Ensayos basados en quimioluminiscencia para la detección de óxido nítrico y sus derivados de la autoxidación y compuestos nitrosados

Summary

Aquí, presentamos protocolos para detectar el óxido nítrico y sus derivados biológicamente relevantes utilizando ensayos basados en quimioluminiscencia con alta sensibilidad.

Abstract

La actividad del óxido nítrico (NO) in vivo es el resultado combinado de sus efectos directos, la acción de sus derivados generados a partir de la autoxidación del NO y los efectos de los compuestos nitrosados. La medición de los metabolitos de NO es esencial para estudiar la actividad del NO tanto a nivel vascular como en otros tejidos, especialmente en los entornos experimentales donde se administra NO exógeno. Los ensayos de quimioluminiscencia a base de ozono permiten mediciones precisas de metabolitos de NO y NO tanto en fluidos (incluidos plasma, homogeneizados de tejidos, cultivos celulares) como en mezclas de gases (por ejemplo, aliento exhalado). El NO reacciona con el ozono para generar dióxido de nitrógeno en un estado excitado. La consiguiente emisión de luz permite la fotodetección y la generación de una señal eléctrica que refleje el contenido de NO de la muestra. Las alícuotas de la misma muestra se pueden usar para medir metabolitos específicos de NO, como nitrato, nitrito, S-nitrosotioles y complejos hierro-nitrosil. Además, el NO consumido por la hemoglobina libre de células también se cuantifica con el análisis de quimioluminiscencia. Se proporciona una ilustración de todas estas técnicas.

Introduction

Desde que Salvador Moncada y los premios Nobel Robert Furchgott, Louis Ignarro y Ferid Murad identificaron el óxido nítrico (NO) como el factor de relajación derivado del endotelial (EDRF) previamente conocido, el papel central del NO se ha establecido en varios mecanismos clave que abarcan toda la biología vascular, las neurociencias, el metabolismo y la respuesta del huésped 1,2,3,4,5,6,7 . La administración exógena de NO gas se ha convertido en un tratamiento establecido para la insuficiencia respiratoria por hipertensión pulmonar en el recién nacido⁸. El gas óxido nítrico también se ha investigado para el tratamiento de la infección por virus sincitial respiratorio (VSR), la malaria y otras enfermedades infecciosas, la lesión por isquemia-reperfusión y para la prevención de la lesión renal aguda en pacientes sometidos a cirugía cardíaca 9,10,11,12. La necesidad de técnicas de medición precisas para evaluar los niveles de NO, sus metabolitos y los de sus proteínas y compuestos objetivo surge de estudios mecanicistas e intervencionistas.

Debido a su alta reactividad, el NO puede sufrir diferentes reacciones dependiendo de la matriz biológica en la que se produzca y/o libere. En ausencia de hemoglobina (Hb) u otras oxihemoproteínas, el NO se oxida casi por completo a nitrito (NO₂^–).

2NO + O₂ → 2NO₂

NO₂ + NO → N₂O₃

N₂O₃ + H₂O → NO₂^– + H⁺

El NO primero se somete a la autoxidación con oxígeno molecular (O₂) para producir dióxido de nitrógeno (NO₂) y reacciona con el propio NO₂ para generar trióxido de dinitrógeno (N₂O₃). Una molécula de N₂O₃ reacciona con el agua (H₂O) para formar dos moléculas de NO₂^– y un protón (H⁺)¹³. Dentro de la sangre total^{, 14,15}, NO y NO 2- se convierten rápidamente en nitrato (NO 3^–) ya que estas moléculas reaccionan ávidamente con los grupos hemo oxidados de Hb [Hb-Fe²⁺-O₂ u oxihemoglobina (oxyHb)] para producir NO₃^–. Esta reacción se combina con la transición del grupo hemo al estado férrico [Hb-Fe³⁺ o metahemoglobina (metHb)]:

Hb-Fe²⁺-O₂ + NO → Hb-Fe³⁺ + NO₃^–

La barrera de glóbulos rojos (RBC) y el espacio inmediatamente adyacente al endotelio son los principales factores que limitan esta reacción y permiten que una pequeña porción del NO liberado por el endotelio actúe como EDRF^16,17. De hecho, se sabe que la Hb libre de células en la circulación interrumpe la vasodilatación en entornos experimentales y clínicos^17,18. Dentro del RBC, dependiendo de la oxigenación y la concentración de NO₂^–, una porción de NO reacciona con la desoxihemoglobina (Hb-Fe²⁺) para formar hierro-nitrosil Hb (Hb-Fe²⁺-NO o HbNO):

Hb-Fe²⁺ + NO → Hb-Fe²⁺-NO

En el RBC^15,17, NO₂^– puede formar Hb-Fe³⁺ reduciendo Hb-Fe²⁺ dando lugar a la liberación de NO, que a su vez se une a Hb-Fe²⁺-O 2 (preferentemente) o Hb-Fe²⁺.

La generación de derivados del NO no debe considerarse estrictamente unidireccional, ya que el NO puede regenerarse a partir de NO₂ ^{y NO} ₃ ^en diversos tejidos y por diferentes enzimas (por ejemplo, por bacterias intestinales o dentro de las mitocondrias, particularmente en condiciones hipóxicas)^19,20.

Una cantidad variable de NO producido (o administrado) conduce a la generación aguas abajo de S-nitrosotioles, principalmente por transnitrosación de tiol de N₂O₃ en presencia de un nucleófilo creando un intermediario donante de NO⁺ (Nuc-NO⁺-NO₂^–):

N₂O₃ + RS^– → RS-NO + NO₂^–

Otra posibilidad para la generación de S-nitrosotioles es la nitrosilación de tioles oxidados (NO reaccionando con un tiol oxidado):

RS• + NO → RS-NO

Este mecanismo y la oxidación directa del tiol por NO₂ podrían ser posibles sólo en condiciones muy específicas que se describen en otra parte²¹. Los S-nitrosotioles van desde moléculas ligeras como S-nitrosoglutatión hasta proteínas grandes que contienen tiol. La S-nitrosohemoglobina (S-NO-Hb) se forma por nitrosación de un grupo tiol de un residuo de cisteína conservado en la cadena β (β93C)²².

La generación y el metabolismo de los S-nitrosotioles forman parte de importantes mecanismos reguladores. Los ejemplos incluyen la regulación del glutatión, las caspasas, el N-metil-D-aspartato (NMDA) y los receptores de rianodina 23,24,25,26,27,28. Anteriormente considerada como un mediador importante de la biología del NO in vivo, la albúmina nitrosada (S-nitroso-albúmina) parece ser un transportador de NO/NO⁺ sin ninguna actividad biológica adicional específica²⁹.

Al medir la concentración de NO y sus derivados de una muestra biológica específica dentro de una matriz biológica, es importante considerar características como la acidez, la oxigenación, la temperatura y la presencia de reactivos. Los ejemplos incluyen donantes de NO exógenos administrados y, en el contexto de la inflamación aguda, peróxido de hidrógeno (H₂O₂) que reacciona con NO₂ que conduce a la generación de concentración sobrenormal de radicales libres como el peroxinitrito (ONOO^–)²¹. Además del método analítico que se emplea, la fase preanalítica de preparación y almacenamiento de muestras es fundamental. Las reacciones posteriores que no representen la actividad de NO in vivo se predecirán, considerarán y bloquearán. Un ejemplo válido es la inestabilidad de S-NO-Hb, que requiere un tratamiento dedicado de muestras de sangre cuando se dirige a la medición²².

Los ensayos basados en quimioluminiscencia son el estándar de oro para detectar los niveles de NO y sus principales metabolitos [NO₂^–, NO₃^–, S-NO y complejos hierro-nitrosil (Fe-NO)] en cualquier fluido biológico, incluidos los homogeneizados tisulares^30,31. Estos métodos se basan en el detector de quimioluminiscencia (CLD), un dispositivo que alberga la reacción de NO con ozono (O₃), generando NO₂ en un estado excitado (NO₂•). La relajación del NO₂• provoca la emisión de un fotón de luz que es detectado por un tubo fotomultiplicador, generando una señal eléctrica que es directamente proporcional al contenido de NO de la mezcla de gases muestreada³². Se representa un esquema simplificado de la CLD.

Figura 1: Esquema simplificado de un detector de quimioluminiscencia para gas de óxido nítrico. La detección basada en quimioluminiscencia de óxido nítrico (NO) es la generación estequiométrica de un fotón por molécula de gas NO que se introduce en el detector de quimioluminiscencia (CLD). La reacción de quimioluminiscencia se obtiene en una cámara designada suministrada con ozono (O3) de un generador interno, que se mantiene a presión negativa mediante conexión con una bomba externa, lo que permite la entrada continua y constante de gas de muestra. La generación de O₃ requiere oxígeno diatómico (O₂) que es suministrado por un tanque de O₂ dedicado conectado con el CLD (otros fabricantes proporcionan CLD que funcionan con aire ambiente). Dentro de la cámara de reacción, cada molécula de gas NO contenida en el gas muestreado reacciona con el oxígeno para producir una molécula de dióxido de nitrógeno en el estado activado (NO₂*). Al volver a su estado fundamental, cada molécula de NO₂* emite un fotón que es detectado por un tubo fotomultiplicador (PMT) ubicado adyacente a la cámara de reacción. El PMT con el amplificador asociado y la unidad central de procesamiento produce una señal proporcional al recuento de fotones y al número de moléculas de NO en la cámara de reacción. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

La entrada de muestra del CLD se puede conectar a un sistema de cristalería que contiene una cámara de reacción para muestras líquidas. El sistema se purga continuamente con un gas inerte como nitrógeno, helio o argón, transfiriendo NO de la cámara de reacción a la CLD. Las muestras en fase líquida se inyectan a través de una membrana dedicada en el recipiente de purga.

Figura 2: Estructura de un recipiente de purga para la detección basada en quimioluminiscencia de gas de óxido nítrico El recipiente de purga (derecha) permite la detección de gas de óxido nítrico (NO) o cualquier otro compuesto que se pueda convertir fácilmente en gas NO cuando se libera de un reactivo en fase líquida. La entrada de gas inerte está conectada a una fuente (tanque) de un gas inerte como Argón, Xeon o nitrógeno diatómico (N₂). La válvula de la aguja (se abre a la izquierda) se utiliza para el control de la presión dentro del recipiente de purga y se puede quitar completamente para limpiar el recipiente. El puerto de inyección está cubierto por una tapa con un tabique de membrana para la inyección de muestra. La membrana debe reemplazarse con frecuencia. Una camisa calentada rodea la cámara de reacción y se conecta a un baño de agua caliente para realizar el ensayo VCl₃ en HCl. La salida del vaso de purga está conectada al detector de quimioluminiscencia (CLD) o a la trampa de NaOH (requerida para VCl₃ en ensayos de HCl). Para drenar el contenido de la cámara de reacción, primero cierre las llaves de paso en la entrada de gas inerte y la salida del recipiente de purga, cierre la válvula de la aguja, retire la tapa en el puerto de inyección y finalmente abra la llave de paso en el drenaje. Se requiere que la trampa de NaOH (izquierda) se coloque en línea entre el recipiente de purga y el CLD si se realiza el ensayo VCl₃ en HCl debido a la corrosividad del HCl. La conexión al CLD siempre requiere que se coloque un filtro dieléctrico de campo intenso (IFD) entre el CLD y la salida del recipiente de purga (o la trampa de NaOH, si se usa). El filtro IFD elimina las partículas en el aire y evita que el líquido pase a través del recipiente de purga. PTFE = politetrafluoroetileno. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Como consecuencia, cualquier compuesto que pueda convertirse en NO a través de una reacción química específica y controlada puede ser detectado con alta sensibilidad en cualquier fluido biológico y homogeneizado tisular²⁴. La medición directa del NO en fase gaseosa a través de la quimioluminiscencia se realiza tanto en entornos experimentales como clínicos. Estas técnicas se describen ampliamente en otra parte 33,34,35. La medición de NO₂^–, S-nitrosotioles, proteínas S-nitrosatadas y Fe-NOs se puede realizar agregando muestras en una mezcla de reacción con triyoduro (I₃^–), que libera estequiométricamente gas NO de todos estos compuestos:

I₃^– → I₂ + I^–

2NO₂⁻ +2I⁻ +4H⁺ → 2NO + I₂ +2H₂O

I₃⁻ + 2RS-NO → 3I⁻ + RSSR + 2NO⁺

2NO⁺ + 2I⁻ → 2NO + I₂

mientras que I₃^– no reacciona con NO ^3-15. Las mediciones precisas de cada compuesto son posibles mediante el tratamiento previo de las alícuotas de muestra con sulfanilamida acidificada (AS) con o sin cloruro mercúrico (HgCl₂). Específicamente, el pretratamiento con AS elimina todo el contenido ^de NO₂. Como consecuencia, el contenido de NO medido por el CLD solo refleja la suma de la concentración de S-NOs y Fe-NOs. La inyección de HgCl₂ en una ^muestra alícuota antes de la inyección de AS hace que S-NO libere NO₂-. El tratamiento con AS (que conduce a ^{la eliminación} de NO₂– ) garantiza que el contenido de NO medido solo refleje la concentración de Fe-NOs. Una serie de restas entre las evaluaciones permiten calcular la concentración precisa de los tres derivados de NO²².

Figura 3: Pasos en la preparación de la muestra para el ensayo de quimioluminiscencia de ácido acético I₃^– in. Se ilustran los pasos secuenciales para la preparación del ensayo de quimioluminiscencia de ácido acético I₃^– in. Se requiere el uso de tubos de centrífuga protegidos contra la luz. Los tubos 1, 2 y 3 son los que se utilizan para prepararse para el ensayo. Se necesita otra alícuota de muestra (tubo 4) para el ensayo VCl₃ en HCl si se requiere la medición de nitrato (NO₃^–). Los pasos se indican con números en rojo. Prellene (Paso 1) como se indica con solución salina tampón de fosfato (PBS) o HgCl₂ antes de agregar el volumen de la muestra. Agregue el volumen de muestra (2) como se indica, vórtice e incube durante 2 min a temperatura ambiente (RT). Agregue (3) PBS o sulfanilamida acidificada (AS) según lo indicado, vórtice e incube durante 3 min a RT. Ejecute el ensayo (4). La concentración medida por el ensayo es la suma de la concentración de los compuestos reportados debajo de cada tubo. El tubo número 1 permitirá mediciones de nitrito (NO₂^–), S-nitrosotioles (S-NO) y complejos hierro-nitrosil (Fe-NOs) como una sola señal. Para la medición del nitrato (NO₃^–), las muestras se ejecutarán con I₃^– en ácido acético y VCl₃ en ensayos de HCl, y el valor obtenido del tubo 1 deberá restarse del obtenido del tubo 4. *cantidades sugeridas para ser utilizadas para el análisis de Hb para la determinación de NO ^2-residual, S-nitrosohemoglobina y hierro-nitrosil-hemoglobina. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Para ^la medición de NO₃, el cloruro de vanadio (III) (VCl₃) en ácido clorhídrico (HCl) se utiliza para la conversión de NO₃ ^a NO en el recipiente de purga con el fin de medir NO₃^– estequiométricamente con la EPC:

2 NO₃^–+ 3V⁺³ + 2H₂O → 2NO + 3VO₂⁺ + 4H⁺

Para lograr una conversión suficientemente rápida, la reacción debe realizarse a 90-95 ° C. La reducción de NO₃ ^{a NO} ₂ ^se combina con la reducción de NO₂ ^a NO por HCl. El metal de vanadio también reduce los S-NO liberando su fracción de NO^22,36. La concentración final obtenida por CLD con VCl₃ en HCl refleja la concentración agregada de NO₃^–, NO₂ y otros compuestos nitrosados. La sustracción de este último valor de la concentración obtenida con CLD con I₃^– permite el cálculo de la concentración de NO₃^{– 36,37} (Figura 3).

En el ensayo de consumo de NO, la liberación continua de NO en el recipiente de purga por donantes de NO como (Z)-1-[2-(2-aminoethyl)-N-(2-ammonioethyl)amino]diazen-1-ium-1,2-diolate (DETA-NONOate) genera una señal estable que permite cuantificar el oxiHb libre de células en las muestras inyectadas. La cantidad de NO consumido en el recipiente de purga está en una relación estequiométrica con la cantidad de oxyHb en la muestra³⁸.

Se ilustran los protocolos para la medición de NO₂^–, NO₃^–, S-nitrosotioles, complejos hierro-nitrosil y no consumo de NO por Hb libre de células en muestras de plasma. Los estudios sobre el NO en el entorno de los glóbulos rojos requieren un tratamiento muestral específico seguido de cromatografía de exclusión para medir S-NO-Hb y Hb-NO extremadamente frágiles junto con la determinación de la concentración total de Hb^15,22. La preparación de la muestra es fundamental para corregir la medición. La preexistencia de NO₂^– en H₂O y la liberación de NO₂^– durante el ensayo pueden conducir a la medición de concentraciones artificialmente más altas de derivados de NO como S-NO-Hb^14,39. También se presentan aspectos importantes de la preparación de la muestra.

Protocol

Los procedimientos indicados en este protocolo están de acuerdo con la junta de revisión del Hospital General de Massachusetts. Las muestras de sangre que se utilizaron habían sido recogidas durante un estudio previo y fueron desidentificadas para el propósito actual18. NOTA: Consulte las instrucciones del fabricante para obtener orientación específica sobre las conexiones óptimas entre los tubos y la cristalería que constituyen el recipiente de purga, el lavado…

Representative Results

El consumo de NO por el ensayo de Hb libre de células se utilizó en muestras que contenían concentraciones conocidas de oxyHb libre de células (Figura 4). Como un hemo de oxyHb libera estequiométricamente una molécula de NO en el ensayo, se utiliza oxyHb libre de células purificadas para construir la curva de calibración para el ensayo (Figura suplementaria 3). La relación dosis-respuesta entre la Hb libre de células (medida con un ensay…

Discussion

Debido a la alta sensibilidad, los ensayos basados en quimioluminiscencia para la determinación de NO y compuestos relacionados tienen un alto riesgo ^{de contaminación por} NO₂. Cada reactivo (especialmente la solución ^{de bloqueo} de NO₂) y diluyente (incluido ddH₂O) utilizado en el experimento debe probarse por su contenido de NO₂^– para corregir la señal de fondo. El nitrito es extremadamente reactivo con una vida media en sangre total alreded…

Materials

Acetic Acid	Sigma	45754	500 mL – liquid
Antifoam B Emulsion	Sigma	A5757	250 mL – liquid
DETA NONOate	Cayman	82120	10 mg
Gibco DPBS (1x) no calcium, no magnesium	ThermoFisher	14190144	500 mL
Hydroochloric Acid 37% (1 M)	Sigma	258148	500 mL – liquid
Iodine	SAFC	207772	100 g – solid
Kimwipes	Kimtech	34155
Mercury (II) Chloride ACS reagent> 99.5%	Sigma	215465	100 g – solid (dissolve in water)
Mili-Q Water Purification System	Millipore
Model 705 RN 50 μL syringe	Hamilton	80530	Microliter syringe
Model 802 N 25 μL Syringe	Hamilton	84854	Microliter syringe
N-ethylmaleimide	Sigma	4260	25 g – crystalline
Nitric Oxide Analyzer + Bundle Software – Purge Vessel	Zysense	NOA 280i	Chemiluminescence Detector
Nonidet p-40  (NP-40)	ThermoFisher	85125	10% – 500 mL
Potassium hexacyanoferrate (III) ACS reagent≥ 99%	Sigma	244023	100 g – powder
Potassium Iodide ACS reagent> 99%	Sigma	221945	100 g – solid
Potassium Nitrite cryst. For analysis EMSURE ACS	Supelco	105067	250 g – crystalline
PowerGen 125	Fisher Scientific	14-359-251	Mechanic Homogenizer
RV3 Two Stage Rotary Vane Pump	Edwards	A65201906	Vacuum Pump – Bundled with analyzer
Sodium Heparin – BD Hemogard Clo	BD Biosciences	BD367871	75 USP Units
Sodium hydroxide anhydrous ACS reagent ≥ 97%	Sigma	795429	1 kg – pelletts
Sodium Nitrate ACS reagent ≥ 99%	Sigma	221341	500 g – powder
Sodium nitrite ≥ 99%	Sigma	S2252	500 g – crystalline
Sulfanilamide ≥ 98%	Sigma	S9251	100 g – solid
Vanadium (III) Chloride	Sigma	112393	25 g – solid – Caution (exothermic)
Whatman 1 Filter Paper	Sigma	WHA10010155