Isolierung von Epithelzellen aus dem menschlichen Zahnfollikel

Summary

Der Dentalfollikel enthält eine Epithelpopulation und mesenchymale Zellen. Die Epithelpopulation wurde aus der heterogenen Dentalfollikelzellpopulation ausgewählt, indem ein bestimmtes Kulturmedium bereitgestellt wurde. Epithelzellen überlebten und bildeten Kolonien in einem serumfreien Medium.

Abstract

Der Zahnfollikel (DF) wurde bei der Entfernung eines betroffenen dritten Backenzahns durch einen Mund-, Kiefer- und Gesichtschirurgen geerntet. Die Isolierung der Epithelzellen wurde am Tag der DF-Ernte durchgeführt. Das DF wurde dreimal mit DPBS gewaschen und dann mit einer Gewebeschere seziert, bis das Gewebe eine breiige oder matschige Konsistenz aufwies. Einzelzellpopulationen wurden durch Zentrifugation pelletiert und mit keratinozyten-serumfreiem Medium gewaschen. Heterogene Zellpopulationen wurden in einer Kulturschale verteilt. Keratinozyten-serumfreies Medium wurde verwendet, um die Epithelzellen auszuwählen. Das Kulturmedium wurde täglich gewechselt, bis keine schwimmenden Trümmer oder toten Zellen mehr beobachtet wurden. Epithelzellen erschienen innerhalb von 7-10 Tagen nach der Zellpopulationsverteilung. Epithelzellen überlebten in serumfreiem Medium, während α minimales essentielles Medium mit minimaler Modifikation, ergänzt mit 10% fetalem Rinderserum, die Proliferation von mesenchymalen Zellen ermöglichte. Das DF ist eine Gewebequelle zur Isolierung von Zahnepithelzellen.

Der Zweck dieser Studie war es, eine Methode zur Isolierung von Epithelzellen aus menschlicher DF zu etablieren. Das Parodontalband (PDL) wurde zur Isolierung menschlicher Zahnepithelzellen verwendet. Die Beschaffung von Epithelzellen aus menschlicher PDL ist aufgrund des geringen Gewebevolumens nicht immer erfolgreich, was zu einer geringen Anzahl von Epithelzellen führt. DF hat ein größeres Volumen als PDL und enthält mehr Zellen. DF kann eine Gewebequelle für die Primärkultur menschlicher Zahnepithelzellen sein. Dieses Protokoll ist einfacher und effizienter als die Isolationsmethode mit PDL. Die Beschaffung menschlicher Zahnepithelzellen kann weitere Studien zu zahnärztlichen epithelial-mesenchymalen Wechselwirkungen erleichtern.

Introduction

Die Zahnbildung beginnt mit der Invagination des oralen ^Epithels1. Je nach Entwicklungsstadium des Zahns hat das orale Epithel verschiedene Namen, einschließlich des inneren und äußeren Schmelzepithels, der zervikalen Schleife und der Hertwig-Epithelwurzelscheide (HERS). Die Epithelkompartimente kommunizieren mit den umgebenden mesenchymalen Zellen. Epithelial-mesenchymale Wechselwirkungen regulieren die Zahnbildung und Geweberegeneration. Die Beschaffung von zahnärztlichen Epithelzellen wie oralen Keratinozyten und Hertwigs epithelialen Wurzelscheidenzellen (HERSCs) ist entscheidend für die Untersuchung von zahnärztlichen epithelial-mesenchymalen ^{Interaktionen2}.

Nagetier-abgeleitete dentale Epithelzellen werden aus der Epithelstruktur isoliert, wie z.B. dem HERS. Li und Kollegen isolierten und immortalisierten herSCs aus Rattenmolaren, nachdem sie den apikalen Teil der sich entwickelnden Zahnkeime von 8 Tage alten Ratten geerntet ^hatten3. Das HERS wurde unter Vergrößerung vom apikalen Gewebe getrennt. In Anbetracht des Entwicklungsstadiums und des Alters des Zahnes ist die Ernte des HERS vom Menschen aus ethischen Gründen fast unmöglich: Ein sich entwickelnder Zahnkeim muss von einem kleinen Kind entfernt werden, um das menschliche HERS zu ernten. Unreife Zahnkeime werden selten extrahiert. Menschliche Zahnepithelzellen können aus der Gingiva und dem Parodontalband (PDL) isoliert werden. Epithelstruktur-abgeleitete Zellen sind zusammen mit mesenchymalen Komponenten an der Zahnbildung beteiligt und könnten für die Untersuchung von zahnärztlichen epithelial-mesenchymalen Interaktionen besser geeignet sein als orale Keratinozyten. Epithelzellreste von Malassez (ERM) sind HERS-abgeleitete Epithelreste und befinden sich in geringer Anzahl im ^PDL4. Studien berichten über die Isolierung menschlicher HERSCs von ^PDL5. Die Entnahme menschlicher HERSCs aus PDL-Gewebe ist jedoch aufgrund der Knappheit der Epithelpopulation an diesem Ort nicht immer ^{erfolgreich5,6}.

Obwohl aus Nagetieren gewonnene HERSCs in serumhaltigen Medien gehalten ^werden3,7, werden humane DF-abgeleitete Epithelzellen mit serumfreien Medien kultiviert, die anderen menschlichen Epithelzellen ähneln, wie normale menschliche epidermale Keratinozyten und normale menschliche orale Keratinozyten8,9. Dies impliziert physiologische oder funktionelle Unterschiede zwischen Nagetier-Dentalepithelzellen und menschlichen Zahnepithelzellen. Das Verständnis des Mechanismus in Bezug auf zahnärztliche epithelial-mesenchymale Wechselwirkungen könnte zur Entwicklung klinischer Anwendungen beitragen, einschließlich parodontaler Wiederanlagerung während der Replantation, parodontaler Regeneration bei Parodontitis, Pulpa-Dentin-Komplex-Regeneration und Biozahnerzeugung. In Anbetracht der Merkmale der translationalen Forschung können menschliche Zahnepithelzellen für die Untersuchung von epithelial-mesenchymalen Interaktionen besser geeignet sein als Nagetier-Dentalepithelzellen.

Das menschliche DF ist ein lockeres Bindegewebe und befindet sich oft in einem impaktierten Zahn. Das DF enthält mesenchymale ^Vorläufer10. Unseres Wissens hat jedoch keine Studie über die Isolierung von Epithelzellen aus Zahnfollikeln vor 2021 berichtet. Oh und Yi berichteten über die Isolierung von Epithelzellen aus menschlichen DF im Jahr 2028. Der epitheliale Phänotyp wurde durch Western Blotting und morphologische Analyse bestätigt. Die Analyse des Ursprungs von DF-abgeleiteten Epithelzellen zeigte ähnliche Ergebnisse wie andere Studien. DF-abgeleitete Epithelzellen waren weder endothel- noch hämatopoetisch5,11, und Oh und Yi schlugen vor, diese Zellen als DF-HERSCs zu benennen. Das DF hat ein größeres Volumen als das PDL, und mehr Epithelzellen können aus dem DF isoliert werden. Dies verstärkt die Entstehung von Epithelkolonien und führt zu einer hohen Erfolgsrate bei der Gewinnung von Epithelzellen aus DF. Diese Studie schlägt vor, die DF als Gewebequelle für die Isolierung von Zahnepithelzellen zu verwenden.

In der vorliegenden Studie wurden einzelne Zellen aus dem DF nach zuvor beschriebenen Verfahren ^{isoliert10,12}. Das DF enthält heterogene Zellpopulationen, und mehrere Zelltypen könnten im frühen Stadium des Verfahrens vorhanden sein. Morsczek und Kollegen isolierten DF-abgeleitete mesenchymale ^{Stammzellen10}. Wir stellten die Hypothese auf, dass das DF Epithelzellen enthält und dass nur Epithelzellen unter serumfreien Bedingungen überleben können. Diese Studie unterscheidet sich von der von Morsczek et al. hinsichtlich der Selektion der Epithelpopulation und der Hemmung mesenchymaler Zellen. Die Selektion erfolgte unter Verwendung keratinocyte serum-free media (SFM), die die Proliferation von Epithelzellen ermöglichen und die mesenchymale Zellproliferation hemmen. Diese Studie entstand aus einem Bericht von Oh und ^Yi8. Ziel dieser Studie war es, Details der in diesem Bericht verwendeten Methode zur Isolierung von Epithelzellen aus menschlicher DF zu beschreiben.

Protocol

Diese Studie wurde vom Institutional Review Board des Kyung Hee University Hospital in Gangdong (IRB-Zulassung Nr. KHNMC 2017-06-009). 1. DF sammeln HINWEIS: Die Patienten gaben vor der Operation die Einverständniserklärung für die Entfernung eines reifen oder unreifen betroffenen dritten Backenzahns. Patienten mit der folgenden Erkrankung wurden ausgeschlossen: Diabetes, Bluthochdruck, Tuberkulose, Hepatitis, erworbenes Immunschwächesyndrom. Schw…

Representative Results

DF-ErnteDie Operation wurde von einem Mund-, Kiefer- und Gesichtschirurgen durchgeführt. Menschliche Materialien, einschließlich des Zahnfragments, des Zahnfleischgewebes und der DF, wurden von einem Chirurgen gesammelt (Abbildung 1A). Der DF könnte am Zahnfragment befestigt sein. Ein Mund-, Kiefer- und Gesichtschirurg wird in der Lage sein, die DF zu identifizieren. Die Zusammenarbeit und Kommunikation mit dem Chirurgen sind für die Gewebeentnahme erforderlich. Das …

Discussion

Dieses Protokoll enthält kritische Schritte. Die Entnahme von Einzelzellpopulationen ist für die erfolgreiche Isolierung von Epithelzellen aus DF unerlässlich. Wir versuchten, Epithelzellen aus dem DF zu isolieren, basierend auf unserer Hypothese, dass es mehr Epithelzellen im DF gibt. Das Zerkleinerungsverfahren verbessert die Ablösung und Freisetzung von Zellen aus dem DF. Das Zerkleinerungsverfahren wurde verbessert und das Zerkleinern wurde wiederholt, bis das DF breiig erschien, um die Freisetzung einzelner Zell…

Materials

EMSURE ACS,ISO,Reag. Ph Eur 2-Propanol	EMD millipore Co., MA, USA	1096341011	1 L
0.05% trypsin-EDTA	Gibco, Grand island, NY, USA	25300054	100 mL
40 μm cell strainer	Falcon, NC, USA	352340
Cell culture dish (100 x 20 mm)	Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, USA	172958	Discontinued
Cell culture dish (60 x 15 mm)	Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, USA	150326
Collagenase type 1	Gibco, Grand island, NY, USA	17100017	1 g
Combi-514R / Refrigerated large capacity centrifuge	Hanil science industrial Co., LTD., Daejeon, South Korea	CB-514R
Conical tube	SPL Life Sciences Co., Ltd., Gyeonggi-do, South Korea	50015 50050	15 mL 50 mL
Cryogenic vial	Corning Inc., NY, US	430488	2 mL
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich, Missouri, US	D2650-100ml	100 mL
Dispase	Gibco, Grand island, NY, USA	17105041	1 g
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline	Welgene Inc., Gyengsangbuk-do, South Korea	LB 001-02	500 mL
Fetal bovine serum	Gibco, Grand island, NY, USA	16000044	500 mL
Heraeus BB 15 / CO2 incubator	Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, USA	51023121
Keratinocyte serum-free medium	Gibco, Grand island, NY, USA	10724-011	500 mL
MVE CryoSystem 2000	MVE Biological Solutions Co., GA, USA	CryoSystem 2000
Nalgene Mr. Frosty Freezing Container	Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, USA	5100-0001	for 1.2-2 mL CryoVials
Olympus CKX41 / Inverted cell culture microscope	Olympus Life Science, Waltham, Massachusetts	22-00723-01	Discontinued
Penicillin-Streptomycin Strep	Gibco, Grand island, NY, USA	15140122	100 mL (10,000 U/mL)
Pipet aid XP	Drummond scientific Co., PA, USA	HDR-4-000-201
Pipetman Classic P1000	Gilson, Villiers le Bel, France	F123602	100-1000 µL
Refrigerant	Nihon freezer Co. Ltd., Tokyo, Japan	CLN 540U	~-80 °C / Discontinued
Serological pipet	SPL Life Sciences Co., Ltd., Gyeonggi-do, South Korea	91010	10ml
TrypLE Express Enzyme (1x), phenol red	Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, USA	12605010	cell dissociation protease