Aislamiento de células epiteliales del folículo dental humano
Summary
El folículo dental contiene una población epitelial y células mesenquimales. La población epitelial se seleccionó de la población heterogénea de células del folículo dental proporcionando un medio de cultivo distinto. Las células epiteliales sobrevivieron y formaron colonias en un medio libre de suero.
Abstract
El folículo dental (DF) fue cosechado durante la extracción de un tercer molar impactado por un cirujano maxilofacial oral. El aislamiento epitelial de células se realizó el día de la cosecha de DF. El DF se lavó tres veces con DPBS y luego se diseccionó con tijeras de tejido hasta que el tejido tuvo una consistencia pulposa o blanda. Las poblaciones unicelulares se granularon por centrifugación y se lavaron con medio libre de suero de queratinocitos. Las poblaciones celulares heterogéneas se distribuyeron en un plato de cultivo. Se utilizó un medio libre de suero de queratinocitos para seleccionar las células epiteliales. El medio de cultivo se cambiaba diariamente hasta que no se observaban restos flotantes ni células muertas. Las células epiteliales aparecieron dentro de los 7-10 días posteriores a la distribución de la población celular. Las células epiteliales sobrevivieron en medio libre de suero, mientras que el medio esencial mínimo de modificación α suplementado con un 10% de suero bovino fetal permitió la proliferación de células de tipo mesenquimal. El DF es una fuente de tejido para el aislamiento de las células epiteliales dentales.
El propósito de este estudio fue establecer un método para el aislamiento de células epiteliales de DF humana. El ligamento periodontal (PDL) se utilizó para el aislamiento de las células epiteliales dentales humanas. La obtención de células epiteliales de PDL humano no siempre es exitosa debido al pequeño volumen de tejido, lo que lleva a un bajo número de células epiteliales. DF tiene un volumen mayor que PDL y contiene más células. La DF puede ser una fuente de tejido para el cultivo primario de células epiteliales dentales humanas. Este protocolo es más fácil y eficiente que el método de aislamiento que utiliza PDL. La obtención de células epiteliales dentales humanas puede facilitar estudios adicionales de las interacciones epiteliales-mesenquimales dentales.
Introduction
La formación de los dientes comienza con la invaginación del epitelio oral1. De acuerdo con la etapa de desarrollo dental, el epitelio oral tiene diferentes nombres, incluido el epitelio del esmalte interno y externo, el asa cervical y la vaina de la raíz epitelial de Hertwig (HERS). Los compartimentos epiteliales se comunican con las células mesenquimales circundantes. Las interacciones epitelial-mesenquimal regulan la formación de dientes y la regeneración de tejidos. La obtención de células epiteliales dentales, como los queratinocitos orales y las células de la vaina de la raíz epitelial de Hertwig (HERSC), es crucial para el estudio de las interacciones epiteliales-mesenquimales dentales2.
Las células epiteliales dentales derivadas de roedores se aíslan de la estructura epitelial, como el HERS. Li y sus colegas aislaron e inmortalizaron HERSC derivadas de molares de rata después de cosechar la porción apical de los gérmenes dentales en desarrollo de ratas de 8 días de edad3. El HERS se separó del tejido apical bajo aumento. Teniendo en cuenta la etapa de desarrollo del diente y la edad, la recolección del HERS de los humanos es casi imposible debido a cuestiones éticas: un germen dental en desarrollo debe eliminarse de un niño pequeño para cosechar el HERS humano. Los gérmenes dentales inmaduros rara vez se extraen. Las células epiteliales dentales humanas se pueden aislar de la encía y el ligamento periodontal (PDL). Las células derivadas de la estructura epitelial participan en la formación de dientes junto con los componentes mesenquimales y podrían ser más adecuadas para el estudio de las interacciones epiteliales-mesenquimales dentales que los queratinocitos orales. Los restos de células epiteliales de Malassez (ERM) son restos epiteliales derivados de HERS y residen en pequeñas cantidades en el PDL4. Los estudios informan el aislamiento de herscs humanos de PDL5. Sin embargo, la recolección de HERSC humanos a partir de tejido PDL no siempre es exitosa debido a la escasez de la población epitelial en esta ubicación5,6.
Aunque las HERSC derivadas de roedores se mantienen en medios que contienen suero3,7, las células epiteliales humanas derivadas de DF se cultivan con medios libres de suero similares a otras células epiteliales humanas, como los queratinocitos epidérmicos humanos normales y los queratinocitos orales humanos normales8,9. Esto implica diferencias fisiológicas o funcionales entre las células epiteliales dentales de roedores y las células epiteliales dentales humanas. Comprender el mecanismo con respecto a las interacciones epiteliales-mesenquimales dentales podría contribuir al desarrollo de aplicaciones clínicas, incluida la reinserción periodontal durante la replantación, la regeneración periodontal en la enfermedad periodontal, la regeneración del complejo pulpar-dentina y la generación de biontina. Teniendo en cuenta las características de la investigación traslacional, las células epiteliales dentales humanas pueden ser más apropiadas que las células epiteliales dentales de roedores para el estudio de las interacciones epiteliales-mesenquimales.
El DF humano es un tejido conectivo suelto y a menudo reside en un diente impactado. El DF contiene precursores mesenquimales10. Sin embargo, hasta donde sabemos, ningún estudio ha informado del aislamiento de las células epiteliales de los folículos dentales antes de 2021. Oh y Yi informaron el aislamiento de células epiteliales de DF humana en 20218. El fenotipo epitelial fue confirmado por western blotting y análisis morfológico. El análisis del origen de las células epiteliales derivadas de DF demostró resultados similares con otros estudios. Las células epiteliales derivadas de DF no eran ni endoteliales ni hematopoyéticas5,11, y Oh y Yi sugirieron nombrar a estas células como DF-HERSC. El DF tiene un volumen mayor que el PDL, y se pueden aislar más células epiteliales del DF. Esto mejora la aparición de colonias epiteliales y da como resultado una alta tasa de éxito en la recolección de células epiteliales de DF. Este estudio sugiere utilizar el DF como fuente de tejido para el aislamiento de las células epiteliales dentales.
En el presente estudio, se aislaron células individuales del DF según procedimientos previamente descritos10,12. El DF contiene poblaciones celulares heterogéneas, y varios tipos de células podrían estar presentes en la etapa temprana del procedimiento. Morsczek y sus colegas aislaron células madre mesenquimales derivadas de DF10. Planteamos la hipótesis de que el DF contiene células epiteliales y que solo las células epiteliales pueden sobrevivir en condiciones libres de suero. Este estudio difiere del de Morsczek et al. en cuanto a la selección de la población epitelial y la inhibición de las células mesenquimales. La selección se realizó utilizando medios libres de suero de queratinocitos (SFM), que permiten la proliferación de células epiteliales e inhiben la proliferación de células mesenquimales. Este estudio se originó a partir de un informe de Oh y Yi8. El objetivo de este estudio fue describir los detalles del método utilizado en ese informe para el aislamiento de células epiteliales de la DF humana.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo incluye pasos críticos. La recolección de poblaciones unicelulares es esencial para el aislamiento exitoso de las células epiteliales de la DF. Buscamos aislar las células epiteliales del DF basándonos en nuestra hipótesis de que hay más células epiteliales en el DF. El procedimiento de picado mejora el desprendimiento y la liberación de células del DF. Se mejoró el procedimiento de picado y se repitió el picado hasta que el DF apareció pulposo para facilitar la liberación de células individ…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este estudio fue apoyado por subvenciones de la Fundación Nacional de Investigación de Corea (NRF) financiadas por el gobierno coreano (NRF-2017R1C1B2008406 y NRF-2021R1F1A1064350). El Dr. Hee-Yeon Bae amablemente proporcionó el DF para el cultivo primario.
Materials
| EMSURE ACS,ISO,Reag. Ph Eur 2-Propanol | EMD millipore Co., MA, USA | 1096341011 | 1 L |
| 0.05% trypsin-EDTA | Gibco, Grand island, NY, USA | 25300054 | 100 mL |
| 40 μm cell strainer | Falcon, NC, USA | 352340 | |
| Cell culture dish (100 x 20 mm) | Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, USA | 172958 | Discontinued |
| Cell culture dish (60 x 15 mm) | Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, USA | 150326 | |
| Collagenase type 1 | Gibco, Grand island, NY, USA | 17100017 | 1 g |
| Combi-514R / Refrigerated large capacity centrifuge | Hanil science industrial Co., LTD., Daejeon, South Korea | CB-514R | |
| Conical tube | SPL Life Sciences Co., Ltd., Gyeonggi-do, South Korea | 50015 50050 |
15 mL 50 mL |
| Cryogenic vial | Corning Inc., NY, US | 430488 | 2 mL |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich, Missouri, US | D2650-100ml | 100 mL |
| Dispase | Gibco, Grand island, NY, USA | 17105041 | 1 g |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline | Welgene Inc., Gyengsangbuk-do, South Korea | LB 001-02 | 500 mL |
| Fetal bovine serum | Gibco, Grand island, NY, USA | 16000044 | 500 mL |
| Heraeus BB 15 / CO2 incubator | Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, USA | 51023121 | |
| Keratinocyte serum-free medium | Gibco, Grand island, NY, USA | 10724-011 | 500 mL |
| MVE CryoSystem 2000 | MVE Biological Solutions Co., GA, USA | CryoSystem 2000 | |
| Nalgene Mr. Frosty Freezing Container | Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, USA | 5100-0001 | for 1.2-2 mL CryoVials |
| Olympus CKX41 / Inverted cell culture microscope | Olympus Life Science, Waltham, Massachusetts |
22-00723-01 | Discontinued |
| Penicillin-Streptomycin Strep | Gibco, Grand island, NY, USA | 15140122 | 100 mL (10,000 U/mL) |
| Pipet aid XP | Drummond scientific Co., PA, USA | HDR-4-000-201 | |
| Pipetman Classic P1000 | Gilson, Villiers le Bel, France | F123602 | 100-1000 µL |
| Refrigerant | Nihon freezer Co. Ltd., Tokyo, Japan | CLN 540U | ~-80 °C / Discontinued |
| Serological pipet | SPL Life Sciences Co., Ltd., Gyeonggi-do, South Korea | 91010 | 10ml |
| TrypLE Express Enzyme (1x), phenol red | Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, USA | 12605010 | cell dissociation protease |
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