快速重复率荧光计(FRRf)是测量光系统II光生理学和初级生产率的有益方法。在这里,我们描述了一种方案,使用比色皿型FRRf测量底物浮游动物上上生性藻类, Colacium sp.的PSII光生理学。
快速重复率荧光计(FRRf)是测量光系统II(PSII)光生理学和初级生产率的有益方法。虽然FRRf可以测量各种真核藻类和蓝藻的PSII吸收截面(σ PSII),最大光化学效率(Fv / Fm),有效光化学效率(Fq/ Fm‘)和非光化学淬灭(NPQNSV),但迄今为止几乎所有的FRRf研究都集中在浮游植物上。在这里,该协议描述了如何测量在生藻属的PSII光生理学。 Ehrenberg 1834(Euglenophyta),在其附着阶段(附着在浮游动物上),使用比色皿型FRRf。首先,我们估计了底物浮游动物(Scapholeberis mucronata O.F. Müller 1776,Cladocera,Daphniidae)对基线荧光和浮游可乐菌属的σ PSII,Fv / Fm,Fq‘/Fm‘和NPQNSV的影响。为了验证这种方法,我们记录了粘液链球菌附着的Colacium sp.的光生理学测量结果,并将这些结果与其浮游阶段进行了比较。具有代表性的结果表明,该协议如何确定钙(Ca)和锰(Mn)对Colacium sp.光生理学的影响,并确定Mn富集在附着和浮游阶段之间的各种影响。最后,我们讨论了该协议对其他周生藻类的适应性。
叶绿素可变荧光是测量藻类光系统II(PSII)光生理学的有用工具。藻类通过改变其PSII光生理学来应对各种环境压力,例如过量的光照和营养缺乏。快速重复率荧光计 (FRRf) 是测量 PSII 光生理学1,2 和估算初级生产力1,3,4 的常用方法,能够监测浮游植物 PSII 光生理学以及跨宽空间和时间尺度的初级生产力5,6,7。FRRf可以同时测量PSII(σ PSII)吸收截面,反应中心([RCII])浓度,最大光化学效率(Fv / Fm),有效光化学效率(Fq‘/Fm‘)和非光化学淬灭(NPQNSV)(表1)。通常,Fv/Fm 和 Fq′/Fm′ 被定义为 PSII 活性 8,而 NPQNSV 被定义为相对散热能量9。
重要的是,FRRf的单周转(ST)闪光完全降低了初级醌电子受体QA,但不会降低塑性醌池。相反,脉冲幅度调制(PAM)荧光计的多次周转(MT)闪光可以减少两者。与MT方法相比,ST方法具有明显的优势,通过同时测量Fv / Fm,Fq′/ Fm‘,NPQNSV和σ PSII10的恢复动力学来识别NPQNSV的可能起源。迄今为止,已有几种类型的FRRf仪器,如潜水式、比色皿式和流通型。潜水式 FRRf 可在海洋和湖泊中进行原位测量,而比色皿型 FRRf 适用于测量小样品量。流通型通常用于连续测量地表水中浮游植物的光生理学。
鉴于 PAM 荧光计(包括比色皿型)的发展,适用于广泛的受试者11,PAM 荧光计在藻类光生理学研究中仍然比 FRRf 更常见12。例如,尽管这些工具之间的样品室结构和比色皿容量仅略有不同,但比色皿型PAM已应用于浮游植物13,14,15,底栖微藻16,17,18,冰藻19和生化藻类20,而比色皿型FRRf主要应用于浮游植物21,22,23 和有限数量的冰藻群落24,25。鉴于其有效性,比色皿型FRRf同样适用于底栖和表生藻类。因此,扩展其应用将为PSII光生理学提供相当多的见解,特别是对于鲜为人知的生代藻类光生理学。
生代藻类很少受到关注,很少有研究检查它们的PSII光生理学20,26,很可能是因为它们在水生食物网中的作用很小27,28。然而,包括表生性藻类在内的表生元可以对浮游动物群落动态产生积极影响,例如增加繁殖和存活率29,30,以及对过程产生负面影响,例如增加下沉率29,31 和对视觉捕食者的脆弱性32,33,34,35,36.因此,探索控制浮游动物群落中表观生物动力学的环境和生物学因素至关重要。
在生代藻类中,Colacium Ehrenberg 1834(Euglenophyta)是一种常见的淡水藻类群32,37,38,39,具有不同的生命阶段,包括附着(图1A-D),非运动浮游(图1E,F)和运动浮游阶段40,41.在非运动浮游阶段,细胞以单细胞浮游生物,聚集菌落或单层片状菌落的形式存在,被粘液覆盖42。在附着阶段,Colacium sp.使用从细胞前端排泄的粘液37,39,41附着在底物生物(碱性)上,特别是微甲壳类41,43。它们的生命周期还包括从蜕皮的外骨骼或死亡的基底骨骼中分离出来,并与鞭毛一起游泳以找到另一种底物生物体39。浮游和附着阶段都可以通过有丝分裂40增加其种群规模。虽然它们的附着阶段被假设为收集资源的进化特征,如light44和微量元素41,45,46,或作为分散策略27,但关于这些方面的实验证据很少37,41,44,关键附着机制在很大程度上是未知的。例如,Rosowski和Kugrens预计Colacium从基质桡足类41中获得锰(Mn),集中在外骨骼47中。
在这里,我们描述了如何使用比色皿型FRRf测量浮游藻类的PSII光生理学以及用Colacium sp.细胞靶向附着藻类(附着在浮游动物身上)的相关应用方法。我们使用配备三个发光二极管(LED)的Act2系统,它们提供以444 nm,512 nm和633 nm48为中心的闪光激发能量。在这里,444 nm(蓝色)对应于叶绿素a(Chl-a)的吸收峰,而512nm(绿色)和633nm(橙色)分别对应于藻红素和藻蓝蛋白的吸收峰。荧光信号检测峰为682 nm,半带宽为30 nm。由于在自然环境中很难找到Colacium sp.的浮游阶段,因此收集了它们附着的阶段进行实验。在众多的底物生物中,Scapholeberis mucronata O.F. Müller 1776(Branchiopoda,Daphniidae;图1A,B,G)是最容易处理的,因为它们的游泳速度慢,体型大(400-650μm)和独特的行为(倒挂在水面上)。因此,该协议使用附着在S. mucronata上的Colacium sp.作为Colacium-basibiont系统的案例研究。为了避免来自肠道内容物的荧光,S. mucronata被饿死。由于之前的一项研究报告称,来自肠道内容物(摄入的藻类)的荧光信号在40分钟后显示五倍49,我们预计90分钟的饥饿足以最大限度地减少肠道含量荧光影响FRRf测量的可能性,同时对Colacium sp.的实验压力的影响最小,例如营养缺乏。此外,该方案还用于阐明Colacium sp.的附着机理,并确定钙(Ca)和锰(Mn)两种金属如何影响浮游和附着阶段的光生理学。钙以多种方式在光合途径50中起关键作用,并且两种金属都是构建PSII51的析氧复合物所必需的。由于钙和锰高度集中在甲壳类浮游动物47的甲壳中,我们假设如果该生命阶段在附着阶段从S. mucronata获得这些元素,则Colacium sp.光生理学可能对浮游阶段的Ca和Mn富集反应更突出。
该协议首次证明,在自然环境中附着阶段,Colacium sp.的光生理学与其在AF-6介质中的浮游阶段相当。此外,当密度为≤5 inds·mL−1时,饥饿的S. mucronata的肠道内容物不影响基线和Chl-a荧光(图5和图6)。这些结果表明,该协议可以在低底物生物丰度下测量附着阶段Colacium sp.的光生理学,而无需校正。然而,步骤3.2.1-3.2.8?…
The authors have nothing to disclose.
这项工作得到了滋贺县合作研究基金的支持,该基金在日本振兴地区补助金和日本环境省环境研究与技术发展基金(第5-1607号)下,题为“保护水环境健全性的水质和湖底环境研究”。https://www.kantei.go.jp/jp/singi/tiiki/tiikisaisei/souseikoufukin.html。作者要感谢Enago(www.enago.jp)的英语评论。
Acrodisc syringe filter | Pall Corporation, Ann Arbor, MI, USA | 0.2 μm pore size | |
Act2Run | CTG Ltd., West Molesey, UK | ||
Biotin | Wako | 023-08711 | AF-6 medium |
CaCl2·2H2O | Wako | 031-25031 | AF-6 medium |
CaCO3 | Wako | 036-00382 | AF-6 medium |
Citric acid | Wako | 036-05522 | AF-6 medium |
CoCl2·6H2O | Wako | 036-03682 | AF-6 medium |
Concentrated Chlorella | Recenttec, Tokyo, Japan | 20 mg C·mL−1 ; store at 4 °C | |
FastOcean Act2 | CTG Ltd., West Molesey, UK | ||
Fe-citrate | Wako | 093-00952 | AF-6 medium |
FeCl3·6H2O | Wako | 091-00872 | AF-6 medium |
HCLP-880PF | Nippon Medical and Chemical Instruments Co., Ltd., Osaka, Japan |
With LED light bulbs | |
K2HPO4 | Wako | 160-04292 | AF-6 medium |
KH2PO4 | Wako | 167-04241 | AF-6 medium |
MgSO4·7H2O | Wako | 137-00402 | AF-6 medium |
MnCl3·4H2O | Wako | 139-00722 | AF-6 medium |
Na2EDTA | Wako | 343-01861 | AF-6 medium |
Na2MoO4 | Wako | 196-02472 | AF-6 medium |
NaNO3 | Wako | 191-02542 | AF-6 medium |
NH4NO3 | Wako | 015-03231 | AF-6 medium |
Plankton Counter | Matsunami Glass, Osaka, Japan | S6300 | |
Pylex test tube | CTG Ltd., West Molesey, UK | With rim, 16 x 100 mm | |
Vit. B1 | Wako | 203-00851 | AF-6 medium |
Vit. B12 | Wako | 226-00343 | AF-6 medium |
Vit. B6 | Wako | 165-05401 | AF-6 medium |
ZnSO4·7H2O | Wako | 264-00402 | AF-6 medium |