Hücre Kiralitesini Ölçmek için Bir Mikrodesenleme Testi
Summary
Mikrodesenleme tekniğini kullanarak in vitro çok hücreli kiraliteyi belirlemek için bir protokol sunuyoruz. Bu tahlil, çeşitli hücre tiplerinin sol-sağ önyargılarının otomatik olarak ölçülmesine izin verir ve tarama amacıyla kullanılabilir.
Abstract
Kiralite, asimetriyi hücrenin sol-sağ ekseni boyunca polarizasyon açısından gösteren içsel bir hücresel özelliktir. Bu eşsiz özellik, hem gelişim hem de hastalıktaki önemli rolleri nedeniyle artan bir dikkat çektiğinden, hücre kiralitesini karakterize etmek için standartlaştırılmış bir niceleme yöntemi, araştırmayı ve potansiyel uygulamaları ilerletecektir. Bu protokolde, mikrodesenli hücre dizilerini kullanan çok hücreli bir kiralite karakterizasyon testini tanımlıyoruz. Hücresel mikro desenler, mikrokontakt baskı yoluyla titanyum / altın kaplı cam slaytlar üzerinde üretilir. Geometrik olarak tanımlanmış (örneğin, halka şeklinde), protein kaplı adalarda tohumlamadan sonra, hücreler yönlü olarak göç eder ve özel olarak yazılmış bir MATLAB programı tarafından otomatik olarak analiz edilebilen ve ölçülebilen saat yönünde veya saat yönünün tersine doğru önyargılı bir hizalama oluşturur. Burada mikro desenli substratların üretimini, hücre tohumlamasını, görüntü toplamayı ve veri analizini ayrıntılı olarak açıklıyoruz ve NIH / 3T3 hücreleri kullanılarak elde edilen temsili sonuçları gösteriyoruz. Bu protokol daha önce yayınlanmış birçok çalışmada doğrulanmıştır ve in vitro hücre kiralitesini incelemek için etkili ve güvenilir bir araçtır.
Introduction
Hücrenin sol-sağ (LR) asimetrisi, hücresel elverişlilik veya kiralite olarak da bilinir, LR eksenindeki hücre polaritesini tanımlar ve temel, korunmuş, biyofiziksel bir özellik olarak kabul edilir 1,2,3,4,5. Hücre kiralitesi hem in vivo hem de in vitro olarak çoklu ölçeklerde gözlenmiştir. Önceki bulgular, dairesel adalar 6’ya ekilen tek hücrelerde aktin sitoiskeletinin kiral dönüşünü, 7,8,9,10,11 sınırlı sınırlar içindeki hücrelerin önyargılı göçünü ve hizalanmasını ve tavuk ısı tüpünün asimetrik döngüsünü 12 ortaya koymuştur.
Çok hücreli düzeyde, hücre kiralitesi yönlü migrasyon veya hizalama, hücresel rotasyon, sitoiskelet dinamikleri ve hücre organeli konumlandırma 7,8,9,10,11,12,13 ile belirlenebilir. 7,8,9,10 yapışkan hücrelerin kiral yanlılığını etkili bir şekilde karakterize etmek için mikrosendikleme tabanlı 14 tahlil oluşturduk. Halka şeklindeki mikro desenlerin geometrik olarak hücre kümelerini sınırlamasıyla, hücreler toplu olarak yönlü göç ve önyargılı hizalama sergiler. Halkanın faz-kontrast görüntülerindeki hücre hizalamasını otomatik olarak tespit etmek ve ölçmek için bir MATLAB programı geliştirilmiştir. Yerel hücre hizalamasının yönü, çevresel yönden sapmasına bağlı olarak önyargılı bir açı ile ölçülür. İstatistiksel analizi takiben, hücrelerin halka paterni saat yönünün tersine (CCW) önyargılar veya saat yönünde (CW) önyargılar olarak belirlenir.
Bu tahlil, çoklu hücre fenotiplerinin kiralitesini karakterize etmek için kullanılmıştır (Tablo 1) ve hücrelerin LR asimetrisinin fenotipe özgü 7,11,15 olduğu bulunmuştur. Ayrıca, aktin dinamikleri ve morfolojisindeki bozulma, kiral önyargı 7,8’in tersine dönmesine neden olabilir ve oksidatif stres hücre kiralitesini de değiştirebilir9. Prosedürün basitliği ve 7,8,9,10 yaklaşımının sağlamlığı nedeniyle, bu 2D kiralite testi, in vitro çok hücreli kiraliteyi belirlemek ve incelemek için etkili ve güvenilir bir araç sağlar.
Bu protokolün amacı, hücre kiralitesini karakterize etmek için bu yöntemin kullanımını göstermektir. Bu protokol, mikrokontakt baskı tekniği ile desenli hücresel dizilerin nasıl üretileceğini ve MATLAB programını kullanarak otomatik bir şekilde kiralite analizinin nasıl yapılacağını açıklar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada açıklanan halka şeklindeki modelleme testi, çok hücreli kiralitenin kantitatif karakterizasyonu için kullanımı kolay, son derece güvenilir ve tekrarlanabilir sonuçlar üretebilen bir araç sağlar. Aynı tanımlanmış mikro ortamların hızlı bir şekilde oluşturulması ve tarafsız analiz, büyük boyutlu numunelerin otomatik olarak yüksek verimli bir şekilde işlenmesini sağlar. Bu protokol, halka mikro desenlerinin üretimini, hücre desenini ve önyargılı hücre hizalamasının ve yönlü har…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri (OD / NICHD DP2HD083961 ve NHBLI R01HL148104) tarafından finanse edilmiştir. Leo Q. Wan, Pew Charitable Trusts tarafından desteklenen Biyomedikal Bilimler alanında (PEW 00026185) bir Pew Scholar’dır. Haokang Zhang, Amerikan Kalp Derneği Doktora Öncesi Bursu (20PRE35210243) tarafından desteklenmektedir.
Materials
| 200 proof ethanol | Koptec | DSP-MD-43 | |
| BZX microscope system | Keyence | BZX-600 | |
| Dulbecco's modified eagle medium (DMEM), high glucose | Gibco | 11965092 | |
| Electron beam evaporator | Temscal | BJD-1800 | Gold-titanum film coating |
| Fetal bovine serum | VWR | 89510-186 | |
| Fibronectin from bovine plasma | Sigma | F1141-5MG | |
| Glass microscope slides | VWR | 10024-048 | |
| Glass tweezers | Exelta | 390BSAPI | |
| Gold evaporation pellets | International Advanced Materials | AU18 | |
| HS-(CH2)11-EG3-OH (EG3) | Prochimia | TH 001-m11.n3-0.2 | |
| MATLAB | Mathworks | MATLAB_R2020b | |
| NIH/3T3 cells | ATCC | CRL-1658 | |
| OAI contact aligner | OAI | 200 | UV photolithography |
| Octadecanethiol (C18) | Sigma | O1858-25ML | |
| Orbital shaker | VWR | 89032-088 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Research product international | P32080-100T | |
| Polydimethylsiloxane Sylgard 184 | Dow Corning | DC4019862 | |
| Silicon Wafer | University Wafer | ID#809 | |
| Sodium pyruvate | Thermo fisher scientific | 11360-070 | |
| SU-8 3050 photoresist | MicroChem | Y311075 0500L1GL | |
| Titanium evaporation pellets | International Advanced Materials | TI14 | |
| Transparency mask (with feature) | Outputicity.com | N/A | Mask printing service |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Thermo fisher scientific | 25200-072 |
Riferimenti
- Wan, L. Q., Chin, A. S., Worley, K. E., Ray, P. Cell chirality: emergence of asymmetry from cell culture. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 371, 20150413 (2016).
- Rahman, T., Zhang, H., Fan, J., Wan, L. Q. Cell chirality in cardiovascular development and disease. APL Bioengineering. 4 (3), (2020).
- Inaki, M., Liu, J., Matsuno, K. Cell chirality: Its origin and roles in left-right asymmetric development. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 371 (1710), 20150413 (2016).
- Utsunomiya, S., et al. Cells with broken left-right symmetry: Roles of intrinsic cell chirality in left-right asymmetric epithelial morphogenesis. Symmetry. 11 (4), 505 (2019).
- Tamada, A. Chiral neuronal motility: The missing link between molecular chirality and brain asymmetry. Symmetry. 11 (1), 102 (2019).
- Tee, Y. H., et al. Cellular chirality arising from the self-organization of the actin cytoskeleton. Nature Cell Biology. 17 (4), 445-457 (2015).
- Wan, L. Q., et al. Micropatterned mammalian cells exhibit phenotype-specific left-right asymmetry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (30), 12295-12300 (2011).
- Fan, J., et al. Cell chirality regulates intercellular junctions and endothelial permeability. Science Advances. 4 (10), 2111 (2018).
- Singh, A. V., et al. Carbon nanotube-induced loss of multicellular chirality on micropatterned substrate is mediated by oxidative stress. ACS Nano. 8 (3), 2196-2205 (2014).
- Zhang, H., Fan, J., Zhao, Z., Wang, C., Wan, L. Q. Effects of Alzheimer’s disease-related proteins on the chirality of brain endothelial cells. Cellular and Molecular Bioengineering. 14, 231-240 (2021).
- Chen, T. H., et al. Left-right symmetry breaking in tissue morphogenesis via cytoskeletal mechanics. Circulation Research. 110 (4), 551-559 (2012).
- Ray, P., et al. Intrinsic cellular chirality regulates left-right symmetry breaking during cardiac looping. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (50), 11568-11577 (2018).
- Fan, J., Zhang, H., Rahman, T., Stanton, D. N., Wan, L. Q. Cell organelle-based analysis of cell chirality. Communicative and Integrative Biology. 12 (1), 78-81 (2019).
- Chen, C. S., Mrksich, M., Huang, S., Whitesides, G. M., Ingber, D. E. Geometric control of cell life and death. Science. 276 (5317), 1425-1428 (1997).
- Liu, W., et al. Nanowire magnetoscope reveals a cellular torque with left-right bias. ACS Nano. 10 (8), 7409-7417 (2016).
- Wan, L. Q., et al. Geometric control of human stem cell morphology and differentiation. Integrative Biology. 2 (7-8), 346-353 (2010).
- Circular Statistics Toolbox. MathWorks Available from: https://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/10676-circular-statistics-toolbox-directional-statistics (2021)
- Chin, A. S., Worley, K. E., Ray, P., Kaur, G., Fan, J., Wan, L. Q. Epithelial cell chirality revealed by three-dimensional spontaneous rotation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (48), 12188-12193 (2018).
- Worley, K. E., Chin, A. S., Wan, L. Q. Lineage-specific chiral biases of human embryonic stem cells during differentiation. Stem Cells International. 2018, 1848605 (2018).
