Chemiluminescensbaserede assays til påvisning af nitrogenoxid og derivater heraf fra autoxidation og nitroserede forbindelser

Summary

Her præsenterer vi protokoller til påvisning af nitrogenoxid og dets biologisk relevante derivater ved hjælp af kemiluminescensbaserede assays med høj følsomhed.

Abstract

Nitrogenoxid (NO) aktivitet in vivo er de kombinerede resultater af dets direkte virkninger, virkningen af dets derivater genereret af NO autoxidation og virkningerne af nitroserede forbindelser. Måling af NO-metabolitter er afgørende for at studere NO-aktivitet både på vaskulære niveauer og i andre væv, især i de eksperimentelle indstillinger, hvor eksogen NO administreres. Ozonbaserede kemiluminescensassays muliggør præcise målinger af NO- og NO-metabolitter i både væsker (herunder plasma, vævshomogenater, cellekulturer) og gasblandinger (f.eks. Udåndingsåndedræt). NO reagerer med ozon for at generere nitrogendioxid i en ophidset tilstand. Den deraf følgende lysemission tillader fotosektion og generering af et elektrisk signal, der afspejler NO-indholdet i prøven. Aliquots fra den samme prøve kan bruges til at måle specifikke NO-metabolitter, såsom nitrat, nitrit, S-nitrosothioler og jern-nitrosylkomplekser. Derudover kvantificeres NO forbruges af cellefrit hæmoglobin også med kemiluminescensanalyse. En illustration af alle disse teknikker er tilvejebragt.

Introduction

Siden Salvador Moncada og nobelpristagerne Robert Furchgott, Louis Ignarro og Ferid Murad identificerede nitrogenoxid (NO) som den tidligere kendte endotelafledte afslapningsfaktor (EDRF), er NO’s centrale rolle blevet etableret i flere nøglemekanismer, der spænder over vaskulær biologi, neurovidenskab, metabolisme og værtsrespons 1,2,3,4,5,6,7 . Eksogen administration af NO-gas er blevet en etableret behandling for respirationssvigt på grund af pulmonal hypertension hos den nyfødte⁸. Nitrogenoxidgas er også blevet undersøgt til behandling af respiratorisk syncytialvirus (RSV) infektion, malaria og andre infektionssygdomme, iskæmi-reperfusionsskade og til forebyggelse af akut nyreskade hos patienter, der gennemgår hjertekirurgi 9,10,11,12. Behovet for præcise måleteknikker til vurdering af niveauerne af NO, dets metabolitter og niveauerne af dets målproteiner og forbindelser stammer fra både mekanistiske og interventionelle undersøgelser.

På grund af sin høje reaktivitet kan NO gennemgå forskellige reaktioner afhængigt af den biologiske matrix, hvori den produceres og/eller frigives. I mangel af hæmoglobin (Hb) eller andre oxy-hæmoproteiner oxideres NO næsten fuldstændigt til nitrit (_NO2^–).

2NO + O₂ → 2NO₂

NO₂ + NO → N₂O₃

_N2O3 +_H20→ NO₂^– + H⁺

NO gennemgår først autoxidation med molekylært oxygen (_O2) for at give nitrogendioxid (_NO2) og reagerer med_NO2 selv for at generere dinitrogentrioxid (_N203). Et molekyle_N203reagerer med vand (_H20) for at danne to molekyler af_NO2^– og en proton (H ⁺)¹³. Inden for fuldblod^{omdannes 14,15}, NO og NO₂^– hurtigt til nitrat (_NO3^–), da disse molekyler reagerer ivrigt med de oxiderede hæmgrupper af Hb [Hb-Fe2⁺–_O2 eller oxyhemoglobin (oxyHb)] for at give NO₃^–. Denne reaktion er kombineret med overgangen af hæmgruppen til jerntilstanden [Hb-Fe³⁺ eller methemoglobin (metHb)]:

Hb-Fe²⁺-O₂ + NO → Hb-Fe³⁺ + NO₃^–

Barrieren for røde blodlegemer (RBC) og rummet umiddelbart ved siden af endotelet er de vigtigste faktorer, der begrænser denne reaktion og tillader en lille del af NO frigivet af endotelet at fungere som EDRF^16,17. Faktisk er cellefri Hb i cirkulationen kendt for at forstyrre vasodilatation i eksperimentelle og kliniske indstillinger^17,18. Inden for RBC, afhængigt af iltning og_{NO2-koncentration}, reagerer en del af NO med deoxyhemoglobin (Hb-Fe²⁺) for at danne jern-nitrosyl Hb (Hb-Fe²⁺-NO eller HbNO):

Hb-Fe²⁺ + INGEN → Hb-Fe²⁺-NO

I RBC^15,17 kan NO₂^– danne Hb-Fe³⁺ ved at reducere Hb-Fe²⁺, hvilket fører til frigivelse af NO, hvilket igen binder Hb-Fe²⁺–_O2 (fortrinsvis) eller Hb-Fe²⁺.

Generering af NO-derivater bør ikke betragtes som strengt ensrettet, da NO kan regenereres fra NO₂^– og NO₃^– i forskellige væv og af forskellige enzymer (f.eks. af tarmbakterier eller i mitokondrier, især under hypoxiske tilstande)^19,20.

En variabel mængde NO produceret (eller administreret) fører til downstream-generering af S-nitrosothioler, hovedsagelig ved thioltransnitrosation fra_N203i nærvær af en nukleofil, der skaber et NO⁺ -donormellemprodukt (Nuc-NO⁺–_NO2^–):

N₂O₃ + RS^– → RS-NO + NO₂^–

En anden mulighed for generering af S-nitrosothioler er nitrosylering af oxiderede thioler (NO reagerer med en oxideret thiol):

RS• + INGEN → RS-NO

Denne mekanisme og direkte thioloxidation ved NO₂ kan kun være mulig under meget specifikke forhold, som er beskrevet andetsteds²¹. S-nitrosothioler spænder fra lette molekyler som S-nitrosoglutathion til store thiolholdige proteiner. S-nitrosohemoglobin (S-NO-Hb) dannes ved nitrosering af en thiolgruppe af en konserveret cysteinrest i β(β93C)²².

Generering og metabolisme af S-nitrosothioler er en del af vigtige reguleringsmekanismer. Eksempler indbefatter regulering af glutathion, caspaser, N-methyl-D-aspartat (NMDA) og ryanodinreceptorer 23,24,25,26,27,28. Nitroseret albumin (S-nitroso-albumin), der tidligere blev betragtet som en vigtig formidler af NO-biologi in vivo, synes at være en NO/NO⁺-transportør uden nogen specifik yderligere biologisk aktivitet²⁹.

Ved måling af koncentrationen af NO og dets derivater fra en specifik biologisk prøve inden for en biologisk matrix er det vigtigt at overveje egenskaber som surhedsgrad, iltning, temperatur og tilstedeværelsen af reagenser. Eksempler indbefatter administrerede eksogene NO-donorer og, i forbindelse med akut inflammation, hydrogenperoxid (_H202), der reagerer med_NO2, hvilket fører til generering af supernormal koncentration af frie radikaler som peroxynitrit (ONOO^–)²¹. Ud over den anvendte analysemetode er den præanalytiske fase af prøveforberedelse og opbevaring grundlæggende. Downstreamreaktioner, der ikke repræsenterer in vivo NO-aktiviteten, skal forudsiges, overvejes og blokeres. Et gyldigt eksempel er ustabiliteten af S-NO-Hb, der kræver en dedikeret behandling af blodprøver, når den er målrettet til måling²².

Chemiluminescensbaserede assays er guldstandarden til påvisning af niveauerne af NO og dets vigtigste metabolitter [NO₂^–, NO₃^–, S-NO- og jern-nitrosylkomplekser (Fe-NO)] i enhver biologisk væske, herunder vævshomogenater^30,31. Disse metoder er afhængige af kemiluminescensdetektoren (CLD), en enhed, der huser reaktionen af NO med ozon (_O3), hvilket genererer NO₂ i en ophidset tilstand (NO₂•). Afslapning af NO₂• forårsager emission af en foton af lys, der detekteres af et fotomultiplikatorrør, hvilket genererer et elektrisk signal, der er direkte proportionalt med NO-indholdet i den samplede gasblanding³². En forenklet skematisk oversigt over CLD er repræsenteret.

Figur 1: Forenklet skematisk for en kemiluminescensdetektor for nitrogenoxidgas. Kemiluminescensbaseret detektion af nitrogenoxid (NO) er den støkiometriske generering af en foton pr. NO-gasmolekyle, der indføres i kemiluminescensdetektoren (CLD). Kemiluminescensreaktionen opnås i et udpeget kammer forsynet med ozon (O3) fra en intern generator, som holdes ved undertryk ved forbindelse med en ekstern pumpe, hvilket muliggør kontinuerlig og konstant tilstrømning af prøvegas. Genereringen af_O3 kræver diatomisk ilt (_O2), der leveres af en dedikeret_O2-tank , der er forbundet med CLD (andre producenter leverer CLD’er, der opererer med omgivende luft). Inden for reaktionskammeret reagerer hvert molekyle af NO-gas indeholdt i den samplede gas med ilt for at give et molekyle nitrogendioxid i aktiveret tilstand (NO₂ *). Ved at vende tilbage til sin grundtilstand udsender hvert NO₂ * molekyle en foton, der detekteres af et fotomultiplikatorrør (PMT) placeret ved siden af reaktionskammeret. PMT med den tilhørende forstærker og centrale behandlingsenhed producerer et signal, der er proportionalt med fotontællingen og antallet af NO-molekyler i reaktionskammeret. Klik her for at se en større version af denne figur.

Prøveindslysningen af CLD kan tilsluttes et glasvaresystem, der indeholder et reaktionskammer til flydende prøver. Systemet renses kontinuerligt med en inert gas, såsom nitrogen, helium eller argon, der overfører NO fra reaktionskammeret til CLD. Væskefaseprøver injiceres gennem en dedikeret membran i udrensningsbeholderen.

Figur 2: Struktur af et udrensningsfartøj til kemiluminescensbaseret detektion af nitrogenoxidgas Udrensningsbeholderen (til højre) gør det muligt at detektere nitrogenoxid (NO) gas eller enhver anden forbindelse, der let kan omdannes til INGEN gas, når den frigives fra et flydende fasereagens. Det inerte gasindgang er forbundet med en kilde (tank) af en inert gas, såsom Argon, Xeon eller diatomisk nitrogen (_N2). Nåleventilen (åbner til venstre) bruges til trykregulering i udrensningsbeholderen og kan fjernes fuldstændigt for at rengøre beholderen. Injektionsporten er dækket af en hætte med en membranseptum til prøveinjektion. Membranen skal udskiftes ofte. En opvarmet jakke omgiver reaktionskammeret og er forbundet til et varmtvandsbad for at udføre VCl₃ i HCL-assay. Udrensningsbeholderudløbet er forbundet til kemiluminescensdetektoren (CLD) eller til NaOH-fælden (kræves til VCl₃ i HCl-assays). For at dræne reaktionskammerets indhold skal du først lukke stophanerne ved det inerte gasindløb og udrensningsbeholderens udløb, lukke nåleventilen, fjerne hætten ved injektionsporten og til sidst åbne stophanen ved afløbet. NaOH-fælden (til venstre) skal placeres inline mellem udrensningsbeholderen og CLD’en, hvis VCl₃ i HCl-assay udføres på grund af HCI’s ætsning. Forbindelsen til CLD kræver altid, at der placeres et intenst felt dielektrisk filter (IFD) mellem CLD og udgangen fra udrensningsbeholderen (eller NaOH-fælden, hvis den anvendes). IFD-filteret fjerner luftbårne partikler og forhindrer væske i at passere gennem udrensningsbeholderen. PTFE = polytetrafluorethylen. Klik her for at se en større version af denne figur.

Som følge heraf kan enhver forbindelse, der kan omdannes til NO gennem en specifik og kontrolleret kemisk reaktion, påvises med høj følsomhed i enhver biologisk væske og vævshomogenat²⁴. Direkte måling af gasfase NO gennem kemiluminescens udføres i både eksperimentelle og kliniske omgivelser. Disse teknikker er udførligt beskrevet andetsteds 33,34,35. Måling af NO₂^–, S-nitrosothioler, S-nitrositrerede proteiner og Fe-NO’er kan udføres ved at tilsætte prøver i en reaktionsblanding med triiodid (I₃^–), som støkiometrisk frigiver INGEN gas fra alle disse forbindelser:

I₃^– → I₂ + I^–

2NO₂⁻ +2I⁻ +4H⁺ → 2NO + I₂ +_2H2O

I₃⁻ + 2RS-NO → 3I⁻ + RSSR + 2NO⁺

2NO⁺ + 2I⁻ → 2NO + I₂

mens jeg₃^– ikke reagerer med NO ^3-15. Præcise målinger af hver forbindelse er muliggjort ved forbehandling af prøveallikvoter med syrnet sulfanilamid (AS) med eller uden mercuricchlorid (HgCl₂). Konkret fjerner forbehandling med AS alt NO ^2-indhold. Som følge heraf afspejler NO-indholdet målt ved CLD kun summen af S-NOs og Fe-NOs koncentration. Injektion af HgCl₂ i en prøveallikvote før AS-injektion medfører, at NO₂^– frigives af S-NO. Behandling med AS (hvilket fører til NO ^2-fjernelse) sikrer, at det målte NO-indhold kun afspejler koncentrationen af Fe-NO’er. En række subtraktioner mellem vurderingerne gør det muligt at beregne den nøjagtige koncentration af de tre NO-derivater²².

Figur 3: Trin i prøveforberedelse til_I3^– i eddikesyre chemiluminescensassay. De sekventielle trin til fremstilling af_I3^– i eddikesyre chemiluminescensassay er illustreret. Brug af lysbeskyttede centrifugerør er påkrævet. Rør 1, 2 og 3 er dem, der bruges til at forberede sig på analysen. En anden prøve aliquot (rør 4) er nødvendig for VCl₃ i HCI-assay, hvis måling af nitrat (NO₃^–) er påkrævet. Trin er angivet med tal med rødt. Forfyld (trin 1) som angivet med fosfatbuffer saltvand (PBS) eller_HgCl2, inden prøvevolumenet tilsættes. Tilsæt prøvevolumen (2) som angivet, hvirvel, og inkuber i 2 minutter ved stuetemperatur (RT). Tilsæt (3) PBS eller syrnet sulfanilamid (AS) som angivet, hvirvel, og inkuber i 3 minutter ved RT. Koncentrationen målt ved assay er summen af koncentrationen af de forbindelser, der er rapporteret under hvert rør. Rør nummer 1 vil tillade målinger af nitrit (NO₂^–), S-nitrosothioler (S-NO) og jern-nitrosylkomplekser (Fe-NO’er) som et enkelt signal. Ved måling af nitrat (NO₃-) skal der udtages prøver med både_I3^– i eddikesyre og_VCl3 i ^HCl-assays, og værdien fra rør 1 skal trækkes fra den, der er opnået fra rør 4. *foreslåede mængder, der skal anvendes til Hb-analyse til bestemmelse af resterende NO₂^–, S-nitrosohemoglobin og jern-nitrosyl-hæmoglobin. Klik her for at se en større version af denne figur.

Ved MÅLING NR_{. 3}^– anvendes vanadiumchlorid (III)chlorid (_VCl3) i saltsyre (HCI) til omdannelse af_NO3^– til NO i udrensningsbeholderen med henblik på at måle NO₃^– støkiometrisk med CLD:

2 NO₃^–+ 3V⁺³ + 2H20 → 2NO+ 3VO₂⁺ + 4H⁺

For at opnå en tilstrækkelig hurtig omdannelse skal reaktionen udføres ved 90-95 °C. Reduktion fra NO₃^– til NO₂^– er kombineret med reduktion af NO₂^– til NO med HCl. Vanadiummetal reducerer også S-NO’er, der frigør deres NO-moiety^22,36. Den endelige koncentration opnået ved CLD med_VCl3 i HCl afspejler den samlede koncentration af_NO3^–,_NO2 og andre nitroserede forbindelser. Subtraktion af sidstnævnte værdi fra koncentrationen opnået med CLD med I₃^– gør det muligt at beregne NO ^{3-koncentration 36,37} (figur 3).

I NO-forbrugsassayet genererer den kontinuerlige frigivelse af NO i udrensningsbeholderen af NO-donorer som (Z)-1-[2-(2-aminoethyl)-N-(2-ammonioethyl)amino]diazen-1-ium-1,2-diolat (DETA-NONOate) et stabilt signal, der gør det muligt at kvantificere cellefri oxyHb i de injicerede prøver. Mængden af NO, der forbruges i udrensningsbeholderen, er i et støkiometrisk forhold til mængden af oxyHb i prøven³⁸.

Protokoller til måling af NO₂^–, NO₃^–, S-nitrosothioler, jern-nitrosylkomplekser og INTET forbrug af cellefri Hb i plasmaprøver er illustreret. Undersøgelser af NO i RBC-miljøet kræver specifik prøvebehandling efterfulgt af udelukkelseskromatografi for at måle ekstremt skrøbelig S-NO-Hb og Hb-NO kombineret med bestemmelse af total Hb-koncentration^15,22. Prøveforberedelse er medvirkende til at korrigere målingen. Præ-eksistens af NO₂^– i_H20og frigivelse af_NO2^– under analysen kan føre til måling af kunstigt højere koncentrationer af NO-derivater såsom S-NO-Hb^14,39. Vigtige aspekter af prøveforberedelse præsenteres også.

Protocol

De procedurer, der er angivet i denne protokol, er i overensstemmelse med review board of Massachusetts General Hospital. De blodprøver, der blev brugt, var blevet indsamlet under en tidligere undersøgelse og blev afidentificeret til det nuværende formål18. BEMÆRK: Se producentens anvisninger for specifik vejledning vedrørende optimale forbindelser mellem slanger og glasvarer, der udgør udrensningsbeholderen, vask og generel vedligeholdelse. Forbindelserne skal v…

Representative Results

NO-forbruget ved cellefrit Hb-assay blev anvendt i prøver, der indeholdt kendte koncentrationer af cellefri oxyHb (figur 4). Da en hæm af oxyHb stoichiometrisk frigiver et NO-molekyle i analysen, anvendes renset cellefri oxyHb til at opbygge kalibreringskurven for assayet (supplerende figur 3). Dosis-respons-forholdet mellem cellefri Hb (målt med et kolorimetrisk assay) og INTET forbrug hos patienter, der kommer ud af kardiopulmonal bypass (CPB…

Discussion

På grund af den høje følsomhed har kemiluminescensbaserede assays til bestemmelse af NO og ^beslægtede forbindelser en høj risiko for NO 2-kontaminering. Hvert reagens (især_{NO2-blokerende} opløsning) og fortyndingsmiddel (herunder ddH₂O), der anvendes i forsøget, bør testes for dets NO ^2-indhold for at korrigere for baggrundssignal. Nitrit er ekstremt reaktivt med en halveringstid i fuldblod omkring 10 min og genererer hurtigt NO_3</s…

Materials

Acetic Acid	Sigma	45754	500 mL – liquid
Antifoam B Emulsion	Sigma	A5757	250 mL – liquid
DETA NONOate	Cayman	82120	10 mg
Gibco DPBS (1x) no calcium, no magnesium	ThermoFisher	14190144	500 mL
Hydroochloric Acid 37% (1 M)	Sigma	258148	500 mL – liquid
Iodine	SAFC	207772	100 g – solid
Kimwipes	Kimtech	34155
Mercury (II) Chloride ACS reagent> 99.5%	Sigma	215465	100 g – solid (dissolve in water)
Mili-Q Water Purification System	Millipore
Model 705 RN 50 μL syringe	Hamilton	80530	Microliter syringe
Model 802 N 25 μL Syringe	Hamilton	84854	Microliter syringe
N-ethylmaleimide	Sigma	4260	25 g – crystalline
Nitric Oxide Analyzer + Bundle Software – Purge Vessel	Zysense	NOA 280i	Chemiluminescence Detector
Nonidet p-40  (NP-40)	ThermoFisher	85125	10% – 500 mL
Potassium hexacyanoferrate (III) ACS reagent≥ 99%	Sigma	244023	100 g – powder
Potassium Iodide ACS reagent> 99%	Sigma	221945	100 g – solid
Potassium Nitrite cryst. For analysis EMSURE ACS	Supelco	105067	250 g – crystalline
PowerGen 125	Fisher Scientific	14-359-251	Mechanic Homogenizer
RV3 Two Stage Rotary Vane Pump	Edwards	A65201906	Vacuum Pump – Bundled with analyzer
Sodium Heparin – BD Hemogard Clo	BD Biosciences	BD367871	75 USP Units
Sodium hydroxide anhydrous ACS reagent ≥ 97%	Sigma	795429	1 kg – pelletts
Sodium Nitrate ACS reagent ≥ 99%	Sigma	221341	500 g – powder
Sodium nitrite ≥ 99%	Sigma	S2252	500 g – crystalline
Sulfanilamide ≥ 98%	Sigma	S9251	100 g – solid
Vanadium (III) Chloride	Sigma	112393	25 g – solid – Caution (exothermic)
Whatman 1 Filter Paper	Sigma	WHA10010155