Anwendung der passiven Kopfbewegung zur Erzeugung definierter Beschleunigungen an den Köpfen von Nagetieren
Summary
Das vorliegende Protokoll beschreibt ein speziell entwickeltes “passives Kopfbewegungssystem”, das mechanische Beschleunigungen an den Köpfen von Nagetieren reproduziert, die während ihres Laufbandlaufs mit moderaten Geschwindigkeiten erzeugt werden. Es ermöglicht es, mechanische Faktoren / Elemente von den positiven Auswirkungen körperlicher Bewegung zu trennen.
Abstract
Bewegung ist weithin als wirksam für verschiedene Krankheiten und körperliche Störungen anerkannt, einschließlich solcher, die mit Hirnfunktionsstörungen zusammenhängen. Die molekularen Mechanismen hinter den positiven Auswirkungen von Bewegung sind jedoch kaum verstanden. Viele körperliche Trainingseinheiten, insbesondere solche, die als Aerobic-Übungen wie Joggen und Gehen eingestuft werden, erzeugen impulsive Kräfte zum Zeitpunkt des Fußkontakts mit dem Boden. Daher wurde spekuliert, dass mechanische Einflüsse daran beteiligt sein könnten, wie Bewegung zur homöostase des Organismus beiträgt. Um diese Hypothese am Gehirn zu testen, wurde ein maßgeschneidertes “passives Kopfbewegungssystem” (im Folgenden als PHM bezeichnet) entwickelt, das vertikale Beschleunigungen mit kontrollierten und definierten Größenordnungen und Modi erzeugen und mechanische Stimulation reproduzieren kann, die während des Laufbandlaufs mit moderaten Geschwindigkeiten auf die Köpfe von Nagetieren angewendet werden kann, eine typische Intervention, um die Auswirkungen von Bewegung bei Tieren zu testen. Durch die Verwendung dieses Systems wurde gezeigt, dass PHM den Serotonin (5-Hydroxytryptamin, im Folgenden als 5-HT) bezeichnet) Rezeptor Subtyp 2A (5-HT2A) Signalweg in den präfrontalen Kortex (PFC) Neuronen von Mäusen rekapituliert. Diese Arbeit liefert detaillierte Protokolle für die Anwendung von PHM und die Messung der daraus resultierenden mechanischen Beschleunigungen an den Köpfen von Nagetieren.
Introduction
Bewegung ist vorteilhaft, um verschiedene körperliche Störungen zu behandeln oder zu verhindern, einschließlich Zivilisationskrankheiten wie Diabetes mellitus und essentielle Hypertonie1. In diesem Zusammenhang wurden auch Beweise für die positiven Auswirkungen von Bewegung auf die Gehirnfunktionen gesammelt2. Die molekularen Mechanismen, die den Vorteilen von Bewegung für das Gehirn zugrunde liegen, bleiben jedoch weitgehend ungeklärt. Die meisten körperlichen Aktivitäten und Workouts erzeugen zumindest teilweise mechanische Beschleunigungen am Kopf. Während verschiedene physiologische Phänomene mechanisch reguliert werden, ist die Bedeutung der mechanischen Belastung in den meisten Fällen im Bewegungsapparatdokumentiert 3,4,5. Obwohl das Gehirn auch bei körperlichen Aktivitäten, insbesondere sogenannten Schlagübungen, mechanischen Kräften ausgesetzt ist, wurde die mechanische Regulation der physiologischen Gehirnfunktion bisher kaum untersucht. Da die Erzeugung mechanischer Beschleunigungen am Kopf bei körperlichem Training relativ häufig ist, wurde spekuliert, dass mechanische Regulierung an den Vorteilen von Bewegung für die Gehirnfunktionen beteiligt sein könnte.
5-HT2A-Rezeptorsignale sind essentiell für die Regulierung von Emotionen und Verhaltensweisen zwischen verschiedenen biochemischen Signalen, die im Nervensystem funktionieren. Es ist an multiplen psychiatrischen Erkrankungen 6,7,8 beteiligt, bei denen sich Bewegung als therapeutisch wirksam erwiesen hat. 5-HT2A-Rezeptor ist ein Subtyp des 5-HT2-Rezeptors, der zur Serotonin-Familie gehört und auch ein Mitglied der G-Protein-gekoppelten Rezeptorfamilie (GPCR) ist, deren Signalisierung durch seine Internalisierung moduliert wird, entweder ligandenabhängig oder -unabhängig9. Kopfzucken ist ein charakteristisches Verhalten von Nagetieren, dessen Menge (Frequenz) explizit die Intensität der 5-HT2A-Rezeptorsignalisierung in ihren präfrontalen Kortex (PFC) Neuronendarstellt 10,11. Unter Ausnutzung der strengen Spezifität dieser halluzinogenen Reaktion auf verabreichtes 5-HT (Kopfzuckenreaktion, im Folgenden als HTR bezeichnet; siehe Ergänzender Film 1) wurde die oben erwähnte Hypothese über mechanische Auswirkungen von Trainingseffekten auf Gehirnfunktionen getestet. Daher analysierten und verglichen wir die HTR von Mäusen, die entweder erzwungenen Übungen (Laufbandlauf) oder übungsnachahmenden mechanischen Eingriffen (PHM) unterzogen wurden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mit dem entwickelten PHM-Applikationssystem haben wir gezeigt, dass die 5-HT-Signalisierung in ihren PFC-Neuronen mechanisch reguliert wird. Aufgrund der Komplexität der Bewegungseffekte war es schwierig, die Folgen von Bewegung im Rahmen der Gesundheitsförderung genau zu analysieren. Der Fokus liegt auf mechanischen Aspekten, um die Beteiligung oder den Beitrag von Stoffwechselereignissen auszuschließen, die mit oder nach Trainingsaktivitäten auftreten können, wie z.B. Energieverbrauch. Es wird erwartet, dass die h…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde teilweise durch den Intramural Research Fund des japanischen Ministeriums für Gesundheit, Arbeit und Soziales unterstützt; Zuschüsse für wissenschaftliche Forschung der Japan Society for the Promotion of Science (KAKENHI 15H01820, 15H04966, 18H04088, 20K21778, 21H04866, 21K11330, 20K19367); MEXT-unterstütztes Programm für die Strategic Research Foundation an privaten Universitäten, 2015-2019 vom japanischen Ministerium für Bildung, Kultur, Sport, Wissenschaft und Technologie (S1511017); die Naito Science & Engineering Foundation. Diese Forschung wurde auch von der Alliance for Regenerative Rehabilitation Research & Training (AR3T) finanziert, die vom Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development (NICHD), National Institute of Neurological Disorders and Stroke (NINDS) und National Institute of Biomedical Imaging and Bioengineering (NIBIB) der National Institutes of Health unter der Award-Nummer P2CHD086843 unterstützt wird.
Materials
| 5-hydroxytryptophan (5-HTP) | Sigma-Aldrich | H9772 | Serotonin (5-HT) precursor |
| Brushless motor driver | Oriental motor | BMUD30-A2 | Speed changer build-in motor driver |
| C57BL/6 mice | Oriental yeast company | C57BL/6J | Mice used in this study |
| Cryostat | Leica | CM33050S | Microtome to cut frozen samples |
| DC Motor | Oriental motor | BLM230-GFV2 | Motor |
| Donkey anti-goat Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A-11057 | Secondary antibody used for immunohistochemical staining |
| Donkey anti-mouse Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A-31571 | Secondary antibody used for immunohistochemical staining |
| Donkey anti-rabbit Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-21206 | Secondary antibody used for immunohistochemical staining |
| Donkey serum | Sigma-Aldrich | S30-100ML | Blocker of non-specific binding of antibodies in immunohistochemical staining |
| Fluorescence microscope | Keyence | BZ-9000 | Fluorescence microscope |
| Goat polyclonal anti-5-HT2A receptor | Santa Cruz Biotechnology | sc-15073 | Primary antibody used for immunohistochemical staining |
| Isoflurane | Pfizer | v002139 | Inhalation anesthetic |
| KimWipe | NIPPON PAPER CRECIA | S-200 | Paper cloth for cleaning surfaces, parts, instruments in labratory |
| Liquid Blocker | Daido Sangyo | PAP-S | Marker used to make the slide surface water-repellent |
| Mouse monoclonal anti-NeuN (clone A60) | EMD Millipore (Merck) | MAB377 | Primary antibody used for immunohistochemical staining |
| NinjaScan-Light | Switchscience | SSCI-023641 | Accelerometer to measure accelerations |
| OCT compound | Sakura Finetek | 45833 | Embedding agent for preparing frozen tissue sections |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Invitrogen | P36934 | Mounting medium to prevent flourscence fading |
| Rabbit polyclonal anti-c-Fos | Santa Cruz Biotechnology | sc-52 | Primary antibody used for immunohistochemical staining |
| Slide box | AS ONE | 03-448-1 | Opaque box to store slides |
| Spike2 | Cambridge electronic design limited (CED) | N/A | Application software used to analyze acceleration |
| Sprague-Dawley rats | Japan SLC | Slc:SD | Rats used in this study |
| Treadmill machine | Muromachi | MK-680 | System used in experiments of forced running of rats and mice |
Riferimenti
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