Elaborazione dei campioni di Shotgun Proteomics automatizzata da un robot da laboratorio open source
Summary
Protocollo dettagliato e tre script Python sono forniti per il funzionamento di un sistema di gestione dei liquidi robotico open source per eseguire la preparazione semi-automatizzata di campioni proteici per esperimenti di spettrometria di massa, che coprono la rimozione del detergente, la digestione delle proteine e le fasi di desalinizzazione dei peptidi.
Abstract
Gli esperimenti di proteomica a fucile basati sulla spettrometria di massa richiedono più fasi di preparazione del campione, tra cui la digestione e la pulizia enzimatica delle proteine, che possono richiedere significative ore di lavoro al banco e presentare una fonte di variabilità da lotto a lotto. L’automazione di laboratorio con robot di pipettaggio può ridurre il lavoro manuale, massimizzare la produttività e aumentare la riproducibilità della ricerca. Tuttavia, i prezzi di partenza elevati delle stazioni di automazione standard le rendono inaccessibili per molti laboratori accademici. Questo articolo descrive un flusso di lavoro di preparazione dei campioni di proteomica utilizzando un conveniente sistema di automazione open source (The Opentrons OT-2), comprese le istruzioni per l’impostazione di passaggi semi-automatizzati di riduzione delle proteine, alchilazione, digestione e pulizia; così come gli script Python open source di accompagnamento per programmare il sistema OT-2 attraverso la sua interfaccia di programmazione delle applicazioni.
Introduction
La proteomica del fucile a pompa basata sulla spettrometria di massa è un potente strumento per misurare l’abbondanza di molte proteine in campioni biologici contemporaneamente. Gli esperimenti di proteomica con l’analisi bioinformatica sono abitualmente impiegati per identificare i biomarcatori e scoprire complessi biologici associati e percorsi alla base dei meccanismi patologici. Con la sua elevata specificità analitica e la potenziale accuratezza quantitativa, la proteomica del fucile da caccia ha anche un eccellente potenziale per essere adottata da strutture di ricerca e laboratori diagnostici per l’analisi di campioni clinici senza la necessità di fare affidamento sugli anticorpi1,2.
Per preparare campioni proteici per l’analisi proteomica shotgun, le proteine estratte da campioni biologici (ad esempio, cellule e tessuti) in genere devono prima essere elaborate utilizzando protocolli lunghi, tra cui la misurazione della concentrazione proteica del campione, la riduzione delle proteine e l’alchilazione e la digestione enzimatica in peptidi. Inoltre, le proteine estratte in comuni tamponi di lisi contenenti detergenti spesso richiedono ulteriori fasi di scambio tampone o rimozione del detergente prima dell’analisi perché il detergente può interferire con la digestione della tripsina e degradare significativamente le prestazioni dell’analisi a valle della cromatografia liquida-spettrometria di massa tandem (LC-MS/MS)3. I peptidi sono in genere ulteriormente dissalati, essiccati e ricostituiti in solventi compatibili LC-MS/MS dopo la digestione enzimatica. Queste procedure di biochimica delle proteine possono essere laboriose e dispendiose in termini di tempo. Pertanto, continuano a limitare il throughput dei flussi di lavoro di proteomica e contribuiscono alla variabilità dei dati acquisiti4,5. Gli errori e i pregiudizi umani sono stati riconosciuti come fattori cruciali che influenzano la varianza e la riproducibilità dei dati6,7. Per ridurre al minimo gli errori umani nei flussi di lavoro di preparazione dei campioni di spettrometria di massa, sono stati utilizzati sistemi robotici di pipettaggio automatizzati per migliorare la produttività e la riproducibilità dell’identificazione e della quantificazione delle proteine dalla proteomica shotgun e dall’analisi mirata della spettrometria di massa, dove tali progressi sono stati salutati come strumentali per continuare la spinta verso l’adozione diffusa di tecnologie proteomiche nella ricerca critica e in contesti clinici8, 9,10,11,12,13. Tuttavia, la maggior parte dei protocolli esistenti utilizza piattaforme robotiche di gestione dei liquidi che richiedono investimenti e formazione sostanziali, limitando la loro utilità in molti laboratori in ambiente accademico o altrimenti con un budget limitato.
Questo articolo descrive un protocollo che utilizza un sistema di gestione dei liquidi robotico open source a basso costo, l’OT-2, per semi-automatizzare un tipico flusso di lavoro di preparazione dei campioni di proteomica del fucile. L’OT-2 ha un costo inferiore rispetto a molti altri sistemi robotici di gestione dei liquidi e, al momento della scrittura, costa circa $ 5.000 dollari USA. Quando si tiene conto dei prezzi di diversi moduli e labware, il costo totale per impostare esperimenti in questo protocollo al momento della scrittura è di circa $ 10.000, il che lo rende più conveniente per un insieme considerevolmente più ampio di laboratori rispetto a opzioni più costose. L’OT-2 è compatibile con la programmazione open source tramite script Python e offre grandi flessibilità nella progettazione di protocolli fai-da-te definiti dall’utente. Utilizzando tre script sviluppati internamente, i protocolli sottostanti coprono l’esecuzione di un tipico flusso di lavoro di preparazione del campione di proteomica shotgun sulla stazione OT-2 con uno standard proteico archetipico (albumina sierica bovina; BSA) e un campione proteico complesso di un normale lisato cardiaco umano (Figura 1). Le procedure per l’elaborazione (1) di un campione BSA e (2) di un campione complesso di lisato cardiaco sono dettagliate rispettivamente nelle sezioni 1, 2, 5, 6 e 3, 4, 5, 6 del protocollo. Le perle magnetiche modificate con carbossilato Di Sera-Mag sono utilizzate nella preparazione di campioni a fase solida (SP3) a vaso singolo per rimuovere detergenti e sali nei campioni di proteine e peptidi. I digest triptici dell’albumina sierica bovina e delle proteine cardiache umane vengono ulteriormente puliti dalle perline SP3 e sottoposti all’analisi LC-MS/MS. Gli spettri di massa vengono quindi analizzati utilizzando il software MaxQuant per l’identificazione di peptidi e proteine. I risultati rappresentativi da noi eseguiti mostrano che il protocollo raggiunge eccellenti coefficienti tecnici di variazione (CV) risparmiando tempo al banco ed è non inferiore alla digestione manuale.
Protocol
Representative Results
Discussion
Passaggi critici all’interno del protocollo
Per ottenere le migliori prestazioni, è necessario utilizzare labware, moduli e materiali di consumo compatibili con OT-2 verificati da Opentrons. Il labware personalizzato può essere creato seguendo le istruzioni di Opentrons su Reference14. Assicurarsi di calibrare il deck OT-2, le pipette e il labware quando vengono utilizzati per la prima volta. È anche fondamentale seguire le linee guida del produttore di perline SP3 per prepa…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato supportato in parte dai premi NIH F32-HL149191 a YH; R00-HL144829 a EL; R21-HL150456, R00-HL127302, R01-HL141278 a MPL. La Figura 1, la Figura 2, la Figura 3 vengono create con l’ausilio di uno strumento di illustrazione scientifica basato sul Web, BioRender.com.
Materials
| 300 µL pipette tips | Opentrons | ||
| 4-in-1 tube rack set | Opentrons | Each set includes 2 base stands and 4 tube holder tops 1.5mL, 2mL, 15mL + 50mL, 15mL, and 50mL. We use 2mL and 15 mL + 50 mL tops in this study. | |
| Acclaim PepMap 100 C18 HPLC Column | Thermo Scientific | #164568 | 3 μm particle; 100 Å pore; 75 μm x 150 mm |
| Acetonitrile LC-MS grade | VWR | #JT9829 | |
| Aluminum block set | Opentrons | This block set includes 3 tops that are compatible with 96-well, 2.0 mL tubes and a PCR strip to use with the OT-2 temperature module. We use the 2.0mL tube holder in this manuscript. | |
| Ammonium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | # A6141 | |
| Bovine Serum Albumin Standard, 2 mg/mL | Thermo Scientific | #23210 | |
| Dimethylsulfoxide (DMSO) LC-MS grade | Thermo Scientific | #85190 | |
| Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | #D5545 | |
| EASY-Spray HPLC Columns | Thermo Scientific | #ES800A | |
| EasynLC 1200 Nano LC | Thermo Scientific | #LC140 | |
| Ethanol Proof 195-200 | Fisher | #04-355-720 | |
| Formic Acid LC-MS grade | Thermo Scientific | #85178 | |
| Human heart lysate | Novus Biologicals | NB820-59217 | |
| Iodoacetamide | Sigma-Aldrich | #I1149 | |
| Magnetic tube rack | Thermo Scientific | #MR02 | |
| MAXQuant v.1.6.10.43 | Tyanova et al., 2016 (https://www.maxquant.org/) | ||
| mySPIN 6 Mini Centrifuge | Thermo Scientific | #75004061 | benchtop mini centrifuge for quick spin |
| NEST 2 mL 96-Well Deep Well Plate, V Bottom | Opentrons | ||
| OT-2 magnetic module | Opentrons | GEN1 | |
| OT-2 P300 single channel pipette | Opentrons | GEN1 | |
| OT-2 P50 single channel pipette | Opentrons | GEN1 | |
| OT-2 robot pipetting robot | Opentrons | OT-2 | |
| OT-2 temperature module | Opentrons | GEN1 | |
| Pierce Quantitative Colorimetric Peptide Assay | Thermo Scientific | #23275 | |
| Protein LoBind tubes 2.0 mL | Eppendorf | #022431102 | |
| Protein Sequence Database | UniProt/SwissProt | https://www.uniprot.org/uniprot/?query=proteome:UP000005640% 20reviewed:yes |
|
| Sera-Mag SpeedBead Carboxylate-Modified Magnetic Particles, Hydrophobic | Cytiva | #65152105050250 | |
| Sera-Mag SpeedBead Carboxylate-Modified Magnetic Particles, Hydrophylic | Cytiva | #45152105050250 | |
| SpeedVac | Thermo Scientific | Vacuum evaporator | |
| Thermo Q Exactive HF Mass Spectrometer | Thermo Scientific | #IQLAAEGAAPFALGMBFZ | |
| Trypsin MS Grade | Thermo Scientific | #90057 | |
| Water LC-MS grade | VWR | #BDH83645.400 |
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- . Web URL Available from: https://docs.opentrons.com/v2/ (2021)
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