一种用于测量细胞手性的微图案化检测
Summary
我们提出了一种使用微图案化技术 在体外测定多细胞手性的方案。该测定允许自动定量各种类型细胞的左右偏倚，并可用于筛选目的。
Abstract
手性是一种固有的细胞特性，它描绘了沿着细胞左右轴极化的不对称性。由于这种独特的性质由于其在发育和疾病中的重要作用而受到越来越多的关注，因此用于表征细胞手性的标准化定量方法将推进研究和潜在应用。在该协议中，我们描述了一种利用微图案化细胞阵列的多细胞手性表征测定。蜂窝微图案通过微接触印刷在钛/镀金的载玻片上制造。在几何定义的（例如，环形的），蛋白质包被的岛屿上接种后，细胞定向迁移并形成朝时针或逆时针方向的偏倚对齐，这可以通过定制编写的MATLAB程序自动分析和量化。在这里，我们详细描述了微图案底物的制造，细胞接种，图像收集和数据分析，并显示了使用NIH / 3T3细胞获得的代表性结果。该方案先前已在多个已发表的研究中得到验证，是 体外研究细胞手性的高效可靠工具。
Introduction
细胞的左右（LR）不对称性，也称为细胞手性或手性，描述了LR轴上的细胞极性，并且被认为是基本的，保守的生物物理性质1，2，3，4，5。在体内和体外以多种尺度观察到细胞手性。先前的研究结果揭示了接种在圆形岛屿6上的单细胞中肌动蛋白细胞骨架的手性旋转，在受限边界7，8，9，10，11内细胞的偏向迁移和排列，以及鸡热管12的不对称循环。
在多细胞水平上，细胞手性可以通过定向迁移或排列，细胞旋转，细胞骨架动力学和细胞器定位7，8，9，10，11，12，13来确定。我们已经建立了一种基于微图案化的14测定法，以有效地表征贴壁细胞7，8，9，10的手性偏倚。随着环形微图案几何地限制细胞簇，细胞集体表现出定向迁移和偏置对齐。开发了一个MATLAB程序，以自动检测和测量环的相差图像中的细胞对齐。局部像元对齐的方向用偏置角度进行量化，这取决于它与圆周方向的偏差。在统计分析之后，细胞的环模式被指定为逆时针（CCW）偏差或顺时针（CW）偏差。
该测定已被用于表征多种细胞表型的手性（表1），并且已发现细胞的LR不对称性具有表型特异性7，11，15。此外，对肌动蛋白动力学和形态的破坏可导致手性偏倚7，8的逆转，氧化应激也可以改变细胞手性9。由于程序的简单性和方法7，8，9，10的鲁棒性，该2D手性测定为在体外测定和研究多细胞手性提供了有效可靠的工具。
该协议的目的是演示使用这种方法来表征细胞手性。该协议描述了如何通过微接触打印技术制造图案化蜂窝阵列，并使用MATLAB程序以自动方式进行手性分析。
Protocol
Representative Results
Discussion
这里描述的环形图案化测定为定量表征多细胞手性提供了一种易于使用的工具，能够产生高度可靠和可重复的结果。快速生成相同的定义微环境和无偏倚分析，可实现大尺寸样品的自动化高通量处理。该协议讨论了环微图案的制造，细胞图案化以及偏置细胞排列和定向运动的自动分析。该方法与实时成像技术兼容，用于研究细胞运动和手性形态发生，并且可以潜在地集成到其他平面形式中，用于?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作由美国国立卫生研究院（OD / NICHD DP2HD083961和NHBLI R01HL148104）资助。Leo Q. Wan是皮尤生物医学科学学者（PEW 00026185），由皮尤慈善信托基金支持。张浩康由美国心脏协会博士前奖学金（20PRE35210243）支持。
Materials
| 200 proof ethanol | Koptec | DSP-MD-43 | |
| BZX microscope system | Keyence | BZX-600 | |
| Dulbecco's modified eagle medium (DMEM), high glucose | Gibco | 11965092 | |
| Electron beam evaporator | Temscal | BJD-1800 | Gold-titanum film coating |
| Fetal bovine serum | VWR | 89510-186 | |
| Fibronectin from bovine plasma | Sigma | F1141-5MG | |
| Glass microscope slides | VWR | 10024-048 | |
| Glass tweezers | Exelta | 390BSAPI | |
| Gold evaporation pellets | International Advanced Materials | AU18 | |
| HS-(CH2)11-EG3-OH (EG3) | Prochimia | TH 001-m11.n3-0.2 | |
| MATLAB | Mathworks | MATLAB_R2020b | |
| NIH/3T3 cells | ATCC | CRL-1658 | |
| OAI contact aligner | OAI | 200 | UV photolithography |
| Octadecanethiol (C18) | Sigma | O1858-25ML | |
| Orbital shaker | VWR | 89032-088 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Research product international | P32080-100T | |
| Polydimethylsiloxane Sylgard 184 | Dow Corning | DC4019862 | |
| Silicon Wafer | University Wafer | ID#809 | |
| Sodium pyruvate | Thermo fisher scientific | 11360-070 | |
| SU-8 3050 photoresist | MicroChem | Y311075 0500L1GL | |
| Titanium evaporation pellets | International Advanced Materials | TI14 | |
| Transparency mask (with feature) | Outputicity.com | N/A | Mask printing service |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Thermo fisher scientific | 25200-072 |
Riferimenti
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