नोट: iTACS प्लेटफ़ॉर्म का उपयोग करके जांच किए गए नमूने एक नरम सब्सट्रेट का पालन करने वाली कोशिकाएं हैं। यांत्रिक और रासायनिक संकेतों का आकलन करने के लिए प्रोटोकॉल को दो अनुक्रमिक भागों में विभाजित किया गया है: अधिग्रहण और प्रशिक्षण मॉड्यूल (AcTrM) और विश्लेषण और विज़ुअलाइज़ेशन मॉड्यूल (AnViM)। 1. अधिग्रहण और प्रशिक्षण मॉड्यूल (AcTrM) नोट:: AcTrM डेटा अधिग्रहण और उपयोगकर्ता स्व-प्रशिक्षण की प्रक्रिया को स्वचालित करता है। किसी भी डेटा अधिग्रहण से पहले, एक नरम सब्सट्रेट तैयार करें जो उन बलों को मापने के लिए आवश्यक जानकारी प्रदान करने में सक्षम है जो कोशिकाएं उस पर लगाती हैं। हाइड्रोजेल तैयारीनोट: यहां लक्ष्य एक 1,250 पीए कतरनी मापांक, लगभग 100 μm मोटाई, और 22 मिमी व्यास polyacrylamide (पीएए) हाइड्रोजेल तैयार करना है। Yeung et al. की विधि का पालन करके polyacrylamide समाधान तैयार करें और Trepat et al.14,15 द्वारा वर्णित चरणों के बाद हाइड्रोजेल डाली। प्रक्रिया का एक अपवाद यह है कि कोशिकाओं के ठीक नीचे एम्बेडेड मोती व्यास में 0.5 μm हैं और पीले प्रतिदीप्ति का उत्सर्जन करते हैं। 2 μm मोतियों को कवरग्लास में संलग्न करने के चरण को छोड़ दें यदि देखने वाले क्षेत्र में एक बड़ा सेल-मुक्त क्षेत्र होने की उम्मीद है।नोट: हाइड्रोजेल तैयारी प्रोटोकॉल अब काफी field16 में स्थापित है। बाद के विवरण के दौरान, 0.5 μm मोतियों को ‘शीर्ष मोतियों’ के रूप में संदर्भित किया जाता है, और 2 μm मोतियों को ‘नीचे मोतियों’ के रूप में संदर्भित किया जाता है। हालांकि, नीचे मोती वैकल्पिक हैं जहां छवि वाले क्षेत्र में एक बड़ा सेल-मुक्त क्षेत्र होता है। इस तरह के एक सेल मुक्त क्षेत्र से शीर्ष मनका पैटर्न नीचे मनका पैटर्न के उद्देश्य की सेवा करेगा। माइक्रोस्कोप चरण पर एम्बेडेड फ्लोरोसेंट मोतियों के साथ हाइड्रोजेल माउंट करें। प्लेट के तापमान को स्थिर-स्थिति प्राप्त करने के लिए 15-20 मिनट की अनुमति दें।नोट: प्लेट की शीर्ष सतह को एक्स्ट्रासेल्युलर मैट्रिक्स प्रोटीन के साथ कार्यात्मक किया जाता है, लेकिन कोशिकाओं को अभी तक हाइड्रोजेल पर बीज नहीं दिया गया है। संदर्भ छवि अधिग्रहण भाग 1: एक स्थिति सूची बनानानोट:: मैन्युअल इनपुट इस चरण में निम्न AcTrM सर्वोत्तम मनका वितरण के साथ स्थानों को चुनने के लिए संकेत देता है शामिल हैं। इस चरण में पहले से बनाई गई कोई भी फ़ाइलों का उपयोग नहीं किया जाता है. इस चरण में उत्पादित प्रमुख नए फ़ोल्डरों में ‘t0imgs’, ‘tnimgs’, और ‘textfiles’ फ़ोल्डर शामिल हैं, और उत्पादित फ़ाइल में स्थिति सूची फ़ाइल शामिल है। AcTrM का उपयोग कर किसी स्थिति सूची के निर्माण का मार्गदर्शन निम्न चरणों के दृश्य विवरण के लिए चित्र 2 देखें। प्रदर्शित उदाहरण 20x आवर्धन पर डेटा प्राप्त करता है। प्रारंभ μManager 2.0 – बीटा. IMBL संसाधन विंडो में AcTrM.bsh बटन पर क्लिक करके AcTrM चलाएँ। अधिग्रहण गुण परिभाषित करें शीर्षक वाली विंडो में, उचित उद्देश्य का चयन करें, पार्श्व स्थिति की सटीकता के लिए सहिष्णुता (यानी, XY) वसूली, किसी न किसी और परिष्कृत refocusing (यानी, z) ऑपरेशन के चरण आकार, और फोकस वसूली के लिए स्वीकार्य छवि सहसंबंध गुणांक का मूल्य।नोट: पार्श्व स्थिति पुनर्प्राप्ति के लिए एक बेहतर सहिष्णुता स्थिति वसूली को धीमा कर देगी, लेकिन डेटा विश्लेषण के दौरान पर्याप्त सहिष्णुता को स्थिति सुधार की आवश्यकता होगी और फोकस रिकवरी में कठिनाई हो सकती है। एक छोटा कदम आकार refocusing ऑपरेशन धीमा कर देगा, लेकिन एक बहुत ही उच्च कदम आकार फोकस को याद करने के अवसरों के साथ तेजी से आंदोलन का कारण बन सकता है। AcTrM – चरण 0 विंडो में, स्थिति सूची बनाने के लिए ताज़ा अधिग्रहण का चयन करें।नोट:: AcTrM शीर्षक विंडो – चरण 1 सभी कुंजी अगले चरणों को सूचीबद्ध करता है। इन चरणों में चरण को स्थानांतरित करना, फोकस को समायोजित करना और μManager में बटन पर क्लिक करना शामिल है। ये चरण डेटा अधिग्रहण के लिए उपयुक्त पदों की सूची के निर्माण में मार्गदर्शन करते हैं। AcTrM – चरण 1 विंडो में सूचीबद्ध मैन्युअल समायोजन के लिए नमूनों को विज़ुअलाइज़ करने के लिए लाइव इन माइक्रोमैनेजर पर क्लिक करें। इस विंडो पर सूचीबद्ध चरणों का पालन करें। अब मोतियों की छवि प्राप्त करें। शीर्ष मोतियों के लिए उपयुक्त चैनल का चयन करें। नीचे के मोतियों को भी देखना सुनिश्चित करें। ऐसा करने के लिए, नीचे मोतियों के लिए चैनलों का चयन करें। नीचे के मोतियों की एक धुंधली छवि देखी जाती है।नोट:: चैनलों को मुख्य μManager विंडो पर पूर्व निर्धारित ड्रॉपडाउन मेनू से स्विच किया जा सकता है। यदि प्रयोग में नीचे के मोतियों का उपयोग किया जाता है, तो सुनिश्चित करें कि वे चयनित स्थिति में मौजूद हैं। ये मोती धुंधले दिखाई देंगे। उपयुक्त स्थिति का चयन करने पर, स्थिति को सहेजने के लिए स्टेज पोजीशन लिस्ट विंडो में मार्क इन पर क्लिक करें।नोट: सबसे अच्छी स्थिति को शीर्ष सतह (यानी, शीर्ष मोतियों) के ठीक नीचे एम्बेडेड शीर्ष मोतियों के घने और समान वितरण द्वारा परिभाषित किया गया है और कवर ग्लास (यानी, नीचे के मोतियों) (पूरक चित्रा S1) से जुड़े कम से कम दो मोतियों द्वारा परिभाषित किया गया है। फोकस रिकवरी तेज होती है यदि नीचे के मोती बड़े, आउट-ऑफ-फोकस रिंग्स के रूप में दिखाई देते हैं। हालांकि, यदि प्रयोगों को ध्यान या पार्श्व स्थिति वसूली की आवश्यकता के साथ एक स्थिति में किया जाता है, तो नीचे मोतियों की छवि से संबंधित निर्देशों को अनदेखा करें। सूची में अतिरिक्त पदों को शामिल करने के लिए चित्र 2 में वर्णित चरणों 6-9 का पालन करें।नोट: कुछ अतिरिक्त पदों का चयन करें ताकि उन्मूलन का एक दौर प्लेट पर चुने गए सर्वोत्तम पदों के लिए अनुमति दे सके। भाग 2: संदर्भ छवियों का अधिग्रहणनोट:: इस चरण में कोई मैन्युअल इनपुट शामिल नहीं है। इस चरण में उपयोग की गई पहले बनाई गई कुंजी फ़ाइलों में ‘textfiles/*.pos’ शामिल हैं. इस चरण में उत्पादित प्रमुख नई फ़ाइलों और फ़ोल्डरों में ‘t0imgs’ और ‘tnimgs’ फ़ोल्डरों के भीतर शामिल हैं। AcTrM का उपयोग कर संदर्भ छवियों के अधिग्रहण का मार्गदर्शन करने वाले निम्न चरणों के दृश्य विवरण के लिए चित्र 3 और अनुपूरक आकृति S2 देखें. AcTrM – चरण 2 विंडो भी सभी प्रमुख चरणों को सूचीबद्ध करता है। AcTrM – चरण 2 विंडो में सूचीबद्ध चरणों का पालन करते हुए, बहु-आयामी अधिग्रहण विंडो में विकल्प बनाएँ। उदाहरण के लिए, लंबे समय तक चूक करने के लिए, कई छवियों को इंगित करें, चरण चैनल के रूप में पहले चैनल का चयन करें, और फिर शीर्ष मोतियों के लिए अगले का चयन करें और उसके बाद एक नीचे मोतियों के लिए है। Multi-Dimensional Acquisition विंडो में Close पर क्लिक करें, और फिर ActrM – Step 2 विंडो में OK पर क्लिक करें। AcTrM – चरण 3 विंडो में, संदर्भ-छवि-आधारित XYZ स्थिति पुनर्प्राप्ति संलग्न करने के लिए चुनें। विकल्प आमतौर पर हाँ है। हालांकि, यदि छवियों को फोकस या चरण बहाव के लिए कोई जगह नहीं है, तो AcTrM में विकल्प – चरण 3 विंडो नहीं होगी। AcTrM – XYZ पुनर्प्राप्ति विकल्प विंडो में, किसी न किसी XYZ वसूली के लिए चैनल सेट करें, चाहे परिष्कृत XYZ पुनर्प्राप्ति, क्षेत्र, और परिष्कृत XYZ पुनर्प्राप्ति के लिए चैनल और पुन: ध्यान केंद्रित करना शुरू करने की दिशा (अनुपूरक चित्रा S4). पूरा होने पर, AcTrM संदर्भ छवियों को प्राप्त करेगा।नोट: चैनल के लिए विशिष्ट विकल्प नीचे मोती चैनल होगा। XYZ पुनर्प्राप्ति सबसे अच्छा काम करता है जब वर्तमान कार्यान्वयन में पूर्ण छवि के साथ किया जाता है। संदर्भ छवियों में आमतौर पर हाइड्रोजेल की एक प्रेषित प्रकाश छवि, शीर्ष मोतियों की एक फ्लोरोसेंट छवि और नीचे मोतियों की एक फ्लोरोसेंट छवि शामिल होगी। प्रत्येक छवि सेट की सामग्री बहु-आयामी अधिग्रहण विंडो में किए गए विकल्पों के आधार पर भिन्न हो सकती है। फिर भी, सॉफ़्टवेयर चित्र 2 में निर्धारित प्रत्येक स्थिति पर सेट संदर्भ छवि प्राप्त करेगा। इस चरण के अंत में, तीन फ़ोल्डर चुने गए निर्देशिका में बनाए जाते हैं: ‘t0imgs’, ‘tnimgs’, और ‘textfiles’. ‘t0imgs’ फ़ोल्डर में μManager द्वारा पहचाने गए प्रारूप में संदर्भ छवियां होती हैं और बाद के चरणों में उपयोग की जाती हैं; ‘tnimgs’ फ़ोल्डर में ‘c0_p0_t0.tif’, ‘c1_p0_t0.tif’ आदि फ़ाइल नामों के साथ अलग-अलग TIFF छवियां होती हैं। यहाँ, ‘c’ चैनल के लिए खड़ा है, ‘p’ का अर्थ स्थिति के लिए है, और ‘t’ का अर्थ समय है। इन अक्षरों के बाद क्रमशः चैनल संख्या, स्थिति संख्या और फ्रेम संख्या हैं। फ़ोल्डर ‘textfiles’ XML स्वरूप में स्थिति सूची और छवि अधिग्रहण और स्थिति पुनर्प्राप्ति के लिए उपयोगकर्ता विकल्प शामिल हैं। सेल सीडिंग और विकासनोट: iTACS प्लेटफ़ॉर्म में अनुयायी कोशिकाओं के यांत्रिक व्यवहार के सामान्य इन विट्रो मूल्यांकन में उपयोग किए जाने वाले नमूना तैयारी प्रोटोकॉल को समायोजित करने का लचीलापन है, जिसमें विरल कोशिकाएं, पूरी तरह से confluent monolayer, नेटवर्क गठन परख, और छेद या महत्वपूर्ण अंतराल के साथ मोनोलेयर शामिल हैं। संस्कृति चूहे फुफ्फुसीय माइक्रोवैस्कुलर एंडोथेलियल कोशिकाओं को एक फ्लास्क 17,18 में संगम करने के लिए। ट्रिप्सिन का उपयोग करके कोशिकाओं को अलग करें। एक संस्कृति माध्यम में कोशिकाओं को फिर से निलंबित कर दिया गया जिसमें 10% भ्रूण गोजातीय सीरम शामिल है, एक एकाग्रता 1 x 106 कोशिकाओं / एमएल के लिए। आंशिक रूप से सूखी हाइड्रोजेल सतह पर पुन: निलंबित कोशिकाओं की एक 5 μL बूंद रखें और इसे सेल संस्कृति इनक्यूबेटर में रखें।नोट: 10% भ्रूण गोजातीय सीरम युक्त संस्कृति माध्यम में 2 दिनों के बाद, उस बूंद में कोशिकाएं कोशिकाओं का एक भीड़ भरा द्वीप बनाती हैं1। शेष प्रयोग के लिए स्वचालित छवि अधिग्रहणनोट:: इस चरण के लिए मैन्युअल इनपुट निम्न AcTrM छवि अधिग्रहण को पुनरारंभ करने के लिए संकेत देता है शामिल हैं। इस चरण द्वारा उपयोग की जाने वाली पहले से बनाई गई कुंजी में ‘textfiles/*.pos’ और ‘t0imgs’ फ़ोल्डर में नीचे मनका छवि फ़ाइलें शामिल हैं। इस चरण में उत्पादित प्रमुख नई फ़ाइलों में अद्यतन स्थिति सूची फ़ाइलें और छवियां ‘tnimgs / * _t * .tif’ शामिल हैं। सुनिश्चित करें कि माइक्रोस्कोप पर्यावरण नियंत्रण प्रणाली स्थिर ऊतक संस्कृति स्थितियों तक पहुंचती है। धीरे से माइक्रोस्कोप चरण पर सुसंस्कृत कोशिकाओं वाली प्लेट माउंट करें। तापमान और आर्द्रता को स्थिर करने के लिए 15-20 मिनट की अनुमति दें।नोट:: AcTrM का उपयोग कर शेष प्रयोग के लिए छवियों के अधिग्रहण का मार्गदर्शन निम्न चरणों के दृश्य विवरण के लिए चित्र4 देखें। प्रारंभ μManager 2.0 – बीटा. IMBL संसाधन विंडो में AcTrM.bsh बटन पर क्लिक करके AcTrM चलाएँ।नोट:: अधिग्रहण गुण निर्धारित करें विंडो में किए गए विकल्पों पर ध्यान न दें, लेकिन पिछले चरण में किए गए विकल्पों का उपयोग करें। AcTrM – चरण 0 विंडो में, रुका हुआ अधिग्रहण जारी रखें का चयन करें। पहले चरण में बहु-आयामी अधिग्रहण विंडो में पहचाने गए आवर्धन और निर्देशिका का चयन करें जहां डेटा फ़ोल्डर (‘t0imags’, ‘tnimgs’, और ‘textfiles’) सहेजे गए थे।नोट:: विंडो का शीर्षक उपयुक्त निर्देशिका का चयन करने के लिए उपयोगकर्ता का मार्गदर्शन करता है। प्लेट विंडो को पुनर्स्थापित करने में, रीपोजिशनिंग के लिए उपयोग किए जाने वाले चैनल के साथ प्लेट (तीन नॉनकोलीनियर पोजीशन) को पुनर्स्थापित करने के लिए विकल्पों का चयन करें।नोट: सहेजी गई छवियों को कैमरे में देखा जाएगा। यदि ओवरलैपिंग छवियां लाल, हरे और काले रंग की छवि के रूप में प्रदर्शित होती हैं, तो मैन्युअल समायोजन करें। अधिग्रहण के साथ आगे बढ़ने के लिए Accept पर क्लिक करें।नोट: यह चरण प्लेट संरेखण की अपरिवर्तनीयता से मामूली बदलाव को दूर करता है जब प्लेट माइक्रोस्कोप चरण पर remounted है। AcTrM का पालन करें लाल (आमतौर पर नीचे मोतियों की) में दिखाए गए संदर्भ छवि की एक समग्र छवि दिखाकर तीन पदों में से प्रत्येक पर संरेखण को तेज करने के लिए संकेत देता है और वर्तमान में हरे रंग में दिखाए गए उद्देश्य के माध्यम से देखी गई छवि। लाल रंग के करीब पर्याप्त रूप से हरे रंग को प्राप्त करना सॉफ़्टवेयर के लिए कम काम छोड़ देता है। जब ओवरलैप सही होता है, तो समग्र छवि पीली और काली दिखाई देती है। पर्याप्त रूप से बंद आमतौर पर तब होता है जब एक ही नीचे के मोती लाल और हरे रंग की छवियों दोनों में दिखाई देते हैं, और संबंधित लाल और हरे रंग के आउट-ऑफ-फोकस छल्ले एक-दूसरे को छू रहे हैं। प्लेट repositioning पूरा होने के बाद, AcTrM प्रत्येक चयनित स्थिति के लिए मंच लेता है और क्या वर्तमान में कैमरे के माध्यम से देखा जाता है के साथ संदर्भ छवि मिलान द्वारा XYZ स्थिति को पुनर्प्राप्त करता है। पहले पार्श्व (XY) स्थिति का मिलान किया जाता है, और फिर फ़ोकस (Z) का मिलान किया जाता है। किसी न किसी वसूली स्थिति और ध्यान की परिष्कृत वसूली के बाद है. प्रयोग की वर्तमान स्थिति के अद्यतन पूरक चित्र S3 में दिखाए गए चार-भाग विंडो के माध्यम से स्क्रीन पर प्रदर्शित होते हैं। अधिग्रहित छवियों को ‘tnimgs’ फ़ोल्डर में ‘*_t1.tif’, ‘*_t2.tif’ के बाद सहेजा जाता है, जो छवि सेट के लिए समय गणना को इंगित करता है। XYZ पुनर्प्राप्ति किसी अद्यतन की गई स्थिति की पहचान करता है, तो नई स्थिति सूची जनरेट किया गया है और ‘textfiles’ फ़ोल्डर में सहेजा गया है। 2. विश्लेषण और विज़ुअलाइज़ेशन मॉड्यूल (AnViM) स्वचालित डेटा विश्लेषण सेट करनानोट:: इस चरण में मैन्युअल इनपुट ‘tnimgs’ फ़ोल्डर के स्थान की पहचान शामिल है। इस चरण में उपयोग की गई पहले से बनाई गई कुंजी में ‘tnimgs/*.tif’ शामिल हैं. इस चरण में उत्पादित प्रमुख नई फ़ाइलों और फ़ोल्डरों में ‘विश्लेषण’ फ़ोल्डर को एक ही पैरेंट फ़ोल्डर में ‘tnimgs’ और प्रत्येक स्थिति ‘analysis/p*’ के लिए फ़ोल्डर्स के रूप में शामिल किया गया है। प्रत्येक ‘विश्लेषण/पी*’ के भीतर, यह चरण ‘phs’ और ‘tny’ फ़ोल्डरों के भीतर एक नई ‘* .tif’ छवि फ़ाइलें बनाता है। इन छवियों को कोशिकाओं और शीर्ष मोतियों की क्रॉप और डी-ड्रिफ्टेड छवियां हैं। बनाई गई अन्य फ़ाइलों में ‘विश्लेषण / विश्लेषणचॉइस.txt’ शामिल हैं जो विश्लेषण विकल्पों को सूचीबद्ध करता है, ‘विश्लेषण / पी * / स्किपएनालिसिस.txt’, जो उन उदाहरणों को सूचीबद्ध करता है जहां विश्लेषण को महत्वपूर्ण पहले से मौजूद बहाव के कारण छोड़ दिया जाता है, और ‘विश्लेषण / पी * / part_shift_values_pixel_degree.dat’ जो अनुमानित बहाव मूल्यों को सूचीबद्ध करता है। AnViM ‘tnimgs’ फ़ोल्डर में कच्चे डेटा को परिवर्तित नहीं करता है। AnViM का उपयोग करके स्वचालित डेटा विश्लेषण की स्थापना का मार्गदर्शन करने वाले निम्न चरणों के दृश्य विवरण के लिए चित्र 5 देखें. फिजी सॉफ़्टवेयर प्रारंभ करें और MSM ड्रॉप-डाउन मेनू में पहले विकल्प का चयन करें जिसे MSM के रूप में लेबल किया गया है – पूर्व-प्रसंस्करण। फ़ाइल ब्राउज़र संवाद का उपयोग करते हुए, ‘tnimgs’ फ़ोल्डर वाले फ़ोल्डर का चयन करें, जिसमें विश्लेषण किया गया डेटा होता है। छवियों के लिए चैनल को परिभाषित करें। अनुपूरक चित्रा S5 से दिशानिर्देशों का पालन करते हुए, कोशिकाओं की संचरित प्रकाश छवि (कोशिकाओं की चरण कंट्रास्ट छवि), नीचे मोती छवि और शीर्ष मोती छवि की चैनल संख्याओं की पहचान करें। निम्न तीन चेकबॉक्स (‘स्थिति फ़ोल्डर में फ़ाइलों को ले जाएँ’, ‘कठोर गति के लिए अतिरिक्त सुधार करें’, और ‘क्रॉप डेटा और स्थिति फ़ोल्डर में सहेजें’) आमतौर पर चेक किए जाते हैं. अंत में, भारी बहाव वाले डेटा, पिक्सेल आकार, और छवि के किनारों को अस्वीकार करने के लिए सहिष्णुता को परिभाषित करें जहां कोशिकाएं पार करती हैं। चमक को बढ़ाने के लिए संकेत का जवाब दें और नीचे मनका छवियों के विपरीत तो मोती प्रमुखता से दिखाई देते हैं. मेनू में स्लाइडर बार का उपयोग करके इसे समायोजित करें और ठीक पर क्लिक करें। अब शिफ्ट से छुटकारा पाने के लिए स्थिति सुधार करें, यदि कोई हो। एक बार हो जाने के बाद, एक विश्लेषण फ़ोल्डर बनाया जाता है।नोट: कंट्रास्ट एन्हांसमेंट आमतौर पर आवश्यक नहीं है, लेकिन यह प्रावधान उन प्रयोगों के लिए उपलब्ध है जहां लेजर के संपर्क को कम करने की आवश्यकता होती है। उस विकल्प के बाद, AnViM ‘tnimgs’ फ़ोल्डर से ‘विश्लेषण’ फ़ोल्डर में फ़ाइलों की प्रतिलिपि बनाता है। प्रत्येक स्थिति के अनुरूप फ़ाइलें ‘विश्लेषण/p0, विश्लेषण/p1’ आदि फ़ोल्डरों में सहेजी जाती हैं। इन स्थिति फ़ोल्डरों में से प्रत्येक के भीतर, AnViM ‘cels’, ‘defs’, और ‘refs’ फ़ोल्डर बनाता है जिसमें मूल संचरित प्रकाश छवि, शीर्ष मोती छवियां, और नीचे मोती छवियां होती हैं, क्रमशः (पूरक चित्रा S6)। AnViM तब नीचे मोतियों की छवियों में कठोर गति का विश्लेषण करता है और एक ‘phs’ फ़ोल्डर बनाता है जिसमें कोशिकाओं की एक सही संचारित प्रकाश छवि और एक ‘tny’ फ़ोल्डर होता है जिसमें अद्यतन शीर्ष मोती छवियां होती हैं। अंत में, चैनलों, संचालन, सहिष्णुता, पिक्सेल आकार, और सीमा-पार के उपयोगकर्ता विकल्प ‘analysisChoices.txt’ फ़ाइल (पूरक चित्रा S6) में सहेजे जाते हैं। हाइड्रोजेल और मोनोलेयर के विरूपण का परिमाणीकरणनोट: यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि छवियों के अनुक्रम से आंदोलन का परिमाणीकरण एक तेजी से विकसित होने वाला field19 है। प्रौद्योगिकी को लगातार सुविधाओं के लिए अनुकूलित किया जाता है, जिसमें गति, सटीकता, कच्ची छवियों के भीतर विशिष्ट विशेषताएं और विशिष्ट विरूपण पैटर्न शामिल हैं। इसलिए, यह संभावना है कि कुछ उपयोगकर्ता यहां प्रस्तुत एक की तुलना में एक अलग विरूपण परिमाणीकरण दृष्टिकोण का उपयोग कर सकते हैं। भाग 1: हाइड्रोजेल विरूपण का परिमाणीकरणनोट:: इस चरण में मैन्युअल इनपुट डेटा निर्देशिका की पहचान और ग्रिड रिज़ॉल्यूशन का चयन शामिल हैं। इस चरण में उपयोग की गई पहले से बनाई गई कुंजी में ‘p*/tny/*.tif’ शामिल हैं. इसमें उत्पादित प्रमुख नई फ़ाइलों में ‘पी * / विस्थापन / * _disp.dat’ शामिल हैं जो हाइड्रोजेल की शीर्ष सतह के विस्थापन वैक्टर को सूचीबद्ध करता है। AnViM के माध्यम से, शीर्ष मोतियों छवियों पर कण छवि Velocimetry विश्लेषण के माध्यम से संलग्न करने के लिए निम्नलिखित चरणों के दृश्य विवरण के लिए चित्रा 6 देखें20. फिजी सॉफ़्टवेयर प्रारंभ करें, और MSM ड्रॉप-डाउन मेनू से, MSM – Gel विरूपण का चयन करें. यहां से, उस विकल्प का चयन करें जो प्रयोग के लिए उपयुक्त है। फ़ाइल ब्राउज़र संवाद का उपयोग करते हुए, विश्लेषण किए गए डेटा वाले ‘विश्लेषण’ फ़ोल्डर की पैरेंट निर्देशिका का चयन करें. जेल विरूपण विंडो की गणना के लिए पैरामीटर में, उपयुक्त क्रॉस-सहसंबंध विंडो आकार, शोर स्तर, और थ्रेशोल्ड (अनुपूरक आकृति S7)20 का चयन करें।नोट:: परिणाम प्रत्येक स्थिति फ़ोल्डर ‘विश्लेषण/p0, विश्लेषण/p1’, आदि के भीतर एक नव निर्मित ‘विस्थापन’ निर्देशिका में सहेजे जाते हैं। यह वह जगह है जहां सभी आउटपुट फ़ाइलें संग्रहीत की जाती हैं। भाग 2: मोनोलेयर विरूपण का परिमाणीकरणनोट:: इस चरण में मैन्युअल इनपुट डेटा निर्देशिका की पहचान और ग्रिड रिज़ॉल्यूशन का चयन शामिल हैं। इस चरण में उपयोग की गई पहले से बनाई गई कुंजी में ‘p*/tny/*.tif’ शामिल हैं. इसमें उत्पादित प्रमुख नई फ़ाइलों में ‘पी */ वेग / * _vel.dat’ शामिल हैं जो कोशिकाओं के गति वैक्टर को सूचीबद्ध करती हैं। AnViM के माध्यम से संलग्न करने के लिए चरणों के दृश्य विवरण के लिए चित्रा 7 देखें, शीर्ष मोतियों छवियों पर कण छवि Velocimetry विश्लेषण20. प्रक्रिया हाइड्रोजेल विरूपण को परिमाणित करने के लिए अपनाई गई प्रक्रिया के समान है और MSM ड्रॉप-डाउन मेनू से MSM – सेलुलर मोशन का चयन करती है। परिणाम प्रत्येक स्थिति फ़ोल्डर ‘विश्लेषण / p0’, ‘विश्लेषण / p1’, आदि के भीतर एक नव निर्मित ‘वेग’ निर्देशिका में सहेजे जाते हैं। सेल-ईसीएम और सेल-सेल बलों का परिमाणीकरणनोट:: इस चरण में मैन्युअल इनपुट डेटा निर्देशिका की पहचान करना, हाइड्रोजेल कठोरता को इंगित करना, और सेलुलर क्लस्टर विभाजन का प्रत्युत्तर देना शामिल है, जो नो-सेल क्षेत्र से कक्षों का पता लगाने के लिए संकेत देता है। इस चरण में उपयोग की गई पहले से बनाई गई कुंजी में ‘p*/displacement/*_disp.dat’ शामिल हैं. इस चरण में उत्पादित प्रमुख नई फ़ाइलों में शामिल हैं: ‘पी * / कर्षण / * _trac.dat’, जो हाइड्रोजेल पर कोशिकाओं द्वारा लगाए गए बलों को सूचीबद्ध करता है; ‘पी */ कर्षण / * _domain.dat’, जो कोशिकाओं वाले ग्रिड बिंदुओं के स्थान को सूचीबद्ध करता है; और इनपुट फ़ाइलें ‘p*/traction.in, p*/clusterInput.txt’ और ‘p*/prestress.in’ जो इस चरण के लिए उपयोगकर्ता विकल्प रिकॉर्ड करती हैं। सेल-ईसीएम और सेल-सेल बलों के पहले मात्रात्मक मूल्यांकन के बाद, तकनीक के लिए कई विविधताएं विकसित की गई हैं1,15। विविधताएं सब्सट्रेट, कोशिकाओं, प्रयोगात्मक स्थितियों, या संख्यात्मक उपकरणों के विशेष मामलों पर ध्यान केंद्रित करती हैं7,8,21,22। AnViM, फूरियर ट्रांसफॉर्म ट्रैक्शन माइक्रोस्कोपी, और हाइड्रोजेल विरूपण डेटा 1,2,15 पर मोनोलेयर तनाव माइक्रोस्कोपी विश्लेषण के माध्यम से संलग्न करने के लिए दृश्य विवरण के लिए चित्रा 8 देखें। फिजी सॉफ़्टवेयर प्रारंभ करें, और MSM ड्रॉप-डाउन मेनू से, MSM – सेल-ECM और सेल-सेल फोर्सेस (ड्रॉपडाउन मेनू में तीसरा विकल्प) का चयन करें। फ़ाइल ब्राउज़र संवाद का उपयोग करते हुए, ‘विश्लेषण’ फ़ोल्डर ‘tnimgs’ और ‘विश्लेषण’ वाले ‘विश्लेषण’ वाले फ़ोल्डर्स की पैरेंट निर्देशिका का चयन करें जिसमें विश्लेषण किए गए डेटा शामिल हैं। Select पर क्लिक करें। सेलुलर बलों की गणना के लिए पैरामीटर विंडो में, कतरनी मापांक, हाइड्रोजेल की मोटाई और प्रत्याशित शोर स्तर दर्ज करें। ठीक का चयन करें। यह इसे MATLAB फ़ंक्शन के माध्यम से कर्षण निष्पादित करने देता है।नोट:: इन इनपुट के बाद, AnViM सेल-ECM बलों की गणना करता है। उसके बाद, इंगित करें कि मोनोलेयर confluent है या नहीं। यदि पूरी सेल छवि कोशिकाओं के साथ कवर की गई है, तो उत्तर हाँ है। उस स्थिति में, सेल-सेल बलों की गणना पूरे फ्रेम में की जाएगी। दूसरी ओर, यदि छवि के एक हिस्से में कोशिकाएं नहीं हैं, तो उत्तर नहीं है। उस स्थिति में, कक्षों वाले छवि क्षेत्र के विभाजन को सुविधाजनक बनाने के लिए AnViM संकेतों का पालन करें। यदि उत्तर नहीं है, तो सॉफ़्टवेयर द्वारा ऐसा करने का संकेत दिए जाने पर गैर-कक्ष ऑब्जेक्ट के चारों ओर मैन्युअल रूप से एक बहुभुज आरेखित करें, और तब विभाजन के लिए एक उपयुक्त विधि (ओं) का चयन करें. सॉफ्टवेयर कोशिकाओं के रंग (काले या सफेद) के लिए पूछना होगा। सॉफ़्टवेयर में स्वचालित रूप से स्पॉट भरें विकल्प की जाँच करें और ठीक पर क्लिक करें।नोट:: एक गैर confluent monolayer सेगमेंटिंग के लिए चरण ‘अनुभाग 2.4’ के पहले भाग में कवर किया जाएगा। सेल-ईसीएम बलों को प्रत्येक स्थिति फ़ोल्डर के भीतर एक नव निर्मित निर्देशिका ‘कर्षण’ में ‘* _trac.dat’ फ़ाइलों में संग्रहीत किया जाता है, और सेल-ईसीएम बल गणना सॉफ़्टवेयर के इनपुट को ‘traction.in’ फ़ाइल (पूरक चित्रा S8) में सहेजा जाता है। सेल-सेल बलों को प्रत्येक स्थिति फ़ोल्डर के भीतर एक नवनिर्मित निर्देशिका ‘prestress’ में ‘*_prestress.dat’ फ़ाइलों में संग्रहीत किया जाता है, और सेल-सेल बल गणना सॉफ़्टवेयर के लिए इनपुट फ़ाइल ‘prestress.in’ (अनुपूरक चित्रा S9) में सहेजा जाता है। अलग-अलग कक्षों पर ग्रिड बिंदु मानों का मानचित्रणनोट: iTACS के वर्तमान फोकस में से एक क्षेत्र में मापा यांत्रिक संकेतों की व्याख्या करने के लिए एक सीधा दृष्टिकोण पेश करने के लिए है। यह दृष्टिकोण एक क्लस्टर की पड़ोसी कोशिकाओं के बीच यांत्रिक बातचीत की जांच के लिए फायदेमंद है18. कुल मिलाकर, अब तक परिमाणित गुण सेलुलर क्लस्टर में नियमित रूप से स्पेस किए गए ग्रिड बिंदुओं पर हैं। यह डेटा अलग-अलग कोशिकाओं की रूपात्मक सीमा के भीतर चयनित गुणों के माध्यिका, माध्य और मानक विचलन की पहचान करता है और उन्हें सेलुलर भौतिक गुणों / संकेतों के रूप में असाइन करता है। इनमें से, मानक विचलन का उपयोग परिवर्तनशीलता को इंगित करने के लिए किया जाता है, माध्य और माध्यिका के बीच के अंतर का उपयोग वितरण की प्रकृति को इंगित करने के लिए किया जाता है, और चयनित गुणों के लिए कोशिकाओं की समग्र स्थिति को इंगित करने के लिए माध्य मान का उपयोग किया जाता है।भाग 1: उस छवि क्षेत्र का विभाजन जिसमें कक्ष हैंनोट:: इस चरण के लिए मैन्युअल इनपुट डेटा निर्देशिका की पहचान करना और कोई-कक्ष क्षेत्र से कक्षों का पता लगाने के लिए विभाजन संकेतों के लिए प्रत्युत्तर देना शामिल है। इस चरण में उपयोग की जाने वाली पहले से बनाई गई कुंजी में ‘p*/phs/*.tif’ शामिल हैं. इस चरण में उत्पादित प्रमुख नई फ़ाइलों में ‘p*/phs/bwImages/*.tif’ शामिल हैं, जो नो-सेल क्षेत्रों से सेल क्षेत्रों को अलग करने वाली बाइनरी छवियां हैं, ‘p*/phs/textResults/frameNum_percentHealed.txt’, जो प्रत्येक उदाहरण में कोशिकाओं द्वारा कवर किए गए प्रतिशत छवि क्षेत्र को सूचीबद्ध करता है, और ‘p*/clusterInput.txt’, जो AcTrM इंटरफ़ेस में दर्ज उपयोगकर्ता विकल्पों को रिकॉर्ड करता है। कक्षों वाले छवि क्षेत्र को विभाजित करने के लिए निम्न चरणों के दृश्य विवरण के लिए चित्र 9 देखें. सेल-सेल बलों की गणना करने से पहले इस भाग को पूरा किया जाना चाहिए। उस स्थिति में, इन चरणों को दोहराया जाना चाहिए नहीं। साथ ही, यदि ये चरण सेल-सेल बल परिकलन से पहले आयोजित किए जाते हैं, तो उन्हें बल परिकलन की शुरुआत में अनुरोध नहीं किया जाता है। फ़िजी सॉफ़्टवेयर प्रारंभ करें, और MSM ड्रॉप-डाउन मेनू से, सेगमेंटेशन – सेलुलर क्लस्टर का चयन करें। फ़ाइल ब्राउज़र संवाद का उपयोग करते हुए, स्थिति निर्देशिका ‘विश्लेषण/p0’, ‘analysis/p1’, आदि का चयन करें, जिसमें नियमित रूप से स्पेस किए गए ग्रिड बिंदुओं पर परिमाणित गुण होते हैं। इंगित करें कि क्या मोनोलेयर confluent है।नोट:: नीचे दिए गए चरणों को केवल तभी लागू किया जाता है जब मोनोलेयर confluent नहीं है। AnViM का पालन करें जो कक्षों वाले छवि क्षेत्रों की पहचान करने के लिए उपन्यास बहु-आयामी दृष्टिकोण को लागू करने के लिए संकेत देता है। इस प्रक्रिया में चार तरीके शामिल हैं – प्रत्येक एक अलग तरीके से विभाजन के करीब पहुंच रहा है। संयोजन में उपयोग की जाने वाली इन विधियों में से एक या कई कोशिकाओं की छवियों की एक विस्तृत विविधता को कवर करते हैं। इसलिए, यह पता लगाने के लिए विभिन्न दृष्टिकोणों का प्रयास करें कि कौन सा संयोजन उनके डेटा के लिए सबसे अच्छा काम करता है। इष्टतम विभाजन प्राप्त करने के लिए ‘डोमेन कनेक्शन कारक’ और ‘स्मीयर कारक’ समायोजित करें।नोट:: ‘स्मीयर कारक’ कक्षों वाले क्षेत्रों को बड़ा बनाता है। इंगित करें कि कक्ष बाइनरी छवि में काले या सफ़ेद दिखाई देते हैं या नहीं. सीमा छवि को साफ़ करने के लिए निर्देश विंडो में, चुनें कि छवि को स्वचालित रूप से या मैन्युअल रूप से साफ़ करना है या नहीं.नोट:: छवियों की अवांछित सुविधाओं का विश्लेषण किया जा करने के लिए सेल क्लस्टर से डिस्कनेक्ट किए गए पिक्सेल पर कक्षों और सफेद धब्बे द्वारा कब्जा कर लिया पिक्सेल पर काले धब्बे हैं। विश्लेषण केवल उन क्षेत्रों पर किया जा सकता है जो जुड़े हुए हैं। इसलिए कई डिस्कनेक्ट किए गए क्षेत्रों का अलग से विश्लेषण किया जाना चाहिए। भाग 2: छवियों में अलग-अलग कोशिकाओं का विभाजननोट:: इस चरण के लिए मैन्युअल इनपुट डेटा निर्देशिका की पहचान करना और छवि के भीतर अलग-अलग कक्षों का पता लगाने के लिए विभाजन संकेतों का प्रतिसाद देना शामिल है। इस चरण में उपयोग की जाने वाली पहले से बनाई गई कुंजी में ‘p*/phs/*.tif’ और ‘p*/phs/bwImages/*.tif’ शामिल हैं। उत्पादित प्रमुख नई फ़ाइलों में ‘p*/phs/textResults/*.csv’ शामिल हैं, जिनमें सेलुलर रूपात्मक गुण होते हैं। मोनोलेयर के अलग-अलग कक्षों को विभाजित करने के लिए निम्न चरणों के दृश्य विवरण के लिए चित्र 10 देखें। फिजी सॉफ़्टवेयर प्रारंभ करें, और MSM ड्रॉप-डाउन मेनू से, सेगमेंटेशन – व्यक्तिगत सेल का चयन करें. फ़ाइल ब्राउज़र संवाद का उपयोग करते हुए, स्थिति निर्देशिका ‘विश्लेषण/p0’, ‘analysis/p1’, आदि का चयन करें, जिसमें नियमित रूप से स्पेस किए गए ग्रिड बिंदुओं पर परिमाणित गुण होते हैं। इनपुट पैरामीटर चुनें विंडो में, अधिकतम पहलू अनुपात, सेल सीमा की तुलना में सेल केंद्र कितना बाहर खड़ा है, और कक्षों का पता लगाने का मार्गदर्शन करने के लिए दो धुंधला पैरामीटर (अनुपूरक चित्रS10) की प्रमुखता को इंगित करें। प्रत्येक स्थिति के लिए छवि स्टैक पर, सबसे छोटे सामान्य सेल पर एक बहुभुज खींचें। इसका उपयोग क्षेत्र की गणना करने के लिए किया जाता है। इससे छोटी किसी भी चीज को सॉफ्टवेयर द्वारा सेल के रूप में नहीं माना जाएगा। इसके बाद सबसे बड़े सामान्य सेल के चारों ओर एक बहुभुज खींचें और इंगित करें कि सेल केंद्र या सेल-सेल इंटरफ़ेस उज्ज्वल है या नहीं।नोट: AnViM तब उस फ़्रेम के भीतर कक्षों पर जानकारी वाले प्रत्येक फ़्रेम के लिए ‘phs/textResults/0001.csv’, ‘phs/textResults/0002.csv’ आदि फ़ाइलें बनाता है. इस स्तर पर, इस फ़ाइल में कोशिकाओं के बारे में रूपात्मक जानकारी शामिल है, जिसमें क्षेत्र, केंद्रक, परिधि, अभिविन्यास, परिपत्रता, पहलू अनुपात, गोलाकारता, ठोसता, नो-सेल क्षेत्र से दूरी शामिल है। इन गुणों में लंबाई इकाई पिक्सेल है, और कोण डिग्री में है। अंत में, इस फ़ाइल को बाद के चरणों में सेलुलर पिक्सेल तीव्रता, गति और बलों को शामिल करने के लिए अद्यतन किया जाता है। भाग 3: कक्षों पर पिक्सेल तीव्रता का मानचित्रणनोट:: इस चरण में मैन्युअल इनपुट डेटा निर्देशिका की पहचान करना और मैपिंग गुण और पैरामीटर का चयन करना शामिल है। इस चरण में उपयोग की जाने वाली पहले से बनाई गई कुंजी में ‘p*/phs/*.tif’ (या ‘p*/fluo/*.tif’) और ‘p*/phs/bwImages/*.tif’ शामिल हैं। इस चरण में उत्पादित प्रमुख नई फ़ाइलों में ‘p*/phs/textResults/*.csv’ शामिल हैं, जो सेलुलर रूपात्मक गुणों को सूचीबद्ध करता है। अलग-अलग कक्षों और उनके पड़ोसी क्षेत्र द्वारा शामिल क्षेत्र में पिक्सेल तीव्रता का आकलन करने और उन्हें कोशिकाओं के गुणों के रूप में परिभाषित करने के लिए निम्न चरणों के दृश्य विवरण के लिए चित्र11 देखें। फिजी सॉफ़्टवेयर प्रारंभ करें, और MSM ड्रॉप-डाउन मेनू से, कक्षों पर मानचित्र – तीव्रता का चयन करें. फ़ाइल ब्राउज़र संवाद का उपयोग करते हुए, स्थिति निर्देशिका ‘विश्लेषण/p0’, ‘analysis/p1’, आदि का चयन करें, जिसमें नियमित रूप से स्पेस किए गए ग्रिड बिंदुओं पर परिमाणित गुण होते हैं। जब सॉफ़्टवेयर द्वारा संकेत दिया जाता है, तो सेल विभाजन का पता लगाएँ या सेलुलर प्रतिदीप्ति को परिमाणित करें का चयन करें. पड़ोसी क्षेत्र के आकार को परिभाषित करें। पड़ोसी क्षेत्र के गुण एकत्रित करें और कक्ष बक्सों के गुण एकत्रित करें दोनों की जाँच करें. OK पर क्लिक करें। सेलुलर तीव्रता विंडो को रिकॉर्ड करने के उद्देश्य में, इंगित करें कि तीव्रता मानचित्रण के लिए किस प्रकार की छवि का उपयोग किया जाना है, पड़ोसी क्षेत्र का आकार, और क्या डेटा व्यक्तिगत कोशिकाओं या दोनों कोशिकाओं और उनके पड़ोसी क्षेत्रों (पूरक चित्रा S11) के लिए एकत्र किया जाता है।नोट:: एक चरण-कंट्रास्ट छवि की पिक्सेल तीव्रता मैपिंग सेल विभाजन ईवेंट का पता लगाने की अनुमति देता है। फ्लोरोसेंट छवि तीव्रता का मानचित्रण फ्लोरोसेंटली टैग किए गए साइटोप्लाज्मिक अणुओं में उतार-चढ़ाव का पता लगाने में सक्षम करेगा। उपर्युक्त चरणों का आउटपुट अलग-अलग कक्षों के लिए माध्य, माध्यिका, मानक विचलन, न्यूनतम और अधिकतम पिक्सेल तीव्रता मान है. इन संख्याओं को ‘phs/textResults/0001.csv’, ‘phs/textResults/0002.csv’ आदि फ़ाइलों में नए स्तंभों के रूप में दर्ज किया जाता है। भाग 4: कोशिकाओं पर बलों और गति का मानचित्रणनोट:: इस चरण के लिए मैन्युअल इनपुट डेटा निर्देशिका की पहचान करना और मैपिंग गुण और पैरामीटर का चयन करना शामिल है। इस चरण में उपयोग की जाने वाली कुंजी में पहले से बनाई गई फ़ाइलों में ‘p*/phs/textResults/*.csv’, ‘p*/velocity/*_vel.dat’, ‘p*/displacement/*_disp.dat’, ‘p*/traction/*_trac.dat’, ‘p*/prestress/*_prestress.dat’, और ‘p*/phs/bwImages/*.tif’ शामिल हैं। इस चरण के दौरान कोई नई फ़ाइलें नहीं बनाई जाती हैं। इसके बजाय, नई जानकारी (सेलुलर बल और गति गुण) ‘p*/phs/textResults/*.csv’ फ़ाइलों में जोड़े जाते हैं। अलग-अलग कोशिकाओं और उनके पड़ोसी क्षेत्र द्वारा शामिल क्षेत्र में बलों और गति का आकलन करने और उन्हें कोशिकाओं के गुणों के रूप में परिभाषित करने के लिए चरणों के दृश्य विवरण के लिए चित्र12 देखें। कक्षों पर MSM ड्रॉप-डाउन मेनू मानचित्र से चुनें – गति / बल डेटा (अनुपूरक चित्रा S12)। उसके बाद, चरण 2.4.3 में सूचीबद्ध चरणों का पालन करें।नोट: नए कॉलम ‘phs / textResults / 0001.csv’, ‘phs / textResults / 0002.csv’ आदि फ़ाइलों में जोड़े जाते हैं और गति का माध्य, माध्यिका और मानक विचलन, वेग का अभिविन्यास, औसत साइटोस्केलेटल तनाव, तनाव अनिसोट्रॉपी, हाइड्रोजेल में तनाव ऊर्जा, उच्चतम तनाव का अभिविन्यास, और सेल-ईसीएम कर्षण का परिमाण (पूरक चित्रा S13) शामिल हैं। परिणामों का विज़ुअलाइज़ेशन भाग 1: प्रयोग भर में सेलुलर पहचान की ट्रैकिंगनोट:: इस चरण के लिए मैन्युअल इनपुट डेटा निर्देशिका की पहचान करना और विज़ुअलाइज़ करने के लिए मैप किए गए गुणों का चयन करना शामिल है। इस चरण में उपयोग की गई पहले से बनाई गई कुंजी में ‘p*/phs/textResults/*.csv’ शामिल हैं. इस चरण के दौरान उत्पादित प्रमुख नई फ़ाइलों में ‘p*/phs/textResults/cellTimeTrace_*.csv’ शामिल हैं, जिसमें सेलुलर डेटा का समय ट्रेस होता है। प्रयोग की पूरी अवधि में अलग-अलग कक्षों के गुणों को ट्रैक करने के लिए निम्न चरणों के दृश्य विवरण के लिए चित्र 13 देखें। फिजी सॉफ़्टवेयर प्रारंभ करें, और MSM ड्रॉप-डाउन मेनू से, परिणाम – ट्रैक डेटा का चयन करें. फ़ाइल ब्राउज़र संवाद का उपयोग करते हुए, स्थिति निर्देशिका ‘विश्लेषण/p0’, ‘analysis/p1’, आदि का चयन करें, जिसमें ट्रैक किए जाने वाले सेलुलर गुण शामिल हैं. जब किया जाता है तो Select पर क्लिक करें। ट्रैकिंग विंडो के लिए प्रारंभिक बिंदु चुनें विंडो में, निगरानी के लिए प्रारंभिक फ़्रेम चुनें, और एक साथ ट्रैक किए गए फ़्रेमों की संख्या (अनुपूरक चित्रS14) चुनें. हमेशा फ़्रेम संख्या 2 से प्रारंभ करें क्योंकि फ़्रेम संख्या 1 के लिए वेग निर्धारित नहीं किया जा सकता है। जब आप ऐसा कर लें, तो OK पर क्लिक करें। ट्रैक्स बनाने के लिए चर की जाँच करें विंडो में, चर नाम लिखकर या चेकबॉक्स (अनुपूरक आकृति S15) से शब्दों का चयन करके चर चुनें. फिर, ठीक पर क्लिक करें।नोट:: ट्रैकिंग जनरेट करता है ‘phs/textResults/cellTimeTrace_*.csv’ फ़ाइलें प्रत्येक स्तंभ के साथ एक अद्वितीय कक्ष संख्या और प्रत्येक क्रमिक पंक्ति लगातार समय आवृत्ति का प्रतिनिधित्व करते हैं। भाग 2: मूल्यांकन किए गए सेलुलर गुणों के समय पटरियों का उत्पादननोट:: इस चरण के लिए मैन्युअल इनपुट डेटा निर्देशिका की पहचान करना और विज़ुअलाइज़ करने के लिए मैप किए गए गुणों का चयन करना शामिल है। इस चरण में उपयोग की जाने वाली पहले से बनाई गई कुंजी में ‘p*/phs/textResults/cellTimeTrace_*.csv’ शामिल हैं. इस चरण के दौरान उत्पादित प्रमुख नई फ़ाइलों में ‘p*/phs/trackedDataPlots/*.tif’ शामिल हैं, जिसमें टाइम ट्रैक प्लॉट और ‘p*/phs/trackedDataPlots/*.csv’ शामिल हैं, जिनमें प्लॉट डेटा होता है। मूल्यांकन किए गए सेलुलर गुणों के समय ट्रैक जनरेट करने के लिए निम्न चरणों के दृश्य विवरण के लिए चित्र 14 देखें। फिजी सॉफ़्टवेयर प्रारंभ करें, और MSM ड्रॉप-डाउन मेनू से, परिणाम – प्लॉट का चयन करें. फ़ाइल ब्राउज़र संवाद का उपयोग करते हुए, स्थिति निर्देशिका ‘विश्लेषण/p0’, ‘analysis/p1’, आदि का चयन करें, जिसमें ट्रैक किए गए सेलुलर गुण शामिल हैं। चुनें कि हाँ या नहीं बटन पर क्लिक करके अटूट पटरियों वाले कक्षों तक प्लॉटिंग को सीमित करना है या नहीं.नोट:: यह विकल्प उन कक्षों पर ध्यान नहीं देता है, जिन्हें एक या अधिक समय आवृत्तियों में नहीं पाया जा सका. एक साथ प्लॉट किए जाने वाले चर की संख्या चुनें और ठीक पर क्लिक करें।नोट:: वर्तमान में, AnViM एक ही प्लॉट में प्रदर्शित करने के लिए तीन चर की एक अधिकतम अनुमति देता है। ड्रॉप-डाउन मेनू का उपयोग करके प्लॉटिंग के लिए अलग-अलग चर चुनें.नोट:: ये चरण एक टैग की गई छवि फ़ाइल स्वरूप (TIFF) फ़ाइल और ‘phs/trackedDataPlots/’ फ़ोल्डर में एक अल्पविराम-अलग डेटा फ़ाइल बनाएँ। फ़ाइल नाम चर नामों से बना होता है जो एक अंडरस्कोर द्वारा अलग किए जाते हैं और एक सेल नंबर के साथ समाप्त होते हैं। भाग 3: मूल्यांकन किए गए सेलुलर गुणों के गर्मी मानचित्रों का उत्पादननोट:: इस चरण में मैन्युअल इनपुट डेटा निर्देशिका की पहचान करना और विज़ुअलाइज़ करने के लिए मैप किए गए गुणों का चयन करना शामिल है. इस चरण में उपयोग की जाने वाली पहले से बनाई गई कुंजी में ‘p*/phs/textResults/cellTimeTrace_*.csv’ शामिल हैं. इस चरण में उत्पन्न प्रमुख नई फ़ाइलों में ‘p*/phs/segmentedImages/cellPropMaps/*.tif’ शामिल हैं, जो सेलुलर गुणों के हीटमैप हैं। मूल्यांकन किए गए सेलुलर गुणों के ऊष्मा मानचित्र उत्पन्न करने के लिए चरणों के दृश्य विवरण के लिए चित्र 15 देखें. MSM ड्रॉप-डाउन मेनू परिणाम – चित्र से चुनें. चरण 2.5.2 में वर्णित चरणों का पालन करें।नोट:: आउटपुट ‘phs/segmentedImages/cellPropMaps/’ फ़ोल्डर में TIFF फ़ाइल फ़ाइलों के रूप में संग्रहीत किया जाता है। फ़ाइल नाम एक अंडरस्कोर द्वारा अलग किए गए समय आवृत्ति संख्या और चर नाम हैं।