Verwendung langwieriger Protokolle verarbeitet werden, einschließlich der Messung der Probenproteinkonzentration, der Proteinreduktion und -alkylierung sowie des enzymatischen Aufschlusses in Peptide. Darüber hinaus erfordern Proteine, die in herkömmlichen Lysepuffern extrahiert werden, die Detergenzien enthalten, vor der Analyse häufig zusätzliche Schritte des Pufferaustauschs oder der Reinigungsmittelentfernung, da Detergenzien die Trypsinaufschluss stören und die Leistung der nachgeschalteten Flüssigkeitschromatographie-Tandem-Massenspektrometrie (LC-MS/MS) -Analyse erheblich beeinträchtigen können3. Peptide werden typischerweise nach enzymatischem Aufschluss weiter entsalzt, getrocknet und in LC-MS/MS-kompatiblen Lösungsmitteln rekonstituiert. Diese proteinbiochemischen Verfahren können arbeitsintensiv und zeitaufwendig sein. Somit begrenzen sie weiterhin den Durchsatz von Proteomik-Workflows und tragen zur Variabilität der erfassten Daten bei4,5. Menschliche Fehler und Verzerrungen wurden als entscheidende Faktoren erkannt, die die Datenvarianz und Reproduzierbarkeit beeinflussen6,7. Um menschliche Fehler bei der Massenspektrometrie-Probenvorbereitung zu minimieren, wurden automatisierte Pipettierrobotersysteme eingesetzt, um den Durchsatz und die Reproduzierbarkeit der Proteinidentifizierung und -quantifizierung aus der Schrotflintenproteomik und der gezielten Massenspektrometrieanalyse zu verbessern, wo solche Fortschritte als entscheidend für die Fortsetzung des Vorstoßes für eine weit verbreitete Einführung von Proteomik-Technologien in kritischen Forschungs- und klinischen Umgebungen gefeiert wurden8. 9,10,11,12,13. Die meisten bestehenden Protokolle verwenden jedoch robotergestützte Liquid-Handling-Plattformen, die erhebliche Investitionen und Schulungen erfordern, was ihren Nutzen in vielen Labors im akademischen Umfeld oder anderweitig mit einem begrenzten Budget einschränkt.
Dieser Artikel beschreibt ein Protokoll, das ein kostengünstiges Open-Source-Roboter-Liquid-Handling-System, das OT-2, verwendet, um einen typischen Shotgun-Proteomik-Probenvorbereitungs-Workflow zu halbautomatisieren. Das OT-2 hat niedrigere Kosten als viele andere Roboter-Liquid-Handling-Systeme und kostet zum Zeitpunkt des Schreibens etwa 5.000 US-Dollar. Wenn man die Preise verschiedener Module und Laborgeräte berücksichtigt, betragen die Gesamtkosten für die Einrichtung von Experimenten in diesem Protokoll zum Zeitpunkt des Schreibens etwa 10.000 US-Dollar, was es für eine wesentlich breitere Gruppe von Labors erschwinglicher macht als teurere Optionen. Der OT-2 ist kompatibel mit Open-Source-Programmierung durch Python-Skripte und bietet große Flexibilitäten im benutzerdefinierten DIY-Protokolldesign. Unter Verwendung von drei intern entwickelten Skripten decken die folgenden Protokolle die Ausführung eines typischen Shotgun-Proteomik-Probenvorbereitungs-Workflows auf der OT-2-Station mit einem archetypischen Proteinstandard (Rinderserumalbumin; BSA) und eine komplexe Proteinprobe eines normalen menschlichen Herzlysat (Abbildung 1). Die Verfahren zur Verarbeitung (1) einer BSA-Probe und (2) einer komplexen Herzlysatprobe sind in den Protokollabschnitten 1, 2, 5, 6 und 3, 4, 5, 6 beschrieben. Sera-Mag-Carboxylat-modifizierte Magnetperlen werden in der Eintopf-Festphasen-verstärkten Probenvorbereitung (SP3) verwendet, um Reinigungsmittel und Salze in den Protein- und Peptidproben zu entfernen. Tryptische Digests aus Rinderserumalbumin und menschlichen Herzproteinen werden durch SP3-Kügelchen weiter gereinigt und zur LC-MS/MS-Analyse eingereicht. Massenspektren werden dann mit der MaxQuant-Software zur Peptid- und Proteinidentifizierung analysiert. Repräsentative Ergebnisse, die von uns durchgeführt wurden, zeigen, dass das Protokoll hervorragende technische Variationskoeffizienten (CV) erreicht, gleichzeitig Bankzeit spart und der Handverdauung nicht unterlegen ist.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kritische Schritte innerhalb des Protokolls
Für die beste Leistung sollten von Opentrons verifizierte Laborgeräte, Module und Verbrauchsmaterialien verwendet werden, die mit OT-2 kompatibel sind. Benutzerdefinierte Labware kann nach den Anweisungen von Opentrons unter Reference14 erstellt werden. Stellen Sie sicher, dass Sie das OT-2-Deck, die Pipetten und das Labormaterial kalibrieren, wenn Sie es zum ersten Mal verwenden. Es ist auch wichtig, die Richtlinien des Herstellers…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde zum Teil durch die NIH-Auszeichnungen F32-HL149191 an YH unterstützt; R00-HL144829 bis EL; R21-HL150456, R00-HL127302, R01-HL141278 zu MPL. Abbildung 1, Abbildung 2, Abbildung 3 werden mit Hilfe eines webbasierten Wissenschaftsillustrationstools erstellt, BioRender.com.
Materials
| 300 µL pipette tips | Opentrons | ||
| 4-in-1 tube rack set | Opentrons | Each set includes 2 base stands and 4 tube holder tops 1.5mL, 2mL, 15mL + 50mL, 15mL, and 50mL. We use 2mL and 15 mL + 50 mL tops in this study. | |
| Acclaim PepMap 100 C18 HPLC Column | Thermo Scientific | #164568 | 3 μm particle; 100 Å pore; 75 μm x 150 mm |
| Acetonitrile LC-MS grade | VWR | #JT9829 | |
| Aluminum block set | Opentrons | This block set includes 3 tops that are compatible with 96-well, 2.0 mL tubes and a PCR strip to use with the OT-2 temperature module. We use the 2.0mL tube holder in this manuscript. | |
| Ammonium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | # A6141 | |
| Bovine Serum Albumin Standard, 2 mg/mL | Thermo Scientific | #23210 | |
| Dimethylsulfoxide (DMSO) LC-MS grade | Thermo Scientific | #85190 | |
| Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | #D5545 | |
| EASY-Spray HPLC Columns | Thermo Scientific | #ES800A | |
| EasynLC 1200 Nano LC | Thermo Scientific | #LC140 | |
| Ethanol Proof 195-200 | Fisher | #04-355-720 | |
| Formic Acid LC-MS grade | Thermo Scientific | #85178 | |
| Human heart lysate | Novus Biologicals | NB820-59217 | |
| Iodoacetamide | Sigma-Aldrich | #I1149 | |
| Magnetic tube rack | Thermo Scientific | #MR02 | |
| MAXQuant v.1.6.10.43 | Tyanova et al., 2016 (https://www.maxquant.org/) | ||
| mySPIN 6 Mini Centrifuge | Thermo Scientific | #75004061 | benchtop mini centrifuge for quick spin |
| NEST 2 mL 96-Well Deep Well Plate, V Bottom | Opentrons | ||
| OT-2 magnetic module | Opentrons | GEN1 | |
| OT-2 P300 single channel pipette | Opentrons | GEN1 | |
| OT-2 P50 single channel pipette | Opentrons | GEN1 | |
| OT-2 robot pipetting robot | Opentrons | OT-2 | |
| OT-2 temperature module | Opentrons | GEN1 | |
| Pierce Quantitative Colorimetric Peptide Assay | Thermo Scientific | #23275 | |
| Protein LoBind tubes 2.0 mL | Eppendorf | #022431102 | |
| Protein Sequence Database | UniProt/SwissProt | https://www.uniprot.org/uniprot/?query=proteome:UP000005640% 20reviewed:yes |
|
| Sera-Mag SpeedBead Carboxylate-Modified Magnetic Particles, Hydrophobic | Cytiva | #65152105050250 | |
| Sera-Mag SpeedBead Carboxylate-Modified Magnetic Particles, Hydrophylic | Cytiva | #45152105050250 | |
| SpeedVac | Thermo Scientific | Vacuum evaporator | |
| Thermo Q Exactive HF Mass Spectrometer | Thermo Scientific | #IQLAAEGAAPFALGMBFZ | |
| Trypsin MS Grade | Thermo Scientific | #90057 | |
| Water LC-MS grade | VWR | #BDH83645.400 |
Riferimenti
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