Ensaios baseados em chemiluminescência para detecção de óxido nítrico e seus derivados de Autoxidação e Compostos Nitrosated

Summary

Aqui, apresentamos protocolos para detectar óxido nítrico e seus derivados biologicamente relevantes usando ensaios baseados em chemiluminescência com alta sensibilidade.

Abstract

A atividade de óxido nítrico (NO) in vivo é o resultado combinado de seus efeitos diretos, a ação de seus derivados gerados a partir da autoxidação no no, e os efeitos dos compostos nitrosos. Medir metabólitos NO é essencial para estudar nenhuma atividade tanto em níveis vasculares quanto em outros tecidos, especialmente nos ambientes experimentais onde o NO exógeno é administrado. Os ensaios de chemiluminescência à base de ozônio permitem medições precisas de metabólitos NO e NO em ambos os fluidos (incluindo plasma, homogeneizadores de tecido, culturas celulares) e misturas de gás (por exemplo, respiração exalada). NÃO reage com ozônio para gerar dióxido de nitrogênio em um estado animado. A consequente emissão de luz permite a fotodetecção e a geração de um sinal elétrico refletindo o teor NO da amostra. Alíquotas da mesma amostra podem ser usadas para medir metabólitos não específicos, como nitrato, nitrito, S-nitrosothiols e complexos ferro-nitrosilo. Além disso, o NO consumido pela hemoglobina livre de células também é quantificado com a análise de quimiluminescência. Uma ilustração de todas essas técnicas é fornecida.

Introduction

Desde que Os ganhadores do Salvador Moncada e do Nobel Robert Furchgott, Louis Ignarro e Ferid Murad identificaram o óxido nítrico (NO) como o anteriormente conhecido fator de relaxamento derivado da endotelia (EDRF), o papel central do NO foi estabelecido em vários mecanismos-chave que abrangem toda a biologia vascular, neurociências, metabolismo e resposta ao hospedeiro 1,2,3,4,5,6,7 . A administração exógena do GÁS NO tornou-se um tratamento estabelecido para insuficiência respiratória devido à hipertensão pulmonar no recém-nascido⁸. O gás óxido nítrico também tem sido investigado para o tratamento da infecção pelo vírus sincicial respiratório (RSV), malária e outras doenças infecciosas, lesão de isquemia-reperfusão e para prevenção de lesão renal aguda em pacientes submetidos à cirurgia cardíaca 9,10,11,12. A necessidade de técnicas precisas de medição para avaliar os níveis de NO, seus metabólitos e os de suas proteínas e compostos-alvo surge tanto de estudos mecanicistas quanto intervencionistas.

Devido à sua alta reatividade, a NO pode sofrer reações diferentes dependendo da matriz biológica em que é produzida e/ou liberada. Na ausência de hemoglobina (Hb) ou outras hemoproteínas de oxi, a NO é oxidada quase completamente ao nitrito (NO₂^–).

2NO + O₂ → 2NO₂

NO₂ + NO → N₂O₃

N₂O₃ + H₂O → NO₂^– + H⁺

O NO primeiro sofre autoxidação com oxigênio molecular (O₂) para produzir dióxido de nitrogênio (NO₂) e reage com o próprio NO₂ para gerar trióxido de dinitrogen (N₂O₃). Uma molécula de N₂O₃ reage com água (H₂O) para formar duas moléculas de NO₂^– e um próton (H⁺)¹³. Dentro de sangue inteiro^14,15, NO e NO₂^– são rapidamente convertidos em nitrato (NO₃^–) como essas moléculas reagem avidamente com os grupos de heme oxidado de Hb [Hb-Fe²⁺-O₂ ou oximosoglobina (oxicodona)] para produzir NO₃^–. Esta reação é associada à transição do grupo heme para o estado férrico [Hb-Fe³⁺ ou methemoglobina (metHb)]:

HB-Fe²⁺-O₂ + NO → Hb-Fe³⁺ + NO₃^–

A barreira das células vermelhas do sangue (RBC) e o espaço imediatamente adjacente ao endotélio são os principais fatores que limitam essa reação e permitem que uma pequena porção do NO liberada pelo endotélio atue como EDRF^16,17. Na verdade, o Hb livre de células na circulação é conhecido por interromper a vasodilatação em ambientes experimentais e clínicos^17,18. Dentro da RBC, dependendo da oxigenação ^{e da concentração} NO₂, uma porção de NO reage com desoxihemoglobina (Hb-Fe²⁺) para formar ferro-nitrosol Hb (Hb-Fe²⁺-NO ou HbNO):

HB-Fe²⁺ + NO → Hb-Fe²⁺-NO

Na RBC^15,17, o NO₂^– pode formar o Hb-Fe³⁺ reduzindo o Hb-Fe²⁺ levando ao lançamento do NO, que por sua vez liga o Hb-Fe²⁺-O₂ (preferencialmente) ou o Hb-Fe²⁺.

A geração de no-derivados não deve ser considerada estritamente unidirecional, pois o NO pode ser regenerado a partir de NO₂^– e NO₃^– em vários tecidos e por diferentes enzimas (por exemplo, por bactérias intestinais ou dentro das mitocôndrias, particularmente sob condições hipoxicas)^19,20.

Uma quantidade variável de NO produzido (ou administrado) leva à geração a jusante de S-nitrosothiols, principalmente por transinrose de thiol a partir de N₂O₃ na presença de um nucleófilo criando um intermediário doador NO⁺ (Nuc-NO⁺-NO₂^–):

N₂O₃ + RS^– → RS-NO + NO₂^–

Outra possibilidade para a geração de S-nitrosothiols é a nitrosiagem de tiais oxidados (NÃO reage com um tiol oxidado):

RS• + NO → RS-NO

Este mecanismo e oxidação direta de thiol pelo NO₂ só podem ser possíveis em condições muito específicas que são descritas em outros lugares²¹. Os s-nitrosothiols variam de moléculas leves como S-nitrosoglutathione a grandes proteínas que contêm tiol. A s-nitrosohemoglobina (S-NO-Hb) é formada por nitrosão de um grupo de tiol de um resíduo de cisteína conservado na cadeia de β (β93C)²².

A geração e o metabolismo dos S-nitrosothiols fazem parte de importantes mecanismos regulatórios. Exemplos incluem regulação de glutathione, caspases, N-metil-D-Aspartato (NMDA) e receptores de ryanodo 23,24,25,26,27,28. Anteriormente considerado como um grande mediador da NO biology in vivo, a albumina nitrosa (S-nitroso-albumina) parece ser um transportador NO/NO⁺ sem qualquer atividade biológica adicional específica²⁹.

Ao medir a concentração de NO e seus derivados de uma amostra biológica específica dentro de uma matriz biológica, é importante considerar características como acidez, oxigenação, temperatura e presença de reagentes. Exemplos incluem doadores exógenos administrados NO e, no cenário de inflamação aguda, peróxido de hidrogênio (H₂O₂) reagindo com o NO₂ levando à geração de concentração supernormal de radicais livres como a peroxitorita (ONOO^–)²¹. Além do método analítico que é empregado, a fase pré-analítica da preparação e armazenamento da amostra é fundamental. Reações a jusante que não representam a atividade in vivo NO devem ser previstas, consideradas e bloqueadas. Um exemplo válido é a instabilidade do S-NO-Hb, que exige um tratamento dedicado de amostras de sangue quando é direcionado para a medição²².

Ensaios baseados em chemiluminescência são o padrão-ouro para detectar os níveis de NO e seus principais metabólitos [NO₂^–, NO₃^–, S-NO e complexos ferro-nitrosol (Fe-NO)] em qualquer fluido biológico, incluindo homogeneiza tecidos^30,31. Esses métodos dependem do detector de chemiluminescência (CLD), um dispositivo que abriga a reação de NO com ozônio (O₃), gerando o Nº₂ em estado animado (NO₂•). Relaxamento do NO₂• causa emissão de um fóton de luz detectado por um tubo fotomultiplier, gerando um sinal elétrico diretamente proporcional ao teor NO da mistura de gás amostrado³². Um esquema simplificado do CLD está representado.

Figura 1: Esquema simplificado de um detector de quimiluminescência para gás óxido nítrico. A detecção baseada em óxido nítrico (NO) é a geração estequiométrica de uma molécula de gás NO que é introduzida no detector de quimiominascência (CID). A reação de chemiluminescência é obtida em uma câmara designada fornecida com ozônio (O3) de um gerador interno, que é mantida em pressão negativa por conexão com uma bomba externa, permitindo entrada contínua e constante de gás amostral. A geração de O₃ requer oxigênio diatômico (O₂) que é fornecido por um tanque O₂ dedicado conectado com o CLD (outros fabricantes fornecem CLDs operando com ar ambiente). Dentro da câmara de reação, cada molécula de gás NO contido no gás amostrado reage com oxigênio para produzir uma molécula de dióxido de nitrogênio no estado ativado (NO₂*). Ao retornar ao seu estado terrestre, cada molécula NO₂* emite um fóton que é detectado por um tubo fotomultiplier (PMT) localizado ao lado da câmara de reação. O TPM com o amplificador associado e unidade de processamento central produz um sinal proporcional à contagem de fótons e ao número de nenhuma molécula na câmara de reação. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

A entrada amostral do CLD pode ser conectada a um sistema de vidro contendo uma câmara de reação para amostras líquidas. O sistema é continuamente purgado com um gás inerte como nitrogênio, hélio ou argônio, transferindo NÃO da câmara de reação para o CLD. Amostras de fase líquida são injetadas através de uma membrana dedicada no vaso de purga.

Figura 2: Estrutura de um vaso de purga para detecção baseada em óxido nítrico à base de quimiotrica O vaso de purga (à direita) permite a detecção de gás óxido nítrico (NO) ou qualquer outro composto que possa ser facilmente convertido em nenhum gás quando liberado de um reagente de fase líquida. A entrada de gás inerte está conectada a uma fonte (tanque) de um gás inerte como Argon, Xeon ou nitrogênio diatômico (N₂). A válvula da agulha (abre à esquerda) é usada para controle de pressão dentro do vaso de purga e pode ser completamente removida para limpar o vaso. A porta de injeção é coberta por uma tampa com um septo de membrana para injeção de amostra. A membrana deve ser substituída com frequência. Uma jaqueta aquecida envolve a câmara de reação e é conectada a um banho de água quente para realizar o teste VCl₃ em HCl. A saída do vaso de purgação está conectada ao detector de quimiominascência (CLD) ou à armadilha NaOH (necessária para vcl₃ em ensaios HCl). Para drenar o conteúdo da câmara de reação, primeiro feche as torneiras na entrada de gás inerte e a saída do vaso de purga, feche a válvula da agulha, remova a tampa no porta de injeção e, finalmente, abra a torneira no ralo. A armadilha NaOH (esquerda) é necessária para ser colocada em linha entre o vaso de purga e o CLD se o ensaio VCl₃ em HCl for realizado devido à corrosão do HCL. A conexão com o CLD sempre requer um filtro de campo intenso (IFD) a ser colocado entre o CLD e a saída do vaso de purga (ou a armadilha NaOH, se usado). O filtro IFD remove partículas aéreas e impede que o líquido passe pelo vaso de purga. PTFE = politetrafluoroetileno. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Como consequência, qualquer composto que possa ser convertido em NÃO através de uma reação química específica e controlada pode ser detectado com alta sensibilidade em qualquer fluido biológico e homogeneizar tecido²⁴. A medição direta da fase de gás NO através da chemiluminescência é realizada tanto em ambientes experimentais quanto clínicos. Essas técnicas são amplamente descritas em outros lugares 33,34,35. A medição de NO₂^–, S-nitrosothiols, proteínas S-nitrosated e Fe-NOs pode ser realizada adicionando amostras em uma mistura de reação com triiodeto (I₃^–), que não libera gás estelioetricamente de todos esses compostos:

I₃^– → I₂ + I^–

2NO₂⁻ +2I⁻ +4H⁺ → 2NO + I₂ +2H₂O

I₃⁻ + 2RS-NO → 3I⁻ + RSSR + 2NO⁺

2NO⁺ + 2I⁻ → 2NO + I₂

enquanto eu₃^– não reage com o NO ^3-15. Medições precisas de cada composto são possíveis pelo pré-tratamento de alíquotas amostrais com sulfanilamida acidificada (AS) com ou sem cloreto mercúrico (HgCl₂). Especificamente, o pré-tratamento com AS remove todo ^{o conteúdo NO} ₂. Como consequência, o conteúdo NO medido pelo CLD reflete apenas a soma da concentração de S-NOs e Fe-NOs. A injeção de HgCl₂ em uma alíquota de amostra antes da injeção de AS faz com que o NO₂^– seja liberado pelo S-NO. O tratamento com AS (levando ^{à remoção} nº₂) garante que o teor de NÃO medido só reflete a concentração de Fe-NOs. Uma série de subtrações entre as avaliações permitem calcular a concentração precisa dos três derivados NO²².

Figura 3: Etapas na preparação da amostra para o ensaio i₃^– em ácido acético quemiluminescence. Os passos sequenciais para a preparação do ensaio i₃^– em ácido acético chemiluminescence são ilustrados. É necessário o uso de tubos de centrífuga protegidos pela luz. Os tubos 1, 2 e 3 são os usados para se preparar para o ensaio. Outra alíquota de amostra (tubo 4) é necessária para o ensaio VCl₃ em HCl se for necessária a medição do nitrato (NO₃^–). As etapas são indicadas por números em vermelho. Pré-preenchimento (Passo 1) conforme indicado com soro fisiológico tampão de fosfato (PBS) ou HgCl₂ antes de adicionar o volume amostral. Adicione o volume amostral (2) conforme indicado, vórtice e incubar por 2 minutos à temperatura ambiente (RT). Adicionar (3) PBS ou sulfanilamida acidificada (AS) conforme indicado,vórtice e incubar por 3 min no RT. Execute o ensaio (4). A concentração medida pelo ensaio é a soma da concentração dos compostos relatados sob cada tubo. O tubo número 1 permitirá medições de nitrito (NO₂^–), S-nitrosothiols (S-NO) e complexos ferro-nitrosilo (Fe-NOs) como um único sinal. Para a medição do nitrato (NO₃^–), as amostras devem ser executadas com i₃^– em ácido acético e VCl₃ em ensaios de HCl, e o valor obtido a partir do tubo 1 deve ser subtraído do obtido do tubo 4. *Quantidades sugeridas a serem utilizadas para análise de Hb para determinação de resíduos NO₂^–, S-nitrosohemoglobina e ferro-nitrosibina-hemoglobina. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Para ^{a medição} Nº₃, o cloreto de vanádio (III) (VCl₃) em ácido clorídrico (HCl) é usado para conversão de NO₃^– a NO no vaso de purga, a fim de medir o nº₃^– estequiometricalmente com o CLD:

2 NO₃^–+ 3V⁺³ + 2H₂O → 2NO + 3VO₂⁺ + 4H⁺

Para conseguir uma conversão suficientemente rápida, a reação precisa ser realizada a 90-95 °C. A redução de NO₃^– para NO₂^– é associada à redução de NO₂^– para NO por HCl. O metal vanadium também reduz os S-NOs liberando seu NO moiety^22,36. A concentração final obtida pelo CLD com VCl₃ em HCl reflete a concentração agregada de NO₃^–, NO₂ e outros compostos nitrosados. A subtração do último valor da concentração rendeda com CLD com I₃^– permite o cálculo de Nº₃^– concentração^36,37 (Figura 3).

No ensaio de consumo NO, a liberação contínua de NÃO no recipiente de purga por NENHUM doador como (Z)-1-[2-(2-aminoetil)-N-(2-ammonioethyl)amino]diazen-1-ium-1,2-diolato (DETA-NONOato) gera um sinal estável permitindo quantificar oxiHb sem células nas amostras injetadas. A quantidade de NÃO consumida no vaso de purga está em uma relação estequiométrica com a quantidade de oxicodona na amostra³⁸.

Protocolos para medição de NO₂^–, NO₃^–, S-nitrosothiols, complexos ferro-nitrosilo e NO consumo por Hb livre de células em amostras de plasma são ilustrados. Estudos sobre NÃO no ambiente RBC requerem tratamento amostral específico seguido de cromatografia de exclusão para medir s-no-hb e hb-no extremamente frágeis, juntamente com a determinação da concentração total de Hb^15,22. A preparação da amostra é fundamental na correção da medição. A pré-existência do NO₂^– em H₂O e liberação do Nº₂^– durante o ensaio pode levar à medição de concentrações artificialmente maiores de nenhum derivado, como o S-NO-Hb^14,39. Aspectos importantes da preparação da amostra também são apresentados.

Protocol

Os procedimentos indicados neste protocolo estão de acordo com o conselho de revisão do Hospital Geral de Massachusetts. As amostras de sangue utilizadas foram coletadas durante um estudo anterior e foram desidentifidas para a finalidade atual18. NOTA: Consulte as instruções do fabricante para obter orientações específicas sobre as conexões ideais entre tubos e vidros que constituem o vaso de purga, a lavagem e a manutenção geral. As conexões precisam ser fir…

Representative Results

O ensaio de Não-consumo por Hb livre de células foi utilizado em amostras contendo concentrações conhecidas de oxicodona livre de células (Figura 4). Como um heme de oxyHb stoichiometricamente libera uma molécula NO no ensaio, o oxyHb purificado sem células é usado para construir a curva de calibração para o ensaio (Figura Suplementar 3). A relação dose-resposta entre hb livre de células (medida com um assiiz colorimétrico) e NO cons…

Discussion

Devido à alta sensibilidade, ensaios baseados em chemiluminescência para a determinação de NO e compostos relacionados têm alto risco ^{de contaminação} nº₂. Cada reagente (especialmente a solução ^{de bloqueio NO} ₂) e dilutante (incluindo ddH₂O) usado no experimento devem ser testados para ^{seu conteúdo NO} ₂ para corrigir o sinal de fundo. O nitrito é extremamente reativo com meia-vida em sangue inteiro em torno de 10 minutos e rapidament…

Materials

Acetic Acid	Sigma	45754	500 mL – liquid
Antifoam B Emulsion	Sigma	A5757	250 mL – liquid
DETA NONOate	Cayman	82120	10 mg
Gibco DPBS (1x) no calcium, no magnesium	ThermoFisher	14190144	500 mL
Hydroochloric Acid 37% (1 M)	Sigma	258148	500 mL – liquid
Iodine	SAFC	207772	100 g – solid
Kimwipes	Kimtech	34155
Mercury (II) Chloride ACS reagent> 99.5%	Sigma	215465	100 g – solid (dissolve in water)
Mili-Q Water Purification System	Millipore
Model 705 RN 50 μL syringe	Hamilton	80530	Microliter syringe
Model 802 N 25 μL Syringe	Hamilton	84854	Microliter syringe
N-ethylmaleimide	Sigma	4260	25 g – crystalline
Nitric Oxide Analyzer + Bundle Software – Purge Vessel	Zysense	NOA 280i	Chemiluminescence Detector
Nonidet p-40  (NP-40)	ThermoFisher	85125	10% – 500 mL
Potassium hexacyanoferrate (III) ACS reagent≥ 99%	Sigma	244023	100 g – powder
Potassium Iodide ACS reagent> 99%	Sigma	221945	100 g – solid
Potassium Nitrite cryst. For analysis EMSURE ACS	Supelco	105067	250 g – crystalline
PowerGen 125	Fisher Scientific	14-359-251	Mechanic Homogenizer
RV3 Two Stage Rotary Vane Pump	Edwards	A65201906	Vacuum Pump – Bundled with analyzer
Sodium Heparin – BD Hemogard Clo	BD Biosciences	BD367871	75 USP Units
Sodium hydroxide anhydrous ACS reagent ≥ 97%	Sigma	795429	1 kg – pelletts
Sodium Nitrate ACS reagent ≥ 99%	Sigma	221341	500 g – powder
Sodium nitrite ≥ 99%	Sigma	S2252	500 g – crystalline
Sulfanilamide ≥ 98%	Sigma	S9251	100 g – solid
Vanadium (III) Chloride	Sigma	112393	25 g – solid – Caution (exothermic)
Whatman 1 Filter Paper	Sigma	WHA10010155