Hagelgevär Proteomics provbehandling automatiserad av en labbrobot med öppen källkod
Summary
Detaljerade protokoll och tre Python-skript tillhandahålls för att driva ett robotiserat vätskehanteringssystem med öppen källkod för att utföra halvautomatiska proteinprovberedningar för massspektrometriexperiment, som täcker tvättmedelsborttagning, proteinrötning och peptidavsaltning.
Abstract
Masspektrometribaserade hagelgevär proteomik experiment kräver flera prov beredning steg, inklusive enzymatiska protein matsmältning och sanering, som kan ta upp betydande person-timmar av bänk arbete och presentera en källa till batch-till-batch variabilitet. Labbautomation med pipetteringsrobotar kan minska manuellt arbete, maximera genomströmningen och öka forsknings reproducerbarheten. Ändå gör de branta startpriserna för standardautomationsstationer dem oöverkomliga för många akademiska laboratorier. Den här artikeln beskriver ett arbetsflöde för proteomikprovberedning med hjälp av ett prisvärt automatiseringssystem med öppen källkod (The Opentrons OT-2), inklusive instruktioner för att ställa in halvautomatiska proteinreduktions-, alkylations-, matsmältnings- och rengöringssteg. samt medföljande Python-skript med öppen källkod för att programmera OT-2-systemet genom sitt applikationsprogrammeringsgränssnitt.
Introduction
Masspektrometribaserad hagelgevärsproteomik är ett kraftfullt verktyg för att mäta förekomsten av många proteiner i biologiska prover samtidigt. Proteomikexperiment med bioinformatikanalys används rutinmässigt för att identifiera biomarkörer och upptäcka tillhörande biologiska komplex och vägar som ligger till grund för patologiska mekanismer. Med sin höga analyt specificitet och potentiella kvantitativa noggrannhet har hagelgevärsproteomik också utmärkt potential att antas av forskningsanläggningar och diagnostiska laboratorier för klinisk provanalys utan att behöva förlita sig på antikroppar1,2.
För att förbereda proteinprover för analys av hagelgevärsproteomik måste proteiner som extraheras från biologiska prover (t.ex. celler och vävnader) vanligtvis först bearbetas med hjälp av långa protokoll, inklusive mätning av provproteinkoncentrationen, proteinreduktion och alkylation och enzymatisk nedbrytning till peptider. Dessutom kräver proteiner som extraheras i vanliga lysbuffertar som innehåller tvättmedel ofta ytterligare steg för buffertutbyte eller tvättmedelsborttagning före analys eftersom tvätt- och rengöringsmedel kan störa trypsinrötning och avsevärt försämra prestandan hos nedströms flytande kromatografi-tandem masspektrometri (LC-MS/MS) analys3. Peptider avsaltas, torkas och rekonstitueras vanligtvis i LC-MS/MS-kompatibla lösningsmedel efter enzymatisk nedbrytning. Dessa proteinbiokemiska procedurer kan vara arbetsintensiva och tidskrävande. Således fortsätter de att begränsa genomströmningen av proteomikarbetsflöden och bidrar till variabiliteten för förvärvade data4,5. Mänskliga fel och fördomar har erkänts som avgörande faktorer som påverkar datavarians och reproducerbarhet6,7. För att minimera mänskliga fel i arbetsflöden för beredning av massspektrometriprover har automatiserade robotsystem för pipettering använts för att förbättra genomströmningen och reproducerbarheten av proteinidentifiering och kvantifiering från hagelgevärsproteomik och riktad analys av masspektrometri, där sådana framsteg har hyllats som avgörande för att fortsätta arbetet med att allmänt anta proteomikteknik i kritisk forskning och kliniska miljöer8. 9,10,11,12,13. De flesta befintliga protokoll använder dock robotiska vätskehanteringsplattformar som kräver betydande investeringar och utbildning, vilket begränsar deras användbarhet i många laboratorier i den akademiska miljön eller på annat sätt med en begränsad budget.
Den här artikeln beskriver ett protokoll som använder ett billigt, öppen källkodsrobotiskt vätskehanteringssystem, OT-2, för att halvautomatisera ett typiskt arbetsflöde för förberedelse av hagelgevär proteomik. OT-2 har en lägre kostnad än många andra robotiska vätskehanteringssystem, och kostar i skrivande stund cirka $ 5,000 US-dollar. När man räknar in priserna på olika moduler och labware är den totala kostnaden för att ställa in experiment i detta protokoll i skrivande stund cirka $ 10,000, vilket gör det mer överkomligt för en betydligt bredare uppsättning laboratorier över dyrare alternativ. OT-2 är kompatibel med programmering med öppen källkod via Python-skript och erbjuder stor flexibilitet i användardefinierad DIY-protokolldesign. Med hjälp av tre egenutvecklade manus täcker protokollen nedan ett typiskt arbetsflöde för beredning av hagelgevärsproteomikprov på OT-2-stationen med en arketypisk proteinstandard (bovint serumalbumin; BSA) och ett komplext proteinprov av en normal human hjärtlystna (figur 1). Förfarandena för bearbetning (1) ett BSA-prov och 2) ett komplext hjärtlystnaprov beskrivs i protokollavsnitten 1, 2, 5, 6 respektive 3, 4, 5, 6. Sera-Mag karboxoxylatmodifierade magnetiska pärlor används i en kruka solid fas-förbättrad provberedning (SP3) för att ta bort tvättmedel och salter i protein- och peptidproverna. Tryptiska sammandrag från bovin serum albumin och humana hjärtproteiner rengörs ytterligare av SP3 pärlor och skickas in för LC-MS /MS analys. Masspektra analyseras sedan med hjälp av MaxQuant-programvaran för peptid- och proteinidentifiering. Representativa resultat som utförs av oss visar att protokollet uppnår utmärkta tekniska variationskoefficienter (CV) samtidigt som bänktid sparas och är inte sämre än handsammanfattning.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kritiska steg i protokollet
För bästa prestanda bör Opentrons-verifierade labware, moduler och förbrukningsartiklar kompatibla med OT-2 användas. Anpassade labware kan skapas enligt Opentrons instruktion på Reference14. Se till att kalibrera OT-2-däcket, pipetter och labbprogram när de används för första gången. Det är också viktigt att följa riktlinjer från SP3 pärlor tillverkare för att förbereda pärlor för peptid och protein sanering. Under bead- och pep…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes delvis av NIH-utmärkelser F32-HL149191 till YH; R00-HL144829 till EL; R21-HL150456, R00-HL127302, R01-HL141278 till MPL. Figur 1, figur 2, figur 3 skapas med hjälp av ett webbaserat vetenskapligt illustrationsverktyg, BioRender.com.
Materials
| 300 µL pipette tips | Opentrons | ||
| 4-in-1 tube rack set | Opentrons | Each set includes 2 base stands and 4 tube holder tops 1.5mL, 2mL, 15mL + 50mL, 15mL, and 50mL. We use 2mL and 15 mL + 50 mL tops in this study. | |
| Acclaim PepMap 100 C18 HPLC Column | Thermo Scientific | #164568 | 3 μm particle; 100 Å pore; 75 μm x 150 mm |
| Acetonitrile LC-MS grade | VWR | #JT9829 | |
| Aluminum block set | Opentrons | This block set includes 3 tops that are compatible with 96-well, 2.0 mL tubes and a PCR strip to use with the OT-2 temperature module. We use the 2.0mL tube holder in this manuscript. | |
| Ammonium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | # A6141 | |
| Bovine Serum Albumin Standard, 2 mg/mL | Thermo Scientific | #23210 | |
| Dimethylsulfoxide (DMSO) LC-MS grade | Thermo Scientific | #85190 | |
| Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | #D5545 | |
| EASY-Spray HPLC Columns | Thermo Scientific | #ES800A | |
| EasynLC 1200 Nano LC | Thermo Scientific | #LC140 | |
| Ethanol Proof 195-200 | Fisher | #04-355-720 | |
| Formic Acid LC-MS grade | Thermo Scientific | #85178 | |
| Human heart lysate | Novus Biologicals | NB820-59217 | |
| Iodoacetamide | Sigma-Aldrich | #I1149 | |
| Magnetic tube rack | Thermo Scientific | #MR02 | |
| MAXQuant v.1.6.10.43 | Tyanova et al., 2016 (https://www.maxquant.org/) | ||
| mySPIN 6 Mini Centrifuge | Thermo Scientific | #75004061 | benchtop mini centrifuge for quick spin |
| NEST 2 mL 96-Well Deep Well Plate, V Bottom | Opentrons | ||
| OT-2 magnetic module | Opentrons | GEN1 | |
| OT-2 P300 single channel pipette | Opentrons | GEN1 | |
| OT-2 P50 single channel pipette | Opentrons | GEN1 | |
| OT-2 robot pipetting robot | Opentrons | OT-2 | |
| OT-2 temperature module | Opentrons | GEN1 | |
| Pierce Quantitative Colorimetric Peptide Assay | Thermo Scientific | #23275 | |
| Protein LoBind tubes 2.0 mL | Eppendorf | #022431102 | |
| Protein Sequence Database | UniProt/SwissProt | https://www.uniprot.org/uniprot/?query=proteome:UP000005640% 20reviewed:yes |
|
| Sera-Mag SpeedBead Carboxylate-Modified Magnetic Particles, Hydrophobic | Cytiva | #65152105050250 | |
| Sera-Mag SpeedBead Carboxylate-Modified Magnetic Particles, Hydrophylic | Cytiva | #45152105050250 | |
| SpeedVac | Thermo Scientific | Vacuum evaporator | |
| Thermo Q Exactive HF Mass Spectrometer | Thermo Scientific | #IQLAAEGAAPFALGMBFZ | |
| Trypsin MS Grade | Thermo Scientific | #90057 | |
| Water LC-MS grade | VWR | #BDH83645.400 |
Riferimenti
- Geyer, P. E., et al. Revisiting biomarker discovery by plasma proteomics. Molecular Systems Biology. 13 (9), 942 (2017).
- Coscia, F., et al. A streamlined mass spectrometry-based proteomics workflow for large-scale FFPE tissue analysis. The Journal of Pathology. 251 (1), 100-112 (2020).
- Yeung, Y. -. G., Neives, E., Angeletti, R., Stanley, E. R., et al. Removal of detergents from protein digests for mass spectrometry analysis. Analytical Biochemistry. 382 (2), 135-137 (2008).
- Addona, T. A., et al. Multi-site assessment of the precision and reproducibility of multiple reaction monitoring-based measurements of proteins in plasma. Nature Biotechnology. 27 (7), 633-641 (2009).
- Lowenthal, M. S., Liang, Y., Phinney, K. W., Stein, S. E. Quantitative bottom-up proteomics depends on digestion conditions. Analytical Chemistry. 86 (1), 551-558 (2014).
- Elliott, K. C., Resnik, D. B. Scientific reproducibility, human error, and public policy. Bioscience. 65 (1), 5-6 (2015).
- Brown, A. W., Kaiser, K. A., Allison, D. B. Issues with data and analyses: Errors, underlying themes, and potential solutions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (11), 2563-2570 (2018).
- van den Broek, I., et al. Automated multiplex LC-MS/MS assay for quantifying serum apolipoproteins A-I, B, C-I, C-II, C-III, and E with qualitative apolipoprotein E phenotypic. Clinical Chemistry. 62 (1), 188-197 (2016).
- Müller, T., et al. Automated sample preparation with SP3 for low-input clinical proteomics. Molecular Systems Biology. 16 (1), 9111 (2020).
- Fu, Q., et al. Highly reproducible automated proteomics sample preparation workflow for quantitative mass spectrometry. Journal of Proteome Research. 17 (1), 420-428 (2018).
- Liu, X., Gygi, S. P., Paulo, J. A. A semiautomated paramagnetic bead-based platform for isobaric tag sample preparation. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 32 (6), 1519-1529 (2021).
- Poulsen, K. M., Pho, T., Champion, J. A., Payne, C. K. Automation and low-cost proteomics for characterization of the protein corona: experimental methods for big data. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 412 (24), 6543-6551 (2020).
- Liang, Y., et al. Fully automated sample processing and analysis workflow for low-input proteome profiling. Analytical Chemistry. 93 (3), 1658-1666 (2021).
- . Web URL Available from: https://opentrons.com/ot-app/ (2021)
- . Web URL Available from: https://docs.opentrons.com/v2/ (2021)
- . Web URL Available from: https://www.cytivalifesciences.com/en/us/solutions/genomics/knowledge-center/cleanup-for-mass-spectrometry (2021)
- . Web URL Available from: https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/23275#/23275 (2021)
- Han, Y., Wright, J. M., Lau, E., Lam, M. P. Y. Determining alternative protein isoform expression using RNA sequencing and mass spectrometry. STAR Protocols. 1 (3), 100138 (2020).
