Saggi basati sulla chemiluminescenza per la rilevazione di ossido nitrico e suoi derivati da autoxidazione e composti nitrosi

Summary

Qui presentiamo protocolli per rilevare l’ossido nitrico e i suoi derivati biologicamente rilevanti utilizzando saggi basati sulla chemiluminescenza ad alta sensibilità.

Abstract

L’attività dell’ossido nitrico (NO) in vivo è il risultato combinato dei suoi effetti diretti, dell’azione dei suoi derivati generati dall’autossidazione dell’NO e degli effetti dei composti nitrosi. La misurazione dei metaboliti no è essenziale per studiare l’attività dell’NO sia a livello vascolare che in altri tessuti, specialmente nei contesti sperimentali in cui viene somministrato NO esogeno. I saggi di chemiluminescenza a base di ozono consentono misurazioni precise dei metaboliti NO e NO sia nei fluidi (inclusi plasma, omogeneizzati tissutali, colture cellulari) che nelle miscele di gas (ad esempio, respiro espirato). L’NO reagisce con l’ozono per generare biossido di azoto allo stato eccitato. La conseguente emissione luminosa permette il fotorilevamento e la generazione di un segnale elettrico che riflette il contenuto di NO del campione. Le aliquote dello stesso campione possono essere utilizzate per misurare specifici metaboliti NO, come nitrati, nitriti, S-nitrosotioli e complessi ferro-nitrosilici. Inoltre, l’NO consumato dall’emoglobina priva di cellule viene anche quantificato con l’analisi di chemiluminescenza. Viene fornita un’illustrazione di tutte queste tecniche.

Introduction

Da quando Salvador Moncada e i premi Nobel Robert Furchgott, Louis Ignarro e Ferid Murad hanno identificato l’ossido nitrico (NO) come il fattore di rilassamento derivato dall’endotelio (EDRF) precedentemente noto, il ruolo centrale dell’NO è stato stabilito in diversi meccanismi chiave che abbracciano la biologia vascolare, le neuroscienze, il metabolismo e la risposta dell’ospite 1,2,3,4,5,6,7 . La somministrazione esogena di gas NO è diventata un trattamento consolidato per l’insufficienza respiratoria dovuta all’ipertensione polmonare nel neonato⁸. Il gas di ossido nitrico è stato anche studiato per il trattamento dell’infezione da virus respiratorio sinciziale (RSV), della malaria e di altre malattie infettive, del danno da ischemia-riperfusione e per la prevenzione del danno renale acuto in pazienti sottoposti a cardiochirurgia 9,10,11,12. La necessità di tecniche di misurazione precise per valutare i livelli di NO, i suoi metaboliti e quelli delle sue proteine e composti bersaglio deriva da studi sia meccanicistici che interventistici.

A causa della sua elevata reattività, l’NO può subire reazioni diverse a seconda della matrice biologica in cui viene prodotto e/o rilasciato. In assenza di emoglobina (Hb) o altre ossi-emoproteine, l’NO viene ossidato quasi completamente a nitrito (NO₂^–).

2NO + O₂ → 2NO₂

NO₂ + NO → N₂O₃

N₂O₃ + H₂O → NO₂^– + H⁺

L’NO subisce prima l’autossidazione con ossigeno molecolare (O₂) per produrre biossido di azoto (NO₂) e reagisce con l’NO_{2 stesso} per generare triossido di diazoto (N₂O₃). Una molecola di N₂O₃ reagisce con l’acqua (H₂O) per formare due molecole di NO₂^– e un protone (H⁺)¹³. All’interno del sangue intero ^14,15, NO e NO₂^– vengono rapidamente convertiti in nitrato (NO₃^–) poiché queste molecole reagiscono avidamente con i gruppi eme ossidati di Hb [Hb-Fe²⁺-O₂ o ossiemoglobina (oxyHb)] per produrre NO₃^–. Questa reazione è accoppiata con la transizione del gruppo eme allo stato ferrico [Hb-Fe³⁺ o metaemoglobina (metHb)]:

Hb-Fe²⁺-O₂ + NO → Hb-Fe³⁺ + NO₃^–

La barriera dei globuli rossi (RBC) e lo spazio immediatamente adiacente all’endotelio sono i principali fattori che limitano questa reazione e consentono a una piccola porzione di NO rilasciato dall’endotelio di agire come EDRF^16,17. Infatti, l’Hb privo di cellule in circolazione è noto per interrompere la vasodilatazione in contesti sperimentali e clinici^17,18. All’interno del RBC, a seconda dell’ossigenazione e della concentrazione di NO₂^–, una porzione di NO reagisce con la deossiemoglobina (Hb-Fe²⁺) per formare ferro-nitrosil Hb (Hb-Fe²⁺-NO o HbNO):

Hb-Fe²⁺ + NO → Hb-Fe²⁺-NO

Nell’RBC^15,17, NO₂^– può formare Hb-Fe³⁺ riducendo Hb-Fe²⁺ portando al rilascio di NO, che a sua volta lega Hb-Fe²⁺-O 2 (preferenzialmente) o Hb-Fe²⁺.

La generazione di NO-derivati non deve essere considerata strettamente unidirezionale in quanto l’NO può essere rigenerato da NO₂^– e NO₃^– in vari tessuti e da diversi enzimi (ad esempio, da batteri intestinali o all’interno dei mitocondri, in particolare in condizioni ipossiche)^19,20.

Una quantità variabile di NO prodotto (o somministrato) porta alla generazione a valle di S-nitrosotioli, principalmente mediante transnitrosazione tiolica da N₂O₃ in presenza di un nucleofilo che crea un intermedio donatore NO⁺ (Nuc-NO⁺-NO₂^–):

N₂O₃ + RS^– → RS-NO + NO₂^–

Un’altra possibilità per la generazione di S-nitrosotioli è la nitrosilazione dei tioli ossidati (NO che reagisce con un tiolo ossidato):

RS• + NO → RS-NO

Questo meccanismo e l’ossidazione diretta del tiolo da parte di NO₂ potrebbero essere possibili solo in condizioni molto specifiche descritte altrove²¹. Gli S-nitrosotioli vanno da molecole leggere come S-nitrosoglutatione a grandi proteine contenenti tiolo. La S-nitrosoemoglobina (S-NO-Hb) è formata dalla nitrosazione di un gruppo tiolo di un residuo di cisteina conservato nella catena β (β93C)²².

La generazione e il metabolismo degli S-nitrosotioli fanno parte di importanti meccanismi di regolazione. Gli esempi includono la regolazione di glutatione, caspasi, N-metil-D-aspartato (NMDA) e recettori della rianodina 23,24,25,26,27,28. Precedentemente considerata come uno dei principali mediatori della biologia dell’NO in vivo, l’albumina nitrosata (S-nitroso-albumina) sembra essere un trasportatore NO/NO⁺ senza alcuna specifica attività biologica aggiuntiva²⁹.

Quando si misura la concentrazione di NO e dei suoi derivati da uno specifico campione biologico all’interno di una matrice biologica, è importante considerare caratteristiche come l’acidità, l’ossigenazione, la temperatura e la presenza di reagenti. Gli esempi includono donatori di NO esogeni somministrati e, nel contesto dell’infiammazione acuta, il perossido di idrogeno (H₂O₂) che reagisce con NO₂ portando alla generazione di concentrazione supernormale di radicali liberi come il perossinitrito (ONOO^–)²¹. Oltre al metodo analitico che viene impiegato, è fondamentale la fase preanalitica di preparazione e conservazione del campione. Le reazioni a valle che non rappresentano l’attività di NO in vivo devono essere previste, considerate e bloccate. Un esempio valido è l’instabilità di S-NO-Hb, che richiede un trattamento dedicato dei campioni di sangue quando è mirato per la misurazione²².

I saggi basati sulla chemiluminescenza sono il gold standard per rilevare i livelli di NO e dei suoi principali metaboliti [NO₂^–, NO₃^–, S-NO e complessi ferro-nitrosilici (Fe-NO)] in qualsiasi fluido biologico, compresi gli omogeneizzati tissutali^30,31. Questi metodi si basano sul rivelatore di chemiluminescenza (CLD), un dispositivo che ospita la reazione di NO con l’ozono (O₃), generando NO₂ in uno stato eccitato (NO₂•). Il rilassamento di NO₂• provoca l’emissione di un fotone di luce che viene rilevato da un tubo fotomoltiplicatore, generando un segnale elettrico direttamente proporzionale al contenuto di NO della miscela di gas campionata³². È rappresentato uno schema semplificato del CLD.

Figura 1: Schema semplificato di un rivelatore a chemiluminescenza per gas di ossido nitrico. Il rilevamento basato sulla chemiluminescenza dell’ossido nitrico (NO) è la generazione stechiometrica di un fotone per molecola di gas NO che viene introdotta nel rivelatore di chemiluminescenza (CLD). La reazione di chemiluminescenza è ottenuta in una camera designata alimentata con ozono (O3) da un generatore interno, che viene mantenuto a pressione negativa dal collegamento con una pompa esterna, consentendo un afflusso continuo e costante di gas campione. La generazione di O₃ richiede ossigeno biatomico (O₂) che viene fornito da un serbatoio O₂ dedicato collegato al CLD (altri produttori forniscono CLD funzionanti con aria ambiente). All’interno della camera di reazione, ogni molecola di gas NO contenuta nel gas campionato reagisce con l’ossigeno per produrre una molecola di biossido di azoto allo stato attivato (NO₂*). Tornando al suo stato fondamentale, ogni molecola di NO₂* emette un fotone che viene rilevato da un tubo fotomoltiplicatore (PMT) situato adiacente alla camera di reazione. Il PMT con l’amplificatore associato e l’unità di elaborazione centrale produce un segnale proporzionale al conteggio dei fotoni e al numero di molecole di NO nella camera di reazione. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

L’ingresso del campione del CLD può essere collegato a un sistema di vetreria contenente una camera di reazione per campioni liquidi. Il sistema viene continuamente spurgato con un gas inerte come azoto, elio o argon, trasferendo NO dalla camera di reazione al CLD. I campioni in fase liquida vengono iniettati attraverso una membrana dedicata nel recipiente di spurgo.

Figura 2: Struttura di un recipiente di spurgo per il rilevamento basato sulla chemiluminescenza del gas di ossido nitrico Il recipiente di spurgo (a destra) consente il rilevamento di gas di ossido nitrico (NO) o di qualsiasi altro composto che può essere facilmente convertito in gas NO quando rilasciato da un reagente in fase liquida. L’ingresso del gas inerte è collegato a una fonte (serbatoio) di un gas inerte come Argon, Xeon o azoto biatomico (N₂). La valvola a spillo (si apre a sinistra) viene utilizzata per il controllo della pressione all’interno del recipiente di spurgo e può essere completamente rimossa per pulire la nave. La porta di iniezione è coperta da un cappuccio con un setto a membrana per l’iniezione del campione. La membrana deve essere sostituita spesso. Una camicia riscaldata circonda la camera di reazione ed è collegata a un bagno di acqua calda per eseguire il test VCl₃ in HCl. L’uscita del recipiente di spurgo è collegata al rivelatore di chemiluminescenza (CLD) o alla trappola NaOH (necessaria per VCl₃ nei saggi HCl). Per drenare il contenuto della camera di reazione, chiudere prima i rubinetti all’ingresso del gas inerte e all’uscita del recipiente di spurgo, chiudere la valvola a spillo, rimuovere il tappo alla porta di iniezione e infine aprire il rubinetto di arresto allo scarico. La trappola NaOH (a sinistra) deve essere posizionata in linea tra il recipiente di spurgo e il CLD se il VCl₃ nel test HCl viene eseguito a causa della corrosività dell’HCl. Il collegamento al CLD richiede sempre un filtro dielettrico a campo intenso (IFD) da posizionare tra il CLD e l’uscita del recipiente di spurgo (o della trappola NaOH, se utilizzata). Il filtro IFD rimuove le particelle sospese nell’aria e impedisce al liquido di passare attraverso il recipiente di spurgo. PTFE = politetrafluoroetilene. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Di conseguenza, qualsiasi composto che può essere convertito in NO attraverso una reazione chimica specifica e controllata può essere rilevato con elevata sensibilità in qualsiasi fluido biologico e omogeneizzato tissutale²⁴. La misurazione diretta dell’NO in fase gassosa attraverso la chemiluminescenza viene eseguita sia in ambito sperimentale che clinico. Queste tecniche sono ampiamente descritte altrove 33,34,35. La misurazione di NO₂^–, S-nitrosotioli, proteine S-nitrosate e Fe-NO può essere eseguita aggiungendo campioni in una miscela di reazione con triioduro (I₃^–), che rilascia stechiometricamente gas NO da tutti questi composti:

I₃^– → I₂ + I^–

2NO₂⁻ +2I⁻ +4H⁺ → 2NO + I₂ +2H₂O

I₃⁻ + 2RS-NO → 3I⁻ + RSSR + 2NO⁺

2NO⁺ + 2I⁻ → 2NO + I₂

mentre I₃^– non reagisce con NO ^3-15. Misurazioni precise di ciascun composto sono rese possibili dal pretrattamento di aliquote campione con sulfanilamide acidificata (AS) con o senza cloruro mercurico (HgCl₂). In particolare, il pre-trattamento con AS rimuove tutto il contenuto ^di NO₂. Di conseguenza, il contenuto di NO misurato dal CLD riflette solo la somma della concentrazione di S-NO e Fe-NOs. L’iniezione di HgCl₂ in un’aliquota del campione prima dell’iniezione di AS provoca il rilascio di NO₂^– da parte di S-NO. Il trattamento con AS (che porta alla rimozione di NO₂^–) assicura che il contenuto di NO misurato rifletta solo la concentrazione di Fe-NO. Una serie di sottrazioni tra le valutazioni permettono di calcolare la concentrazione precisa dei tre derivati no²².

Figura 3: Fasi della preparazione del campione per il saggio di chemiluminescenza dell’acido acetico I₃^– in. Vengono illustrate le fasi sequenziali per la preparazione del saggio di chemiluminescenza dell’acido acetico I₃^– in acido acetico. È richiesto l’uso di tubi centrifughi protetti dalla luce. I tubi 1, 2 e 3 sono quelli utilizzati per preparare il test. Un’altra aliquota di campionamento (tubo 4) è necessaria per il VCl₃ nel saggio HCl se è richiesta la misurazione del nitrato (NO₃^–). I passi sono indicati da numeri in rosso. Preriempire (Fase 1) come indicato con tampone fosfato salino (PBS) o HgCl₂ prima di aggiungere il volume del campione. Aggiungere il volume del campione (2) come indicato, vortice e incubare per 2 minuti a temperatura ambiente (RT). Aggiungere (3) PBS o sulfanilamide acidificata (AS) come indicato, vortice e incubare per 3 minuti a RT. Eseguire il test (4). La concentrazione misurata dal saggio è la somma della concentrazione dei composti riportati sotto ciascun tubo. Il tubo numero 1 consentirà misurazioni di nitriti (NO₂^–), S-nitrosotioli (S-NO) e complessi ferro-nitrosilici (Fe-NO) come un singolo segnale. Per la misurazione dei nitrati (NO₃^–), i campioni devono essere eseguiti sia con I₃^– in acido acetico che con VCl₃ nei saggi HCl, e il valore ottenuto dal tubo 1 deve essere sottratto da quello ottenuto dal tubo 4. *quantità suggerite da utilizzare per l’analisi dell’Hb per la determinazione dell’NO₂ ^residuo, della S-nitrosoemoglobina e dell’emoglobina ferro-nitrosil-emoglobina. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Per ^la misurazione dell’NO₃– il cloruro di vanadio (III) (VCl₃) in acido cloridrico (HCl) viene utilizzato per la conversione di NO₃^– in NO nel recipiente di spurgo al fine di misurare stechiometricamente l’NO₃^– con il CLD:

2 NO₃^–+ 3V⁺³ + 2H₂O → 2NO + 3VO₂⁺ + 4H⁺

Per ottenere una conversione sufficientemente veloce, la reazione deve essere eseguita a 90-95 °C. La riduzione da NO₃^– a NO₂^– è accoppiata con la riduzione di NO₂^– a NO da HCl. Il metallo vanadio riduce anche gli S-NO liberando la loro frazione di NO^22,36. La concentrazione finale ottenuta da CLD con VCl₃ in HCl riflette la concentrazione aggregata di NO₃^–, NO₂ e altri composti nitrosi. La sottrazione di quest’ultimo valore dalla concentrazione prodotta con CLD con I₃^– consente il calcolo della concentrazione di NO₃^{– 36,37} (Figura 3).

Nel test di consumo di NO, il rilascio continuo di NO nel vaso di spurgo da parte di donatori di NO come (Z)-1-[2-(2-amminoetil)-N-(2-ammonioetil)ammino]diazen-1-ium-1,2-diolato (DETA-NONOato) genera un segnale stabile che consente di quantificare l’ossiHb privo di cellule nei campioni iniettati. La quantità di NO consumata nel recipiente di spurgo è in una relazione stechiometrica con la quantità di oxyHb nel campione³⁸.

Vengono illustrati i protocolli per la misurazione di NO₂^–, NO₃-, S-nitrosotioli, complessi ferro-nitrosilici e consumo di NO da parte di Hb senza cellule in campioni di plasma. Gli studi sull’NO nell’ambiente RBC richiedono un trattamento specifico del campione seguito da cromatografia di esclusione per misurare S-NO-Hb e Hb-NO estremamente fragili accoppiati con la determinazione della concentrazione totale di Hb^15,22. La preparazione del campione è strumentale alla correzione della misurazione. La preesistenza di NO₂^– in H₂O e il rilascio di NO₂^– durante il test possono portare alla misurazione di concentrazioni artificialmente più elevate di derivati NO come S-NO-Hb^14,39. Vengono inoltre presentati aspetti importanti della preparazione del campione.

Protocol

Le procedure indicate in questo protocollo sono in conformità con il comitato di revisione del Massachusetts General Hospital. I campioni di sangue utilizzati erano stati raccolti durante uno studio precedente e sono stati de-identificati per lo scopo attuale18. NOTA: vedere le istruzioni del produttore per indicazioni specifiche sui collegamenti ottimali tra tubi e bicchieri che costituiscono il recipiente di spurgo, il lavaggio e la manutenzione generale. Le connessi…

Representative Results

Il consumo di NO mediante il saggio hb senza cellule è stato utilizzato in campioni contenenti concentrazioni note di ossiHb privo di cellule (Figura 4). Poiché un eme di oxyHb rilascia stechiometricamente una molecola NO nel test, l’oxyHb privo di cellule purificate viene utilizzato per costruire la curva di calibrazione per il test (Figura supplementare 3). La relazione dose-risposta tra Hb senza cellule (misurata con un test colorimetrico) e …

Discussion

A causa dell’elevata sensibilità, i saggi basati sulla chemiluminescenza per la determinazione dell’NO e dei composti correlati hanno un alto rischio di contaminazione ^da NO₂-. Ogni reagente (in particolare la ^{soluzione che blocca} l’NO₂) e il diluente (incluso il ddH₂O) utilizzati nell’esperimento devono essere testati per il suo contenuto di NO₂^– per correggere il segnale di fondo. Il nitrito è estremamente reattivo con un’emivita nel sangue …

Materials

Acetic Acid	Sigma	45754	500 mL – liquid
Antifoam B Emulsion	Sigma	A5757	250 mL – liquid
DETA NONOate	Cayman	82120	10 mg
Gibco DPBS (1x) no calcium, no magnesium	ThermoFisher	14190144	500 mL
Hydroochloric Acid 37% (1 M)	Sigma	258148	500 mL – liquid
Iodine	SAFC	207772	100 g – solid
Kimwipes	Kimtech	34155
Mercury (II) Chloride ACS reagent> 99.5%	Sigma	215465	100 g – solid (dissolve in water)
Mili-Q Water Purification System	Millipore
Model 705 RN 50 μL syringe	Hamilton	80530	Microliter syringe
Model 802 N 25 μL Syringe	Hamilton	84854	Microliter syringe
N-ethylmaleimide	Sigma	4260	25 g – crystalline
Nitric Oxide Analyzer + Bundle Software – Purge Vessel	Zysense	NOA 280i	Chemiluminescence Detector
Nonidet p-40  (NP-40)	ThermoFisher	85125	10% – 500 mL
Potassium hexacyanoferrate (III) ACS reagent≥ 99%	Sigma	244023	100 g – powder
Potassium Iodide ACS reagent> 99%	Sigma	221945	100 g – solid
Potassium Nitrite cryst. For analysis EMSURE ACS	Supelco	105067	250 g – crystalline
PowerGen 125	Fisher Scientific	14-359-251	Mechanic Homogenizer
RV3 Two Stage Rotary Vane Pump	Edwards	A65201906	Vacuum Pump – Bundled with analyzer
Sodium Heparin – BD Hemogard Clo	BD Biosciences	BD367871	75 USP Units
Sodium hydroxide anhydrous ACS reagent ≥ 97%	Sigma	795429	1 kg – pelletts
Sodium Nitrate ACS reagent ≥ 99%	Sigma	221341	500 g – powder
Sodium nitrite ≥ 99%	Sigma	S2252	500 g – crystalline
Sulfanilamide ≥ 98%	Sigma	S9251	100 g – solid
Vanadium (III) Chloride	Sigma	112393	25 g – solid – Caution (exothermic)
Whatman 1 Filter Paper	Sigma	WHA10010155