Chemiluminescence-baserte analyser for påvisning av nitrogenoksid og dets derivater fra autoxidasjon og nitroserte forbindelser

Summary

Her presenterer vi protokoller for å oppdage nitrogenoksid og dets biologisk relevante derivater ved hjelp av chemiluminescensbaserte analyser med høy følsomhet.

Abstract

Nitrogenoksid (NO) aktivitet in vivo er de kombinerte resultatene av sine direkte effekter, virkningen av dets derivater generert fra INGEN autoxidasjon, og effekten av nitroserte forbindelser. Måling av NO metabolitter er avgjørende for å studere INGEN aktivitet både på vaskulære nivåer og i andre vev, spesielt i eksperimentelle omgivelser der eksogen NO administreres. Ozonbaserte chemiluminescensanalyser tillater presise målinger av NO- og NO-metabolitter i begge væsker (inkludert plasma, vevshomogenater, cellekulturer) og gassblandinger (f.eks. utåndet pust). NO reagerer med ozon for å generere nitrogendioksid i en opphisset tilstand. Det påfølgende lysutslippet tillater fotodeteksjon og generering av et elektrisk signal som reflekterer NO-innholdet i prøven. Aliquots fra samme prøve kan brukes til å måle spesifikke NO metabolitter, for eksempel nitrat, nitritt, S-nitrosothioler og jern-nitrosylkomplekser. I tillegg er NO konsumert av cellefritt hemoglobin også kvantifisert med chemiluminescensanalyse. En illustrasjon av alle disse teknikkene er gitt.

Introduction

Siden Salvador Moncada og nobelprisvinnerne Robert Furchgott, Louis Ignarro og Ferid Murad identifiserte nitrogenoksid (NO) som den tidligere kjente endotel-avledede avslapningsfaktoren (EDRF), har den sentrale rollen til NO blitt etablert i flere viktige mekanismer som spenner over vaskulær biologi, nevrovitenskap, metabolisme og vertsrespons 1,2,3,4,5,6,7 . Eksogen administrering av NO-gass har blitt en etablert behandling for respirasjonssvikt på grunn av pulmonal hypertensjon hos nyfødte⁸. Nitrogenoksidgass har også blitt undersøkt for behandling av respiratorisk synytialvirusinfeksjon (RSV), malaria og andre infeksjonssykdommer, iskemi-reperfusjonsskade, og for forebygging av akutt nyreskade hos pasienter som gjennomgår hjertekirurgi 9,10,11,12. Behovet for presise måleteknikker for å vurdere nivåene av NO, dets metabolitter, og de av målproteiner og forbindelser oppstår fra både mekanistiske og intervensjonelle studier.

På grunn av sin høye reaktivitet kan NO gjennomgå forskjellige reaksjoner avhengig av den biologiske matrisen den produseres og/eller frigjøres i. I fravær av hemoglobin (Hb) eller andre oksy-hemoproteiner oksideres NO nesten helt til nitritt (NO₂^–).

2NO + O₂ → 2NO₂

NO₂ + NO → N₂O₃

N₂O₃ + H₂O → NR₂^– + H⁺

NO gjennomgår først autoxidasjon med molekylært oksygen (O₂) for å gi nitrogendioksid (NO₂) og reagerer med NO₂ selv for å generere dinitrogentrioksid (_N2O₃). Ett molekyl av N₂O₃ reagerer med vann (H₂O) for å danne to molekyler av NO₂^– og en proton (H⁺)¹³. Innen fullblods^14,15, NEI og NO₂^– konverteres raskt til nitrat (NO₃^–) da disse molekylene reagerer ivrig med de oksiderte hemegruppene hb [Hb-Fe^{2 +}-O₂ eller oksyhemoglobin (oksyHb)] for å gi NO₃^–. Denne reaksjonen er kombinert med overgangen av heme-gruppen til ferric-tilstanden [Hb-Fe³⁺ eller methemoglobin (metHb)]:

Hb-Fe²⁺-O₂ + NO → Hb-Fe³⁺ + NO₃^–

Den røde blodlegemer (RBC) barrieren og rommet rett ved siden av endotelet er de viktigste faktorene som begrenser denne reaksjonen og tillater en liten del av NO frigjort av endotelet å fungere som EDRF^16,17. Faktisk er cellefri Hb i sirkulasjonen kjent for å forstyrre vasodilatasjon i eksperimentelle og kliniske omgivelser^17,18. Innenfor RBC, avhengig av oksygenering og NO ^{2-konsentrasjon}, reagerer en del av NO med deoksyhemoglobin (Hb-Fe²⁺) for å danne jern-nitrosyl Hb (Hb-Fe²⁺-NO eller HbNO):

Hb-Fe²⁺ + NO → Hb-Fe²⁺-NO

I RBC^15,17 kan NO₂^– danne Hb-Fe³⁺ ved å redusere Hb-Fe²⁺ som fører til utgivelsen av NO, som igjen binder Hb-Fe^{2 +}-O₂ (fortrinnsvis) eller Hb-Fe²⁺.

Genereringen av NO-derivater bør ikke betraktes som strengt enveis, da NO kan regenereres fra NO₂^– og NO₃^– i ulike vev og av forskjellige enzymer (f.eks. ved tarmbakterier eller innen mitokondrier, spesielt under hypoksiske forhold)^19,20.

En variabel mengde NO produsert (eller administrert) fører til nedstrøms generering av S-nitrosothioler, hovedsakelig ved tioltransnitrosasjon fra N₂O₃ i nærvær av en nukleofil som skaper en NO ⁺ donor mellomliggende (Nuc-NO ⁺ -NO₂^–):

N₂O₃ + RS^– → RS-NO + NO₂^–

En annen mulighet for S-nitrosothiols generasjon er nitrosylering av oksiderte tioler (INGEN reagerer med en oksidert tiol):

RS• + NO → RS-NO

Denne mekanismen og direkte tioloksidasjon ved NO₂ kan bare være mulig under svært spesifikke forhold som er beskrevet andre steder²¹. S-nitrosothioler spenner fra lette molekyler som S-nitrosoglutathione til store tiolholdige proteiner. S-nitrosohemoglobin (S-NO-Hb) dannes ved nitrosasjon av en tiolgruppe av en konservert cysteinrester i β-kjeden (β93C)²².

Generering og metabolisme av S-nitrosothioler er en del av viktige regulatoriske mekanismer. Eksempler er regulering av glutathione, caspaser, N-metyl-D-Aspartat (NMDA) og ryanodinreseptorer 23,24,25,26,27,28. Tidligere ansett som en stor formidler av NO biologi in vivo, nitrosated albumin (S-nitroso-albumin) synes å være en NO / NO ⁺ transportør uten noen spesifikk ekstra biologisk aktivitet²⁹.

Ved måling av konsentrasjonen av NO og dets derivater fra en bestemt biologisk prøve i en biologisk matrise, er det viktig å vurdere egenskaper som surhet, oksygenering, temperatur og tilstedeværelse av reagenser. Eksempler er administrerte eksogene NO-donorer, og i innstillingen av akutt betennelse reagerer hydrogenperoksid (_H2O₂) med NO₂ som fører til generering av supernormal konsentrasjon av frie radikaler som peroksynitritt (ONOO^–)²¹. I tillegg til den analytiske metoden som brukes, er den preanalytiske fasen av prøvepreparering og lagring grunnleggende. Nedstrømsreaksjoner som ikke representerer in vivo NO-aktiviteten skal forutsies, vurderes og blokkeres. Et gyldig eksempel er ustabiliteten til S-NO-Hb, som krever en dedikert behandling av blodprøver når den er rettet mot måling²².

Chemiluminescence-baserte analyser er gullstandarden for å oppdage nivåene av NO og dens viktigste metabolitter [NO₂^–, NO₃^–, S-NO og iron-nitrosylkomplekser (Fe-NO)] i enhver biologisk væske, inkludert vev homogenater^30,31. Disse metodene er avhengige av chemiluminescence detector (CLD), en enhet som huser reaksjonen av NO med ozon (O₃), og genererer NO₂ i en spent tilstand (NO₂•). Avslapping av NO₂• forårsaker utslipp av en foton av lys som oppdages av et fotomultiplierrør, og genererer et elektrisk signal som er direkte proporsjonalt med NO-innholdet i den prøvede gassblandingen³². Et forenklet skjema av CLD er representert.

Figur 1: Forenklet skjematisk for en chemiluminescensdetektor for nitrogenoksidgass. Chemiluminescence-basert deteksjon av nitrogenoksid (NO) er den stoichiometriske generasjonen av ett foton per NO gassmolekyl som introduseres i chemiluminescence detector (CLD). Chemiluminescensreaksjonen oppnås i et utpekt kammer som leveres med ozon (O3) fra en intern generator, som holdes ved negativt trykk ved forbindelse med en ekstern pumpe, noe som tillater kontinuerlig og konstant tilstrømning av prøvegass. Genereringen av O₃ krever diatomisk oksygen (O₂) som leveres av en dedikert O_2-tank koblet til CLD (andre produsenter gir CLDer som opererer med omgivelsesluft). Innenfor reaksjonskammeret reagerer hvert molekyl av INGEN gass i prøvegassen med oksygen for å gi ett molekyl nitrogendioksid i aktivert tilstand (NO₂*). Ved å gå tilbake til sin bakketilstand avgir hvert NO₂* molekyl en foton som oppdages av et fotomultiplierrør (PMT) som ligger ved siden av reaksjonskammeret. PMT med tilhørende forsterker og sentral prosesseringsenhet produserer et signal proporsjonalt med fotontallet og antall NO-molekyler i reaksjonskammeret. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Prøveinntaket til CLD kan kobles til et glassrørsystem som inneholder et reaksjonskammer for væskeprøver. Systemet renses kontinuerlig med en inert gass som nitrogen, helium eller argon, og overfører NEI fra reaksjonskammeret til CLD. Væskefaseprøver injiseres gjennom en dedikert membran inn i rensebeholderen.

Figur 2: Struktur av et rensekar for chemiluminescensbasert påvisning av nitrogenoksidgass Rensebeholderen (høyre) gjør det mulig å påvise nitrogenoksid (NO) gass eller annen forbindelse som lett kan omdannes til INGEN gass når den slippes ut fra et flytende fasereagens. Det inert gassinntaket er koblet til en kilde (tank) av en inert gass som Argon, Xeon eller diatomisk nitrogen (N₂). Nåleventilen (åpnes til venstre) brukes til trykkregulering i rensebeholderen og kan fjernes helt for å rengjøre fartøyet. Injeksjonsporten er dekket av en hette med en membran septum for prøveinjeksjon. Membranen bør byttes ofte ut. En oppvarmet jakke omgir reaksjonskammeret og er koblet til et varmtvannsbad for å utføre VCl₃ i HCl-analysen. Utløpet av rensebeholderen er koblet til chemiluminescensdetektoren (CLD) eller naoh-fellen (kreves for VCl₃ i HCl-analyser). For å tømme innholdet i reaksjonskammeret må du først lukke stoppekranene ved det inerte gassinntaket og rensekarutløpet, lukke nåleventilen, fjerne hetten ved injeksjonsporten og til slutt åpne stoppekranen ved avløpet. NaOH-fellen (til venstre) må plasseres linjebundet mellom rensebeholderen og CLD hvis VCl₃ i HCl-analysen utføres på grunn av korrosjonen til HCl. Forbindelsen til CLD krever alltid at et intenst felt dielektrisk (IFD) filter skal plasseres mellom CLD og utgangen av rensebeholderen (eller NaOH-fellen, hvis det brukes). IFD-filteret fjerner luftbårne partikler og stopper væske fra å passere gjennom rensebeholderen. PTFE = polytetrafluoretylen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Som en konsekvens kan enhver forbindelse som kan konverteres til NEI gjennom en bestemt og kontrollert kjemisk reaksjon oppdages med høy følsomhet i enhver biologisk væske og vev homogenat²⁴. Direkte måling av gassfase NO gjennom chemiluminescens utføres i både eksperimentelle og kliniske omgivelser. Disse teknikkene er omfattende beskrevet andre steder 33,34,35. Måling av NO₂^–, S-nitrosothiols, S-nitroserte proteiner og Fe-NOs kan utføres ved å legge til prøver i en reaksjonsblanding med triiodid (I₃^–), som stoichiometisk frigjør INGEN gass fra alle disse forbindelsene:

Jeg₃^– → jeg₂ + jeg^–

2NO₂⁻ +2I⁻ +4H⁺ → 2NO + I₂ +2H₂O

I₃⁻ + 2RS-NO → 3I⁻ + RSSR + 2NO⁺

2NO⁺ + 2I⁻ → 2NO + I₂

mens jeg₃^– reagerer ikke med NO ^3-15. Nøyaktige målinger av hver forbindelse er muliggjort ved forbehandling av prøve aliquots med surgjort sulfanilamid (AS) med eller uten mercuric klorid (HgCl₂). Spesielt fjerner forbehandling med AS alt NO ^2-innhold. Som en konsekvens av dette gjenspeiler NO-innholdet målt ved CLD bare summen av S-NOer og Fe-NOs konsentrasjon. Injeksjon av HgCl₂ i en prøve aliquot før AS injeksjon fører til at NO₂^– frigjøres av S-NO. Behandling med AS (som fører til NO₂^– fjerning) sikrer at det målte NO-innholdet bare gjenspeiler konsentrasjonen av Fe-NOer. En rekke subtraksjoner mellom vurderingene gjør det mulig å beregne den nøyaktige konsentrasjonen av de tre NO-derivatene²².

Figur 3: Trinn i prøvepreparering for I ^{3-i-eddiksyre} chemiluminescence-analysen. De sekvensielle trinnene for fremstilling av I ^{3-i eddiksyre} chemiluminescence-analysen er illustrert. Bruk av lysbeskyttede sentrifugerør er nødvendig. Rør 1, 2 og 3 er de som brukes til å forberede seg på analysen. En annen prøve aliquot (rør 4) er nødvendig for VCl₃ i HCl-analysen hvis måling av nitrat (NO₃^–) er nødvendig. Trinnene angis med tall i rødt. Forhåndsutfylling (trinn 1) som indikert med fosfatbuffersark (PBS) eller HgCl₂ før prøvevolumet tilsettes. Tilsett prøvevolumet (2) som angitt, virvel og inkuber i 2 minutter ved romtemperatur (RT). Tilsett (3) PBS eller surgjort sulfanilamid (AS) som indikert, virvel og inkuber i 3 min ved RT. Kjør analysen (4). Konsentrasjonen målt ved analysen er summen av konsentrasjonen av forbindelsene som rapporteres under hvert rør. Rør nummer 1 vil tillate målinger av nitritt (NO₂^–), S-nitrosothiols (S-NO) og jern-nitrosylkomplekser (Fe-NOs) som et enkelt signal. For nitratmåling (NO₃-) skal prøver kjøres med både I₃^– i eddiksyre og VCl₃ i ^HCl-analyser, og verdien oppnådd fra rør 1 skal trekkes fra den som er oppnådd fra rør 4. *foreslåtte mengder som skal brukes til Hb-analyse for bestemmelse av rest no₂^–, S-nitrosohemoglobin og jern-nitrosyl-hemoglobin. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

For NO ^3-måling brukes Vanadium (III) klorid (VCl₃) i saltsyre (HCl) til konvertering av NO₃^– til NO i rensebeholderen for å måle NO ^{3-stoichiometrisk} med CLD:

2 NO₃^–+ 3V⁺³ + 2H₂O → 2NO + 3VO₂⁺ + 4H⁺

For å oppnå en tilstrekkelig rask konvertering må reaksjonen utføres ved 90-95 °C. Reduksjon fra NO₃^– til NO₂^– kombineres med reduksjon av NO₂^– til NO av HCl. Vanadium metall reduserer også S-NOs frigjøre sin NO moiety^22,36. Den endelige konsentrasjonen oppnådd av CLD med VCl₃ i HCl gjenspeiler den samlede konsentrasjonen av NO₃^–, NO₂ og andre nitroserte forbindelser. Subtraksjon av sistnevnte verdi fra konsentrasjonen gitt med CLD med I₃^– tillater beregning av NO ^{3-konsentrasjon 36,37} (figur 3).

I NO-forbruksanalysen genererer den kontinuerlige frigjøringen av NO i rensefartøyet av NO-givere som (Z)-1-[2-(2-aminoethyl)-N-(2-ammonioethyl)amino]diazen-1-ium-1,2-diolat (DETA-NONOate) et stabilt signal som tillater kvantifisering av cellefri oksyHb i de injiserte prøvene. Mengden NO som forbrukes i rensebeholderen er i et stoichiometrisk forhold til mengden oksyHb i^{prøven 38}.

Protokoller for måling av NO₂^–, NO₃^–, S-nitrosothiols, jern-nitrosylkomplekser og INGEN forbruk ved cellefri Hb i plasmaprøver er illustrert. Studier på NO i RBC-miljøet krever spesifikk prøvebehandling etterfulgt av eksklusjonskromatografi for å måle ekstremt skjøre S-NO-Hb og Hb-NO kombinert med bestemmelse av total Hb-konsentrasjon^15,22. Prøvepreparering er medvirkende til å korrigere måling. Pre-eksistens av NO₂^– i H₂O og frigjøring av NO₂^– under analysen kan føre til måling av kunstig høyere konsentrasjoner av NO derivater som S-NO-Hb^14,39. Viktige aspekter ved prøveforberedelse presenteres også.

Protocol

Prosedyrene som er angitt i denne protokollen er i samsvar med kontrollstyret ved Massachusetts General Hospital. Blodprøvene som ble brukt hadde blitt samlet inn i en tidligere studie og ble av-identifisert for gjeldende formål18. MERK: Se produsentens anvisninger for spesifikk veiledning om optimale forbindelser mellom slanger og glassvarer som utgjør rensebeholderen, vasken og generelt vedlikehold. Tilkoblinger må være faste og nøye laget for ikke å skade glas…

Representative Results

NO-forbruket ved cellefri Hb-analyse ble brukt i prøver som inneholder kjente konsentrasjoner av cellefri oksyHb (figur 4). Som en heme av oksyHb stoichiometrisk frigjør ett NO-molekyl i analysen, brukes renset cellefri oksyHb til å bygge kalibreringskurven for analysen (Supplerende figur 3). Doseresponsforholdet mellom cellefri Hb (målt med en kolorimetrisk analyse) og INGEN forbruk hos pasienter som kommer ut av hjerte- og lunge bypass (CPB)…

Discussion

På grunn av den høye følsomheten har chemiluminescensbaserte analyser for bestemmelse av NO og relaterte forbindelser en høy risiko for NO ^{2-forurensning}. Hvert reagens (spesielt NO ^{2-blokkerende} løsning) og fortynningsmiddel (inkludert ddH₂O) som brukes i eksperimentet, bør testes for no ^2-innhold for å korrigere for bakgrunnssignal. Nitritt er ekstremt reaktiv med en halveringstid i fullblod rundt 10 min og genererer raskt NO_3</sub…

Materials

Acetic Acid	Sigma	45754	500 mL – liquid
Antifoam B Emulsion	Sigma	A5757	250 mL – liquid
DETA NONOate	Cayman	82120	10 mg
Gibco DPBS (1x) no calcium, no magnesium	ThermoFisher	14190144	500 mL
Hydroochloric Acid 37% (1 M)	Sigma	258148	500 mL – liquid
Iodine	SAFC	207772	100 g – solid
Kimwipes	Kimtech	34155
Mercury (II) Chloride ACS reagent> 99.5%	Sigma	215465	100 g – solid (dissolve in water)
Mili-Q Water Purification System	Millipore
Model 705 RN 50 μL syringe	Hamilton	80530	Microliter syringe
Model 802 N 25 μL Syringe	Hamilton	84854	Microliter syringe
N-ethylmaleimide	Sigma	4260	25 g – crystalline
Nitric Oxide Analyzer + Bundle Software – Purge Vessel	Zysense	NOA 280i	Chemiluminescence Detector
Nonidet p-40  (NP-40)	ThermoFisher	85125	10% – 500 mL
Potassium hexacyanoferrate (III) ACS reagent≥ 99%	Sigma	244023	100 g – powder
Potassium Iodide ACS reagent> 99%	Sigma	221945	100 g – solid
Potassium Nitrite cryst. For analysis EMSURE ACS	Supelco	105067	250 g – crystalline
PowerGen 125	Fisher Scientific	14-359-251	Mechanic Homogenizer
RV3 Two Stage Rotary Vane Pump	Edwards	A65201906	Vacuum Pump – Bundled with analyzer
Sodium Heparin – BD Hemogard Clo	BD Biosciences	BD367871	75 USP Units
Sodium hydroxide anhydrous ACS reagent ≥ 97%	Sigma	795429	1 kg – pelletts
Sodium Nitrate ACS reagent ≥ 99%	Sigma	221341	500 g – powder
Sodium nitrite ≥ 99%	Sigma	S2252	500 g – crystalline
Sulfanilamide ≥ 98%	Sigma	S9251	100 g – solid
Vanadium (III) Chloride	Sigma	112393	25 g – solid – Caution (exothermic)
Whatman 1 Filter Paper	Sigma	WHA10010155