ヒト歯包からの上皮細胞の分離
Summary
歯包は上皮集団および間葉細胞を含んでいる。上皮集団は、異なる培養培地を提供することにより異種の歯包細胞集団から選択した。上皮細胞は生き残り、無血清培地でコロニーを形成した。
Abstract
歯包(DF)は、口腔顎顔面外科医によって影響を受けた第3の臼歯の除去中に収穫された。上皮細胞分離はDF収穫の日に行った。DFをDPBSで3回洗浄し、組織がパルピーまたはスクイーズの一貫性を持つまで組織はさみで解剖した。単細胞集団は遠心分離によってペレット化し、ケラチノサイトを無血清培地で洗浄した。異種細胞集団は培養皿に分布した。ケラチノサイトは、上皮細胞を選択するために無血清培地を用いた。浮遊した破片または死細胞が観察されないまで、培養培地を毎日交換した。上皮細胞は、細胞集団分布後7〜10日以内に出現した。上皮細胞は無血清培地で生存し、α修飾最小必須培地は10%の胎児ウシ血清を添加し、間葉型細胞の増殖を可能にした。DFは、歯科上皮細胞の単離のための組織源である。
本研究の目的は、ヒトDFから上皮細胞を単離する方法を確立することであった。歯周靭帯(PDL)は、ヒトの歯の上皮細胞の単離に使用された。ヒトPDLから上皮細胞を調達することは、組織容積が小さいために必ずしも成功するとは限らず、低い数の上皮細胞を引き起こしうる。DF は PDL よりも大きなボリュームを持ち、セルが多い。DFは、ヒトの歯科上皮細胞の一次培養のための組織源であり得る。このプロトコルは、PDL を使用した分離方法よりも簡単かつ効率的です。ヒトの歯科上皮細胞を調達することは、歯科上皮間葉間葉相互作用のさらなる研究を促進するかもしれない。
Introduction
歯の形成は、口腔上皮1の開始。歯の発達段階によると、口腔上皮は、内および外側のエナメル質上皮、子宮頸管ループ、およびハートウィグの上皮根鞘(HERS)を含む異なる名前を有する。上皮コンパートメントは、周囲の間葉細胞と通信します。上皮間葉間葉間質相互作用は、歯の形成と組織再生を調節する。口腔角化細胞やヘルトウィグの上皮根鞘細胞(HERSC)などの歯科上皮細胞の調達は、歯科上皮間葉間葉相互作用の研究に不可欠です2。
げっ歯類由来の歯科上皮細胞は、HERSのような上皮構造から分離される。Liたちは、8日前齢のラットから発達中の歯の細菌の頭蓋部分を収穫した後、ラット臼歯由来HERSCを単離し、不死化した。HERSは、拡大の下で円端組織から分離された。歯の発達段階と年齢を考えると、人間からHERSを収穫することは倫理的な問題のためにほとんど不可能です:発達中の歯の胚芽は、人間のHERSを収穫するために幼い子供から取り除く必要があります。未熟な歯の細菌はめったに抽出されません。ヒトの歯の上皮細胞は、歯肉および歯周靭帯(PDL)から単離することができる。上皮構造由来細胞は間葉系成分と共に歯形成に関与し、口腔角化細胞よりも上皮間葉間葉系の歯の研究に適している可能性がある。マラセゼス(ERM)の上皮細胞残りはHERS由来の上皮残骸であり、PDL4に少数で存在する。研究は、PDL5からのヒトHERSCの分離を報告します。しかし、PDL組織からヒトHERSCを採取することは、この場所の上皮集団の不足のために必ずしも成功するとは限らない5,6。
齧歯類由来HERSCは血清含有培地3,7に維持されるが、ヒトDF由来上皮細胞は、正常ヒト表皮角化細胞および正常ヒト経口角化細胞などの他のヒト上皮細胞と同様の無血清培地で培養される8,9。これは、げっ歯類の歯科上皮細胞とヒトの歯科上皮細胞との間の生理学的または機能的な違いを意味する。歯の上皮間葉間質相互作用に関するメカニズムを理解することは、再植え付け時の歯周再付着、歯周病における歯周再生、パルプ-デンチン複合体再生、およびバイオトゥース生成を含む臨床応用の発展に寄与する可能性がある。翻訳研究の特徴を考慮すると、ヒトの歯科上皮細胞は、上皮間葉間葉相互作用の研究にげっ歯類の歯科上皮細胞よりも適切である可能性があります。
ヒトDFは緩い結合組織であり、しばしば影響を受けた歯に存在する。DFには間葉前駆体10が含まれています。しかし、我々の知る限りでは、2021年以前に上皮細胞が歯嚢から単離されたことは報告されていない。OhとYiは、20218年にヒトDFからの上皮細胞の単離を報告した。上皮表現型は、ウェスタンブロッティングおよび形態解析によって確認された。DF由来上皮細胞の起源の分析は、他の研究と同様の結果を示した。DF由来の上皮細胞は内皮性も造血細胞でもない5,11個であり、OhとYiはこれらの細胞をDF-HERSCと命名することを提案した。DFはPDLよりも大きな体積を有し、より多くの上皮細胞をDFから単離することができる。これは上皮コロニーの出現を増強し、DFから上皮細胞を収穫する際に高い成功率をもたらす。この研究は、歯科上皮細胞の単離のための組織源としてDFを使用することを示唆している。
本研究では、先に説明した手順10,12に従って単一細胞をDFから単離した。DFには異種細胞集団が含まれ、いくつかの細胞型が手順の初期段階に存在する可能性がある。Morsczekたちは、DF由来間葉系幹細胞10を単離した。我々は、DFには上皮細胞が含まれ、上皮細胞だけが無血清状態で生き残ることができると仮定した。この研究は、上皮集団の選択と間葉系細胞の阻害の点でモルシェクらとは異なる。この選択は、上皮細胞増殖を可能にし、間葉系細胞増殖を阻害するケラチノサイト無血清培地(SFM)を用いて行った。この研究は、OhとYi8のレポートに由来します。本研究の目的は、ヒトDFからの上皮細胞の単離に関する報告書で用いる方法の詳細を説明することであった。
Protocol
Representative Results
Discussion
このプロトコルには、重要な手順が含まれています。単一細胞集団の収穫は、DFからの上皮細胞の正常な分離のために不可欠である。我々は、DFに上皮細胞が多いという仮説に基づいて、DFから上皮細胞を単離しようとした。切り取り手順は、DFからの細胞の剥離および放出を増強する。このミンチの手順が改善され、単一細胞の放出を容易にするためにDFがパルピーが現れるまで繰り返した。…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、韓国政府が資金を提供する韓国国立研究財団(NRF-2017R1C1B2008406およびNRF-2021R1F1F1A1064350)からの助成金によって支えられました。ヒーヨン・ペ博士は親切に一次文化のためにDFを提供しました。
Materials
| EMSURE ACS,ISO,Reag. Ph Eur 2-Propanol | EMD millipore Co., MA, USA | 1096341011 | 1 L |
| 0.05% trypsin-EDTA | Gibco, Grand island, NY, USA | 25300054 | 100 mL |
| 40 μm cell strainer | Falcon, NC, USA | 352340 | |
| Cell culture dish (100 x 20 mm) | Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, USA | 172958 | Discontinued |
| Cell culture dish (60 x 15 mm) | Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, USA | 150326 | |
| Collagenase type 1 | Gibco, Grand island, NY, USA | 17100017 | 1 g |
| Combi-514R / Refrigerated large capacity centrifuge | Hanil science industrial Co., LTD., Daejeon, South Korea | CB-514R | |
| Conical tube | SPL Life Sciences Co., Ltd., Gyeonggi-do, South Korea | 50015 50050 |
15 mL 50 mL |
| Cryogenic vial | Corning Inc., NY, US | 430488 | 2 mL |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich, Missouri, US | D2650-100ml | 100 mL |
| Dispase | Gibco, Grand island, NY, USA | 17105041 | 1 g |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline | Welgene Inc., Gyengsangbuk-do, South Korea | LB 001-02 | 500 mL |
| Fetal bovine serum | Gibco, Grand island, NY, USA | 16000044 | 500 mL |
| Heraeus BB 15 / CO2 incubator | Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, USA | 51023121 | |
| Keratinocyte serum-free medium | Gibco, Grand island, NY, USA | 10724-011 | 500 mL |
| MVE CryoSystem 2000 | MVE Biological Solutions Co., GA, USA | CryoSystem 2000 | |
| Nalgene Mr. Frosty Freezing Container | Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, USA | 5100-0001 | for 1.2-2 mL CryoVials |
| Olympus CKX41 / Inverted cell culture microscope | Olympus Life Science, Waltham, Massachusetts |
22-00723-01 | Discontinued |
| Penicillin-Streptomycin Strep | Gibco, Grand island, NY, USA | 15140122 | 100 mL (10,000 U/mL) |
| Pipet aid XP | Drummond scientific Co., PA, USA | HDR-4-000-201 | |
| Pipetman Classic P1000 | Gilson, Villiers le Bel, France | F123602 | 100-1000 µL |
| Refrigerant | Nihon freezer Co. Ltd., Tokyo, Japan | CLN 540U | ~-80 °C / Discontinued |
| Serological pipet | SPL Life Sciences Co., Ltd., Gyeonggi-do, South Korea | 91010 | 10ml |
| TrypLE Express Enzyme (1x), phenol red | Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, USA | 12605010 | cell dissociation protease |
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