शॉटगन प्रोटिओमिक्स नमूना प्रसंस्करण एक ओपन-सोर्स लैब रोबोट द्वारा स्वचालित
Summary
मास स्पेक्ट्रोमेट्री प्रयोगों के लिए अर्ध-स्वचालित प्रोटीन नमूना तैयारी करने के लिए एक ओपन-सोर्स रोबोटिक लिक्विड हैंडलिंग सिस्टम के संचालन के लिए विस्तृत प्रोटोकॉल और तीन पायथन स्क्रिप्ट प्रदान किए जाते हैं, जिसमें डिटर्जेंट हटाने, प्रोटीन पाचन और पेप्टाइड डिसाल्टिंग चरणों को कवर किया जाता है।
Abstract
मास स्पेक्ट्रोमेट्री-आधारित शॉटगन प्रोटिओमिक्स प्रयोगों के लिए एंजाइमेटिक प्रोटीन पाचन और क्लीन-अप सहित कई नमूना तैयारी चरणों की आवश्यकता होती है, जो महत्वपूर्ण व्यक्ति-घंटे के बेंच श्रम को ले सकते हैं और बैच-टू-बैच परिवर्तनशीलता का स्रोत प्रस्तुत कर सकते हैं। pipetting रोबोट के साथ प्रयोगशाला स्वचालन मैनुअल काम को कम कर सकते हैं, थ्रूपुट को अधिकतम, और अनुसंधान reproducibility में वृद्धि. फिर भी, मानक स्वचालन स्टेशनों की खड़ी शुरुआती कीमतें उन्हें कई अकादमिक प्रयोगशालाओं के लिए अफोर्डेबल बनाती हैं। यह आलेख वर्णन करता है कि एक प्रोटिओमिक्स नमूना तैयारी वर्कफ़्लो एक सस्ती, ओपन-सोर्स स्वचालन प्रणाली (Opentrons OT-2) का उपयोग करके, जिसमें अर्ध-स्वचालित प्रोटीन कमी, अल्काइलेशन, पाचन और क्लीन-अप चरणों को सेट करने के लिए निर्देश शामिल हैं; साथ ही साथ अपने एप्लिकेशन प्रोग्रामिंग इंटरफ़ेस के माध्यम से ओटी -2 सिस्टम को प्रोग्राम करने के लिए ओपन-सोर्स पायथन स्क्रिप्ट के साथ।
Introduction
मास स्पेक्ट्रोमेट्री-आधारित शॉटगन प्रोटिओमिक्स एक साथ जैविक नमूनों में कई प्रोटीनों की बहुतायत को मापने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है। जैव सूचना विज्ञान विश्लेषण के साथ प्रोटिओमिक्स प्रयोगों को नियमित रूप से बायोमार्कर की पहचान करने और संबंधित जैविक परिसरों और पैथोलॉजिकल तंत्रों को रेखांकित करने वाले मार्गों की खोज करने के लिए नियोजित किया जाता है। अपनी उच्च विश्लेषक विशिष्टता और संभावित मात्रात्मक सटीकता के साथ, शॉटगन प्रोटिओमिक्स में एंटीबॉडी 1,2 पर भरोसा करने की आवश्यकता के बिना नैदानिक नमूना विश्लेषण के लिए अनुसंधान सुविधाओं और नैदानिक प्रयोगशालाओं द्वारा अपनाए जाने की उत्कृष्ट क्षमता भी है।
शॉटगन प्रोटिओमिक्स विश्लेषण के लिए प्रोटीन के नमूने तैयार करने के लिए, जैविक नमूनों (जैसे, कोशिकाओं और ऊतकों) से निकाले गए प्रोटीन को आमतौर पर पहले लंबे प्रोटोकॉल का उपयोग करके संसाधित करने की आवश्यकता होती है, जिसमें नमूना प्रोटीन एकाग्रता, प्रोटीन में कमी और अल्काइलेशन, और पेप्टाइड्स में एंजाइमेटिक पाचन को मापना शामिल है। इसके अलावा, डिटर्जेंट युक्त सामान्य लाइसिस बफर में निकाले गए प्रोटीन को अक्सर विश्लेषण से पहले बफर एक्सचेंज या डिटर्जेंट हटाने के अतिरिक्त चरणों की आवश्यकता होती है क्योंकि डिटर्जेंट ट्रिप्सिन पाचन में हस्तक्षेप कर सकता है और डाउनस्ट्रीम तरल क्रोमैटोग्राफी-टैंडेम मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एलसी-एमएस / एमएस) विश्लेषण 3 के प्रदर्शन को काफी नीचा दिखा सकता है। पेप्टाइड्स आमतौर पर एंजाइमेटिक पाचन के बाद एलसी-एमएस / एमएस संगत सॉल्वैंट्स में आगे desalted, सूखे और पुनर्गठित होते हैं। ये प्रोटीन जैव रसायन प्रक्रियाएं श्रम-गहन और समय लेने वाली हो सकती हैं। इस प्रकार, वे प्रोटिओमिक्स वर्कफ़्लोज़ के थ्रूपुट को सीमित करना जारी रखते हैं और अधिग्रहित डेटा 4,5 की परिवर्तनशीलता में योगदान करते हैं। मानव त्रुटियों और पूर्वाग्रहों को डेटा विचरण और पुनरुत्पादन 6,7 को प्रभावित करने वाले महत्वपूर्ण कारकों के रूप में पहचाना गया है। मास स्पेक्ट्रोमेट्री नमूना तैयारी वर्कफ़्लो में मानव त्रुटियों को कम करने के लिए, स्वचालित पिपेटिंग रोबोटिक सिस्टम का उपयोग शॉटगन प्रोटिओमिक्स और लक्षित मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण से प्रोटीन की पहचान और परिमाणीकरण के थ्रूपुट और पुनरुत्पादन में सुधार करने के लिए किया गया है, जहां इस तरह की प्रगति को महत्वपूर्ण अनुसंधान और नैदानिक सेटिंग्स में प्रोटिओमिक्स प्रौद्योगिकियों को व्यापक रूप से अपनाने के लिए धक्का जारी रखने के लिए सहायक के रूप में स्वागत किया गया है8, 9,10,11,12,13. हालांकि, अधिकांश मौजूदा प्रोटोकॉल रोबोट तरल हैंडलिंग प्लेटफार्मों का उपयोग करते हैं जिनके लिए पर्याप्त निवेश और प्रशिक्षण की आवश्यकता होती है, अकादमिक वातावरण में या अन्यथा सीमित बजट के साथ कई प्रयोगशालाओं में उनकी उपयोगिता को सीमित करता है।
यह आलेख वर्णन करता है कि एक प्रोटोकॉल जो एक विशिष्ट शॉटगन प्रोटिओमिक्स नमूना तैयारी वर्कफ़्लो को अर्ध-स्वचालित करने के लिए कम लागत, ओपन-सोर्स रोबोट तरल हैंडलिंग सिस्टम, OT-2 का उपयोग करता है। ओटी -2 में कई अन्य रोबोट तरल हैंडलिंग सिस्टम की तुलना में कम लागत है, और लेखन के समय, लगभग $ 5,000 अमेरिकी डॉलर की लागत आती है। जब विभिन्न मॉड्यूल और लैबवेयर की कीमतों में फैक्टरिंग होती है, तो लेखन के समय इस प्रोटोकॉल में प्रयोगों को स्थापित करने की कुल लागत लगभग $ 10,000 होती है, जो इसे अधिक महंगे विकल्पों पर प्रयोगशालाओं के काफी व्यापक सेट के लिए अधिक सस्ती बनाती है। ओटी -2 पायथन स्क्रिप्ट के माध्यम से ओपन-सोर्स प्रोग्रामिंग के साथ संगत है और उपयोगकर्ता-परिभाषित DIY प्रोटोकॉल डिजाइन में महान लचीलापन प्रदान करता है। तीन इन-हाउस विकसित लिपियों का उपयोग करते हुए, नीचे दिए गए प्रोटोकॉल एक ठेठ शॉटगन प्रोटिओमिक्स नमूना तैयारी वर्कफ़्लो को ओटी -2 स्टेशन पर एक ठेठ एटिपिकल प्रोटीन मानक (गोजातीय सीरम एल्ब्यूमिन) के साथ निष्पादित करते हैं; बीएसए) और एक सामान्य मानव हृदय लिसेट का एक जटिल प्रोटीन नमूना (चित्रा 1)। प्रसंस्करण के लिए प्रक्रियाएं (1) एक बीएसए नमूना और (2) एक जटिल कार्डियक लिसेट नमूना क्रमशः प्रोटोकॉल अनुभागों 1, 2, 5, 6 और 3, 4, 5, 6, में विस्तृत हैं। सेरा-मैग कार्बोक्सीलेट-संशोधित चुंबकीय मोतियों का उपयोग प्रोटीन और पेप्टाइड नमूनों में डिटर्जेंट और लवण को हटाने के लिए एकल-पॉट ठोस-चरण-संवर्धित नमूना तैयारी (एसपी 3) में किया जाता है। गोजातीय सीरम एल्ब्यूमिन और मानव हृदय प्रोटीन से ट्राइप्टिक डाइजेस्ट को एसपी 3 मोतियों द्वारा आगे साफ किया जाता है और एलसी-एमएस / एमएस विश्लेषण के लिए प्रस्तुत किया जाता है। मास स्पेक्ट्रा तो पेप्टाइड और प्रोटीन की पहचान के लिए MaxQuant सॉफ्टवेयर का उपयोग कर विश्लेषण कर रहे हैं. हमारे द्वारा किए गए प्रतिनिधि परिणामों से पता चलता है कि प्रोटोकॉल बेंच समय की बचत करते हुए भिन्नता (सीवी) के उत्कृष्ट तकनीकी गुणांक प्राप्त करता है और हाथ को पचाने के लिए गैर-अवर है।
Protocol
Representative Results
Discussion
प्रोटोकॉल के भीतर महत्वपूर्ण कदम
सबसे अच्छा प्रदर्शन के लिए, Opentrons-सत्यापित labware, मॉड्यूल, और OT-2 के साथ संगत consumables का उपयोग किया जाना चाहिए। कस्टम labware संदर्भ 14 पर Opentrons के निर्देश के बाद बनाया जा …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को एनआईएच पुरस्कारों F32-HL149191 द्वारा YH को भाग में समर्थित किया गया था; R00-HL144829 EL के लिए; R21-HL150456, R00-HL127302, R01-HL141278 MPL करने के लिए। चित्रा 1, चित्रा 2, चित्रा 3 एक वेब आधारित विज्ञान चित्रण उपकरण की सहायता से बनाए गए हैं, BioRender.com।
Materials
| 300 µL pipette tips | Opentrons | ||
| 4-in-1 tube rack set | Opentrons | Each set includes 2 base stands and 4 tube holder tops 1.5mL, 2mL, 15mL + 50mL, 15mL, and 50mL. We use 2mL and 15 mL + 50 mL tops in this study. | |
| Acclaim PepMap 100 C18 HPLC Column | Thermo Scientific | #164568 | 3 μm particle; 100 Å pore; 75 μm x 150 mm |
| Acetonitrile LC-MS grade | VWR | #JT9829 | |
| Aluminum block set | Opentrons | This block set includes 3 tops that are compatible with 96-well, 2.0 mL tubes and a PCR strip to use with the OT-2 temperature module. We use the 2.0mL tube holder in this manuscript. | |
| Ammonium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | # A6141 | |
| Bovine Serum Albumin Standard, 2 mg/mL | Thermo Scientific | #23210 | |
| Dimethylsulfoxide (DMSO) LC-MS grade | Thermo Scientific | #85190 | |
| Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | #D5545 | |
| EASY-Spray HPLC Columns | Thermo Scientific | #ES800A | |
| EasynLC 1200 Nano LC | Thermo Scientific | #LC140 | |
| Ethanol Proof 195-200 | Fisher | #04-355-720 | |
| Formic Acid LC-MS grade | Thermo Scientific | #85178 | |
| Human heart lysate | Novus Biologicals | NB820-59217 | |
| Iodoacetamide | Sigma-Aldrich | #I1149 | |
| Magnetic tube rack | Thermo Scientific | #MR02 | |
| MAXQuant v.1.6.10.43 | Tyanova et al., 2016 (https://www.maxquant.org/) | ||
| mySPIN 6 Mini Centrifuge | Thermo Scientific | #75004061 | benchtop mini centrifuge for quick spin |
| NEST 2 mL 96-Well Deep Well Plate, V Bottom | Opentrons | ||
| OT-2 magnetic module | Opentrons | GEN1 | |
| OT-2 P300 single channel pipette | Opentrons | GEN1 | |
| OT-2 P50 single channel pipette | Opentrons | GEN1 | |
| OT-2 robot pipetting robot | Opentrons | OT-2 | |
| OT-2 temperature module | Opentrons | GEN1 | |
| Pierce Quantitative Colorimetric Peptide Assay | Thermo Scientific | #23275 | |
| Protein LoBind tubes 2.0 mL | Eppendorf | #022431102 | |
| Protein Sequence Database | UniProt/SwissProt | https://www.uniprot.org/uniprot/?query=proteome:UP000005640% 20reviewed:yes |
|
| Sera-Mag SpeedBead Carboxylate-Modified Magnetic Particles, Hydrophobic | Cytiva | #65152105050250 | |
| Sera-Mag SpeedBead Carboxylate-Modified Magnetic Particles, Hydrophylic | Cytiva | #45152105050250 | |
| SpeedVac | Thermo Scientific | Vacuum evaporator | |
| Thermo Q Exactive HF Mass Spectrometer | Thermo Scientific | #IQLAAEGAAPFALGMBFZ | |
| Trypsin MS Grade | Thermo Scientific | #90057 | |
| Water LC-MS grade | VWR | #BDH83645.400 |
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- . Web URL Available from: https://docs.opentrons.com/v2/ (2021)
- . Web URL Available from: https://www.cytivalifesciences.com/en/us/solutions/genomics/knowledge-center/cleanup-for-mass-spectrometry (2021)
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