연속 흐름의 제조 및 작동, 투과화 감지 기능이 있는 미세 전기 천공 시스템
Summary
이 프로토콜은 랩온어칩, 마이크로유체 전기천공 장치를 구축하는 데 필요한 미세 가공 기술을 설명합니다. 실험 설정은 연속 흐름에서 제어된 단일 세포 수준 형질주입을 수행하며 집단 기반 제어를 통해 더 높은 처리량으로 확장할 수 있습니다. 세포막 투과 정도를 실시간으로 전기적으로 모니터링하는 기능을 보여주는 분석이 제공됩니다.
Abstract
CAR-T 세포 요법과 같은 현재의 치료 혁신은 바이러스 매개 유전자 전달에 크게 의존하고 있습니다. 이 기술은 효율적이지만 높은 제조 비용을 수반하여 유전자 전달을 위한 대체 방법을 사용하는 데 관심을 갖게 되었습니다. 전기 천공은 유전자 및 기타 외인성 물질의 세포 내 전달을위한 전기 물리적, 비 바이러스 적 접근법입니다. 전기장을 인가하면 세포막이 일시적으로 세포 내로 분자 전달을 허용합니다. 일반적으로 전기 천공은 많은 수의 세포를 처리하기 위해 대규모로 수행됩니다. 그러나 이러한 접근 방식에는 광범위한 경험적 프로토콜 개발이 필요하며, 이는 1차 및 형질주입하기 어려운 세포 유형으로 작업할 때 비용이 많이 듭니다. 세포를 투과시키기에 충분한 전기장 강도를 달성하기 위해 큰 전압의 요구 사항과 결합 된 긴 프로토콜 개발은 마이크로 스케일 전기 천공 장치의 개발로 이어졌습니다. 이러한 미세 전기 천공 장치는 일반적인 미세 가공 기술을 사용하여 제조되며 높은 처리량 기능을 유지할 수있는 잠재력으로 더 큰 실험 제어를 허용합니다. 이 작업은 연속 흐름 하에서 단일 세포 수준에서 세포막 투과 수준을 감지 할 수있는 미세 유체 전기 천공 기술을 기반으로합니다. 그러나 이 기술은 초당 처리되는 4개의 셀로 제한되었으므로 시스템 처리량을 늘리기 위한 새로운 접근 방식이 제안되고 여기에 제시됩니다. 세포 집단 기반 피드백 제어로 표시되는이 새로운 기술은 다양한 전기 천공 펄스 조건에 대한 세포 투과 반응을 고려하고 테스트중인 세포 유형에 가장 적합한 전기 천공 펄스 조건을 결정합니다. 그런 다음 더 높은 처리량 모드가 사용되며, 여기서 이 ‘최적의’ 펄스가 이동 중인 세포 현탁액에 적용됩니다. 장치를 제작하고, 미세유체 실험을 설정 및 실행하고, 결과를 분석하는 단계가 자세히 제시됩니다. 마지막으로, 이 미세 전기천공 기술은 녹색 형광 단백질(GFP)을 암호화하는 DNA 플라스미드를 HEK293 세포에 전달함으로써 입증됩니다.
Introduction
CAR-T(키메라 항원 수용체 조작 T 세포) 세포 치료 및 CRISPR(클러스터링된 규칙적인 간격의 짧은 회문 반복 DNA 서열)/Cas9를 사용한 유전자 편집과 같은 생물의학 연구의 현재 치료 혁신은 외인성 물질을 세포 내 공간1에 성공적이고 효율적으로 전달하는 능력에 크게 의존합니다. CAR-T 요법에서, 세포 치료제 제조에서 유전자 전달 단계를 수행하기 위한 황금 표준은 바이러스 벡터2를 사용하는 것이다. 바이러스 매개 유전자 전달은 효율적인 전달 방식이지만 몇 가지 단점도 있습니다. 여기에는 제조 비용, 세포 독성, 면역원성, 돌연변이 유발/종양 발생 가능성및 전달될 유전자의 크기 제한이 포함됩니다3. 이러한 한계로 인해 대체 비 바이러스 전달 기술의 연구 개발이 이루어졌습니다.
바이러스 매개 유전자 전달의 대안인 전기천공은 세포의 DNA, RNA 및 단백질 형질감염을 수행하기 위해 최적의 전기 펄스 파형의 적용에 의존합니다. 외부 전기장의 인가 후, 세포막이 잠시 손상되어, 세포가 불침투성 외인성 물질4의 세포내 전달에 취약하게 된다. 바이러스 매개 전달에 비해 전기 천공은 일반적으로 안전하고 작동하기 쉽고 운영 비용이 낮기 때문에 유리합니다. 전기천공은 소분자 화물과 대분자 화물을 모두 전달할 수 있으며 혈통에 관계없이 세포를 형질감염시키는 데 효율적일 수있습니다5. 전기천공 후 바람직한 결과, 즉 양호한 생존력 및 양호한 전기-형질주입 효율을 달성하려면, 다양한 실험 파라미터가 공동-최적화될 필요가 있다. 여기에는 세포 유형6, 세포 밀도, 분자 농도7, 전기천공 버퍼 특성(예: 분자 조성, 전도도 및 삼투압)8, 전극 크기/기하학적구조9, 전기 펄스 파형(모양, 극성, 펄스 수)10 이 포함됩니다(그림은 그림 1 참조). 이러한 각 파라미터가 전기천공 실험의 결과에 상당한 영향을 미칠 수 있지만, 적용된 펄스의 전기 에너지가 결과 세포 생존율과 전기 형질주입 효율8 사이의 본질적인 트레이드 오프의 근원이기 때문에 펄스 파형이 특히 자세히 연구되었습니다.
일반적으로 전기 천공 실험은 거시적 규모로 수행되며, 여기서 세포는 전기 천공 큐벳 내의 대형 병렬 플레이트 전극 세트 사이에 100 마이크로 리터의 버퍼에 현탁됩니다. 전극은 일반적으로 전극 거리가 1-4mm 인 알루미늄으로 제조됩니다. 피펫을 통해 셀을 수동으로 로드하면 큐벳이 부피가 큰 전기 펄스 발생기에 전기적으로 연결되어 사용자가 펄스 파형 파라미터를 설정하고 적용하여 셀 현탁액을 전기천공할 수 있습니다. 매크로 스케일 또는 벌크 전기천공은 셀 밀도>106 cells/mL를 처리할 수 있지만 전기 펄스 파형 설정을 최적화할 때 이 기능은 낭비가 될 수 있습니다. 이는 세포 집단 수가 제한될 수 있는 1차 세포 유형을 전기천공할 때 특히 중요합니다. 또한 전극 사이의 거리가 멀기 때문에 펄스 발생기는 전계 강도 >1kV / cm11)를 달성하기 위해 큰 전압을 공급할 수 있어야합니다. 이러한 고전압은 전해질 버퍼를 통한 저항성 전력 소산을 일으켜 줄 가열을 초래하며, 이는 결과적인 셀 생존율(12)에 해로울 수 있다. 마지막으로, 조밀한 세포 현탁액 상에서 전기천공을 수행하는 것은 결과적인 전기-형질감염 효율 및 세포 생존율의 선천적 가변성으로 일관되게 부담될 것이다. 현탁액의 각 셀은 주변 셀로 인해 다른 전기장 강도를 경험할 수 있습니다. 경험된 전기장 강도가 증가 또는 감소하는지 여부에 따라, 생성된 세포 생존율 또는 전기-형질주입 효율이 각각 부정적인 영향을 받을 수 있다(11). 거시적 규모의 전기 천공에 대한 이러한 단점은 마이크로 규모에서 작동하고 단일 셀 수준에서 더 나은 제어를 허용하는 대체 기술의 추구 및 개발로 이어졌습니다.
BioMEMS 또는 생물 의학 마이크로 전자 기계 시스템 분야는 마이크로 일렉트로닉스 산업의 기술 발전에서 비롯됩니다. 특히, 생물 의학 연구의 발전을위한 마이크로 장치를 개발하기 위해 미세 가공 공정을 활용합니다. 이러한 발전은 생체 내 전기 모니터링(13)을 위한 마이크로-전극 어레이, in situ 전기천공을 위한 용량성 마이크로-전극(14), 소형화된 organ-on-a-chip 장치(15), 마이크로유체 현장 진단 16, 바이오 센서(17), 및 나노-및 마이크로-전기천공 장치(19,20,21)를 포함하는 약물 전달 시스템(18)의 개발을 포함한다. . 생물학적 세포와 동일한 크기 규모로 장치를 설계하고 제조할 수 있는 능력으로 인해, 나노- 및 마이크로-전기천공 기술은 그들의 거시적 규모의 대응물(22, 23)과 비교할 때 유리하다. 이러한 전기 천공 장치는 일반적으로 10에서 100 마이크로 미터 간격의 전극 세트가 통합되므로 고전압 펄스 응용 분야의 요구 사항을 제거합니다. 이 기능은 전해질을 통한 전류를 크게 줄여 독성 전기 분해 제품의 축적과 이러한 시스템에서 줄 가열의 영향을 줄입니다. 마이크로스케일 채널은 또한 펄스 인가 동안 훨씬 더 균일한 전기장이 셀에 신뢰성 있게 인가되는 것을 보장하여, 보다 일관된 결과(24)를 초래한다. 또한, 미세-전기천공 장치가 미세유체 플랫폼에 통합되는 것도 일반적이며, 이는 세포 치료제 제조(25)에서 매우 바람직한 기능인 완전 자동화된 기술로의 미래 통합을 위해 그 자체를 제공한다. 마지막으로, 마이크로 스케일 전기 천공은 전기 천공 이벤트의 전기 조사를 허용합니다. 예를 들어, 세포막 투과화의 정도는 단일 세포 수준(26,27)에서 실시간으로 모니터링될 수 있다. 이 방법의 목적은 전기천공 프로토콜을 최적화하면서도 이전 최첨단 기술에 비해 처리량을 증가시키기 위해 세포막 투과 정도를 측정할 수 있는 미세유체, 단일 셀 미세 전기천공 장치의 미세 가공, 시스템 작동 및 분석을 설명하는 것입니다.
단일 세포 수준의 전기 천공을 수행하는 것은 더 이상 새로운 기술이 아니며, 2001 년 Rubinsky et al.에 의해 정적 세포 전기 천공 기술28의 개발로 처음 입증되었습니다. 그들의 마이크로 장치는 전기 천공 사건을 전기적으로 모니터링하는 능력을 최초로 입증했기 때문에 혁신적이었습니다. 이는 장치의 처리량을 증가시키기 위해 병렬화된 방식으로 세포막 투과 정도를 전기적으로 감지할 수 있는 정적 단일 세포 전기천공 기술의 개발로 이어졌습니다. 그러나 병렬화 및 배치 처리를 사용하더라도 이러한 장치는 단위 시간29,30 당 처리 할 수있는 총 셀 수가 심각하게 부족합니다. 이러한 제한은 훨씬 더 큰 처리량(31)에서 단일 셀 레벨 마이크로-전기천공을 수행할 수 있는 유동-관통 장치의 개발로 이어졌다. 정적에서 유동 환경으로의 이 장치 전환은 전기천공 펄스 적용 후 세포막 투과 정도를 전기적으로 모니터링하는 기능을 제한합니다. 이 작업에 설명 된 방법은 개별 세포의 세포막 투과 정도를 연속적인 직렬 방식으로 전기적으로 감지, 펄싱 및 모니터링 할 수있는 미세 전기 천공 기술인이 두 기술 간의 격차를 해소합니다.
이 기술은 최근 Zheng et al. 그 작업에서이 기술의 기능은 전기 천공 펄스의 진폭과 지속 시간이 모두 다양하고 세포막 투과를 나타내는 후속 전기 신호가 탐구 된 파라 메트릭 연구의 완료와 함께 도입되었습니다32. 결과는 전기천공 펄스의 강도의 증가(즉, 인가된 전기장의 증가 또는 펄스 지속시간의 증가)가 측정된 세포막 투과화의 증가를 야기한다는 것을 보여주었다. 시스템을 추가로 검증하기 위해 성공적인 전기 천공의 일반적인 형광 지표 인 요오드화 프로피듐33을 세포 현탁액에 추가하고 전기 펄스를 적용한 직후에 형광 이미지를 캡처했습니다. 광 신호, 즉 세포 내부의 요오드화 프로피듐의 형광 강도는 세포막 투과 정도의 전기적 측정과 강한 상관 관계가 있었으며,이 전기 측정의 신뢰성을 검증했습니다. 그러나이 연구는 번역 할 수있는 의미가 거의 또는 전혀없는 소분자 프로피듐 요오드화물의 전달만을 고려했습니다.
이 작업에서는 생물학적 활성 플라스미드 DNA(pDNA) 벡터를 전달하고 전기천공 후 재도금 및 배양된 세포의 전기 형질감염 효율을 평가하는 동시에 시스템의 처리량을 개선하기 위해 이 기술의 새로운 응용 프로그램이 도입되었습니다. 이전 작업은 전기천공 이벤트를 전기적으로 측정할 수 있는 기존 미세 전기 천공 기술을 능가하지만, 장치의 현재 상태는 여전히 세포 감지, 펄스 적용 및 세포막 투과화 측정을 수행하기 위해 전극 세트 사이의 긴 세포 이동 시간(~250ms)이 필요합니다. 단일 채널을 사용하면 처리량이 초당 4셀로 제한됩니다. 이러한 한계를 극복하기 위해, pDNA 전기-형질감염을 수행하기 위해 새로운 개념의 세포집단-기반 피드백-제어 전기천공이 도입된다. 이 시스템은 저생리학적 전도도 전기천공 버퍼를 사용하여 다양한 전기천공 펄스 응용 분야에서 단일 세포의 전기적 조사를 허용합니다. 전기적 반응에 기초하여, ‘최적의’ 전기천공 펄스가 결정된다. 그런 다음 세포막 투과화 결정이 무효화되고 유속이 증가하며 전기천공 펄스 듀티 사이클이 세포 통과 시간과 일치하여 전극 사이를 이동하는 셀당 하나의 펄스를 보장하는 ‘고처리량’ 모드가 구현됩니다. 이 작업은 마이크로 장치의 제조를 위한 미세 가공 단계, 실험을 수행하는 데 필요한 재료/장비 및 설정, 장치의 작동/분석 및 전기 형질주입 효율(eTE)에 대한 광범위한 세부 정보를 제공합니다.
그림 1: 전기천공 결과에 영향을 미치는 실험 요인. (왼쪽) 세포 현탁액 – 전기 천공이 시작되기 전에 고려해야 할 중요한 요소에는 페이로드 (이 경우 pDNA), 농도, 세포 밀도 및 전기 천공 완충액 특성이 포함됩니다. 고려해야 할 전기천공 완충액 특성은 전도도, 삼투압 및 이러한 값에 기여하는 정확한 분자 조성입니다. (가운데) 펄스 애플리케이션-정확한 펄스 유형(구형파 대 지수 감쇠) 및 펄스 파형(단일 펄스 대 펄스 트레인)을 최적화하여 결과 세포 생존율과 전기 형질주입 효율을 모두 최대화해야 합니다. 전기 천공 공정에서 구현되는 일반적인 펄스 트레인은 일반적으로 일련의 고전압 (HV) 펄스 또는 HV와 저전압 (LV) 펄스 크기 사이에서 회전하는 일련의 펄스로 구성됩니다. (오른쪽) 세포 회수-다운스트림 처리 단계, 특히 세포가 이송되는 회수 세포 배양 배지는 최적화되어야 합니다. 특징이 없는 경우(맨 왼쪽), 전체 전기천공 공정 최적화를 위해 추가 업스트림 셀 처리 단계를 구현할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 프로토콜에 제시된 방법론은 주로 특수 전기 천공 실험 설정에 통합되는 미세 유체 장치의 미세 가공에 중점을 둡니다. 미세 가공 공정의 세부 사항을 설명 할 때 자주 사용되는 ‘레시피’라는 용어는 작동하는 장치를 성공적으로 제작하기 위해 각 단계를 따르거나 최적화하는 것의 중요성을 암시합니다. 그러나 UV 노출 시간/에너지, PVD 스퍼터링 속도/지속 시간 및 산소 플라즈마 발생기 설정과 …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 국립 과학 재단 (NSF CBET 0967598, DBI IDBR 1353918)과 미국 교육부의 정밀 및 개인화 의학 신흥 분야의 대학원 교육 (P200A150131)의 재정 지원을 인정하고 싶습니다.
Materials
| 150-mm diameter petri dishes | VWR | 25384-326 | step 6.1.1 to secure wafer |
| 24-well tissue culture plates | VWR | 10062-896 | step 10.3.6 to plate electroporated cells |
| 33220A Waveform/Function generator | Agilent | step 9.2.3 electroporation pulse generator | |
| 4'' Si-wafers | University Wafer | subsection 2.1 for microfluidic channel fabrication | |
| 6-well tissue culture plates | VWR | 10062-892 | step 8.1.8 to plate cells |
| Acetone | Fisher Scientific | A18-4 | step 2.1.2 for cleaning and step 5.1 photoresist lift-off |
| Allegra X-22R Centrifuge | Beckman Coulter | steps 8.1.4 , 8.3.2. and 8.3.3. to spin down cells | |
| AutoCAD 2018 | Autodesk | subsection 1.1. to design transparency masks | |
| Buffered oxide etchant 10:1 | VWR | 901621-1L | subsection 3.1 for HF etching |
| CCD Monochrome microscope camera | Hamamatsu | Orca 285 C4742-96-12G04 | step 11.2.3. for imaging |
| CMOS camera- Sensicam QE 1.4MP | PCO | subsection 9.3 part of the experimental setup | |
| Conductive Epoxy | CircuitWorks | CW2400 | subsection 7.6. for wire attachement |
| Conical Centrifuge Tubes, 15 mL | Fisher Scientific | 14-959-70C | step 8.1.4. for cell centrifuging |
| Dektak 3ST Surface Profilometer | Veeco (Sloan/Dektak) | step 2.1.15 and 5.4 for surface profilometry | |
| Disposable biopsy punch, 0.75 mm | Robbins Instruments | RBP075 | step 6.2.3 for inlet access |
| Disposable biopsy punch, 3 mm | Robbins Instruments | RBP30P | step 6.2.3 for outlet access |
| DRAQ5 | abcam | ab108410 | step 11.2.2. for live cell staining |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium | ThermoFisher Scientific | 11885084 | step 8.1.2. part of media composition |
| E3631A Bipolar Triple DC power supply | Agilent | step 9.2.1.-9.2.2.part of the experimental setup | |
| Eclipse TE2000-U Inverted Microscope | Nikon | subsection 9.3. part of the experimental setup | |
| EVG620 UV Lithography System | EVG | step 2.1.9. and 2.2.7. for UV Exposure | |
| Fetal Bovine Serum | Neuromics | FBS001 | step 8.1.2. part of media composition |
| FS20 Ultrasonic Cleaner | Fisher Scientific | subsection 5.1. for photoresist lift-off | |
| Glass Media Bottle with Cap, 100mL | Fisher Scientific | FB800100 | step 8.2.1. for buffer storage |
| Glass Media Bottle with Cap, 500mL | Fisher Scientific | FB800500 | step 8.1.2.for media storage |
| HEK-293 cell line | ATCC | CRL-1573 | subsection 8.1 for cell culturing |
| HEPES buffer solution | Sigma Aldrich | 83264-100ML-F | step 8.2.1 part of electroporation buffer composition |
| Hexamethyldisilazane | Sigma Aldrich | 379212-25ML | step 2.2.3 adhesion promoter |
| HF2LI Lock-in Amplifier | Zurich Instruments | subsection 9.2 part of the experimental setup | |
| HF2TA Current amplifier | Zurich Instruments | subsection 9.2 part of the experimental setup | |
| Isopropyl Alcohol | Fisher Scientific | A459-1 | step 2.1.2 for cleaning, step 2.1.14 for rinsing wafer following SU-8 development, and step 6.3.1 for cleaning PDMS |
| IX81 fluorescence microscope | Olympus | step 11.2.3 for imaging | |
| L-Glutamine Solution | Sigma Aldrich | G7513-20ML | step 8.1.2. part of media composition |
| M16878/1BFA 22 gauge wire | AWC | B22-1 | subsection 7.5 for device fabrication |
| Magnesium chloride | Sigma Aldrich | 208337-100G | step 8.1.2 part of electroporation buffer composition |
| MF 319 Developer | Kayaku Advanced Materials | 10018042 | step 2.2.9. photoresist developer |
| Microposit S1818 photoresist | Kayaku Advanced Materials | 1136925 | step 2.2.4 positive photoresist for electrode patterning |
| Microscope slides, 75 x 25 mm | VWR | 16004-422 | step 2.2.1 electrode soda lime glass substrate |
| Model 2350 High voltage amplifier | TEGAM | 2350 | step 9.2.5. part of the experimental setup |
| National Instruments LabVIEW | National Instruments | data acquisition | |
| Needle, 30G x 1 in | BD Scientific | 305128 | step 10.1.1. part of the system priming |
| PA90 IC OPAMP Power circuit | Digi-key | 598-1330-ND | Part of the custom circuit |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma Aldrich | P4458-20ML | step 8.1.2. part of media composition |
| Plasmid pMAX-GFP | Lonza | VCA-1003 | step 8.3.4. for intracellular delivery |
| Plastic tubing, 0.010'' x 0.030" | VWR | 89404-300 | step 10.1.2. for system priming |
| Platinum targets | Kurt J. Lesker | subsection 4.2. for physical vapor deposition | |
| Potassium chloride | Sigma Aldrich | P9333-500G | step 8.2.1. part of electroporation buffer composition |
| Pump 11 PicoPlus microfluidic syringe pump | Harvard Apparatus | MA1 70-2213 | step 10.1.4. for system priming |
| PVD75 Physical vapor deposition system | Kurt J. Lesker | subsection 4.1. for physical vapor deposition | |
| PWM32 Spinner System | Headway Research | steps 2.1.6 and 2.2.2. for substrate coating with photoresist | |
| PX-250 Plasma treatment system | March Instruments | subsection 7.2 for PDMS and glass substrate bonding | |
| SDG1025 Function/Waveform generator | Siglent | step 9.2.2. part of the experimental setup | |
| Sodium hydroxide | Sigma Aldrich | S8045-500G | step 8.2.1. part of electroporation buffer composition |
| SU-8 2010 negative photoresist | Kayaku Advanced Materials | Y111053 | step 2.1.7. for microfluidic channel patterning |
| SU-8 developer | Microchem | Y010200 | step 2.1.12. for photoresist developing |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S7903-1KG | step 8.2.1. part of electroporation buffer composition |
| Sylgard 184 elastomer kit | Dow Corning | 3097358-1004 | step 6.2.1 10 : 1 mixture of PDMS polymer and hardening agent |
| Syringe, 1 ml | BD Scientific | 309628 | step 8.3.4. part of system priming |
| SZ61 Stereomicroscope System | Olympus | subsection 7.3. for channel and electrode alignment | |
| Tissue Culture Treated T25 Flasks | Falcon | 353108 | step 8.1.2 for cell culturing |
| Titanium targets | Kurt J. Lesker | subsection 4.2. for physical vapor deposition | |
| Transparency masks | CAD/ART Services | steps 2.1.9. and 2.2.7. for photolithography | |
| Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane | Sigma Aldrich | 448931-10G | step 6.1.2. for wafer silanization |
| Trypsin-EDTA solution | Sigma Aldrich | T4049-100ML | steps 8.1.3. and 8.3.1. for cell harvesting |
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