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Biologia

Medición de la fotofisiología de la etapa adjunta de Colacium sp. por un fluorómetro de tasa de repetición rápida tipo Cuvette

Published: November 12, 2021
doi:
10.3791/63108
, , ,
1Lake Biwa Branch Office,National Institute for Environmental Studies, 2Center for Regional Environmental Research,National Institute for Environmental Studies, 3Graduate School of Human Development and Environment,Kobe University, 4Lake Biwa Environmental Research Institute

Summary

El fluorómetro de tasa de repetición rápida (FRRf) es un método beneficioso para medir la fotofisiología del fotosistema II y la productividad primaria. Aquí describimos un protocolo para medir la fotofisiología PSII del alga epizoica, Colacium sp. sobre sustrato zooplancton utilizando FRRf tipo cubeta.

Abstract

El fluorómetro de tasa de repetición rápida (FRRf) es un método beneficioso para medir la fotofisiología del fotosistema II (PSII) y la productividad primaria. Aunque FRRf puede medir la sección transversal de absorción de PSII (σ PSII), la máxima eficiencia fotoquímica (Fv / Fm), la eficiencia fotoquímica efectiva (Fq ′ / Fm ′) y el enfriamiento no fotoquímico (NPQNSV) para varias algas eucariotas y cianobacterias, casi todos los estudios de FRRf hasta la fecha se han centrado en el fitoplancton. Aquí, el protocolo describe cómo medir la fotofisiología PSII de un alga epizoica Colacium sp. Ehrenberg 1834 (Euglenophyta), en su etapa adjunta (unida al zooplancton), utilizando FRRf de tipo cubeta. En primer lugar, estimamos los efectos del zooplancton de sustrato (Scapholeberis mucronata O.F. Müller 1776, Cladocera, Daphniidae) sobre la fluorescencia basal y la σ PSII, Fv/Fm, Fq′/Fm′, y NPQNSV del planctónico Colacium sp. Para validar esta metodología, se registraron las mediciones fotofisiología de Colacium sp. adherido en S. mucronata y se compararon estos resultados con su etapa planctónica. Los resultados representativos mostraron cómo el protocolo podría determinar los efectos del calcio (Ca) y el manganeso (Mn) en la fotofisiología de Colacium sp. e identificar los diversos efectos del enriquecimiento de Mangan entre las etapas adjuntas y planctónicas. Finalmente, discutimos la adaptabilidad de este protocolo a otras algas perifíticas.

Introduction

La fluorescencia variable de clorofila es una herramienta útil para medir la fotofisiología del fotosistema de algas II (PSII). Las algas responden a diversas tensiones ambientales, como el exceso de luz y la deficiencia de nutrientes, alterando su fotofisiología PSII. El fluorómetro de tasa de repetición rápida (FRRf) es un método común para medir la fotofisiología psiI1,2 y estimar la productividad primaria1,3,4, que permite monitorear la fotofisiología psiI del fitoplancton, así como la productividad primaria en amplias escalas espaciales y temporales5,6,7. FRRf puede medir simultáneamente la sección transversal de absorción de PSII (σ PSII), la concentración del centro de reacción ([RCII]), la eficiencia fotoquímica máxima (Fv / Fm), la eficiencia fotoquímica efectiva (Fq ′ / Fm ′) y el enfriamiento no fotoquímico (NPQNSV) (Tabla 1). En general, Fv/Fm y Fq′/Fm′ se definen como actividad PSII8, mientras que NPQNSV se define como energía relativa disipada por calor9.

Es importante destacar que los destellos de rotación única (ST) de FRRf reducen completamente el aceptor primario de electrones de quinona, QA, pero no el grupo de plastoquinona. Por el contrario, los destellos de rotación múltiple (MT) de un fluorómetro de modulación de amplitud de pulso (PAM) pueden reducir ambos. El método ST tiene una clara ventaja sobre el método MT al identificar los posibles orígenes de NPQNSV al medir simultáneamente la cinética de recuperación de Fv / Fm, Fq ′ / Fm ′, NPQNSV y σ PSII10. Hasta la fecha, varios tipos de instrumentos FRRf, como el tipo sumergible, el tipo cuvette y el tipo de flujo a través, están disponibles comercialmente. El FRRf de tipo sumergible permite mediciones in situ en océanos y lagos, mientras que el FRRf de tipo cubeta es adecuado para medir pequeños volúmenes de muestra. El tipo de flujo a través se usa comúnmente para medir continuamente la fotofisiología del fitoplancton en aguas superficiales.

Dado el desarrollo de fluorómetros PAM, incluido el tipo cubeta, para una amplia gama de sujetos11, los fluorómetros PAM siguen siendo más comunes que los FRRf en la investigación de fotofisiología de algas12. Por ejemplo, aunque la estructura de la cámara de muestreo y la capacidad de la cubeta entre estas herramientas solo difieren ligeramente, el PAM tipo cubeta se ha aplicado a fitoplancton13,14,15, microalgas bentónicas16,17,18, algas de hielo19 y algas epizoicas20, mientras que el FRRf de tipo cubeta se ha aplicado principalmente a fitoplancton21,22,23 y un número limitado de comunidades de algas de hielo24,25. Dada su eficacia, el FRRf de tipo cubeta es igualmente aplicable a las algas bentónicas y epizoicas. Por lo tanto, la expansión de su aplicación proporcionará una visión considerable de la fotofisiología PSII, particularmente para la fotofisiología de algas epizoicas menos conocida.

Las algas epizoicas han recibido poca atención, con pocos estudios que examinen su fotofisiología PSII20,26, muy probablemente debido a sus funciones menores en las redes tróficas acuáticas27,28. Sin embargo, los epibiontes, incluidas las algas epizoicas, pueden influir positivamente en la dinámica de la comunidad de zooplancton, como el aumento de las tasas de reproducción y supervivencia29,30, así como impactar negativamente en procesos, como el aumento de la tasa de hundimiento29,31 y la vulnerabilidad a los depredadores visuales32,33,34,35,36 . Por lo tanto, explorar los factores ambientales y biológicos que controlan la dinámica de los epibiontes en las comunidades de zooplancton es crucial.

Entre las algas epizoicas, Colacium Ehrenberg 1834 (Euglenophyta) es un grupo de algas comunes, de agua dulce32,37,38,39 con varias etapas de vida, incluyendo etapas planctónicas adjuntas (Figura 1A-D), planctónicas no móviles (Figura 1E, F) y planctónicas móviles40,41 . Durante la etapa planctónica no móvil, las células viven como plancton unicelular, colonias agregadas o colonias de láminas de una capa, cubiertas por mucílago42. En la etapa de unión, Colacium sp. utiliza mucílago excretado desde el extremo anterior de la célula37,39,41 para adherirse a organismos sustratos (basibionts), particularmente microcrustáceos41,43. Su ciclo de vida también implica desprenderse del exoesqueleto muda o basibionte muerto y nadar con sus flagelos para encontrar otro organismo sustrato39. Tanto la etapa planctónica como la unida pueden aumentar el tamaño de su población en mitosis40. Aunque se presume que su etapa adjunta es un rasgo evolutivo para la recolección de recursos, como la luz44 y los oligoelementos41,45,46, o como una estrategia de dispersión27, se dispone de poca evidencia experimental sobre estos aspectos37,41,44 y los mecanismos clave de unión son en gran parte desconocidos. Por ejemplo, Rosowski y Kugrens esperaban que Colacium obtuviera manganeso (Mn) a partir de copépodos de sustrato41, concentrados en el exoesqueleto47.

Aquí, describimos cómo medir la fotofisiología PSII de algas planctónicas y el método de aplicación relacionado para apuntar a algas adheridas (uniéndose al zooplancton) con células de Colacium sp. utilizando el FRRf de tipo cubeta. Utilizamos el sistema Act2 equipado con tres diodos emisores de luz (LED) que proporcionan energía de excitación de flash centrada en 444 nm, 512 nm y 633 nm48. Aquí, 444 nm (azul) corresponde al pico de absorción de la cromalina a (Chl-a), mientras que 512 nm (verde) y 633 nm (naranja) corresponden a los picos de absorción de ficoeritrina y ficocianina, respectivamente. El pico de detección de señal fluorescente es de 682 nm con medio ancho de banda de 30 nm. Dado que es difícil encontrar la etapa planctónica de Colacium sp. en ambientes naturales, su etapa adjunta se recolectó para los experimentos. Entre los numerosos organismos sustratos, Scapholeberis mucronata O.F. Müller 1776 (Branchiopoda, Daphniidae; Figura 1A, B, G) es una de las más simples de manejar debido a su lenta velocidad de natación, gran tamaño corporal (400-650 μm) y comportamiento único (colgando boca abajo en la superficie del agua). Por lo tanto, este protocolo utiliza Colacium sp. unido en S. mucronata como un estudio de caso del sistema Colacium-basibiont. Para evitar la fluorescencia derivada del contenido intestinal, S. mucronata se murió de hambre. Como un estudio anterior informó que la señal de fluorescencia del contenido intestinal (algas ingeridas) muestra una disminución de cinco veces después de 40 min49, esperábamos que la inanición de 90 min fuera suficiente para minimizar la posibilidad de que la fluorescencia del contenido intestinal afectara la medición de FRRf con efectos mínimos de estrés experimental para Colacium sp., como la deficiencia de nutrientes. Además, este protocolo se aplicó para aclarar el mecanismo de unión de Colacium sp. y determinar cómo dos metales, el calcio (Ca) y el manganeso (Mn) afectan la fotofisiología de las etapas planctónica y adjunta. El calcio juega un papel clave en las vías fotosintéticas50 de múltiples maneras, y ambos metales son necesarios para construir los complejos de evolución de oxígeno de la PSII51. Como el calcio y el manganeso están altamente concentrados en el caparazón del zooplancton de crustáceos47, planteamos la hipótesis de que la fotofisiología de Colacium sp. podría responder más prominentemente al enriquecimiento de Ca y Mn durante la etapa planctónica si esta etapa de la vida obtiene estos elementos de S. mucronata durante la etapa adjunta.

Protocol

1. Muestreo Recoge el agua del lago de la superficie con un cubo. Para apuntar a Colacium sp. unido a S. mucronata (Figura 1A-C) filtra 0.5-10 L de agua de lago utilizando una red de malla de nylon de 100 μm52.NOTA: S. mucronata a menudo se agrega densamente en aguas poco profundas, eutróficas y fangosas, como entre las áreas de juncos (fragmitas). Almacene las muestras concentrada…

Representative Results

No hubo efecto significativo de la fluorescencia basal (Figura 5) o de la fluorescencia Chl-a (Figura 6) por S. mucronata hasta 5 individuos (inds.) mL−1. Sin embargo, Fv/Fm y NPQNSV se vieron significativamente afectados cuando S. mucronata fue de 7,5 inds·mL−1. Por lo tanto, para medir la fotofisiología de Colacium sp. durante la etapa ad…

Discussion

Este protocolo demostró por primera vez que la fotofisiología de Colacium sp. durante la etapa adjunta en un entorno natural es comparable a su etapa planctónica en medio AF-6. Además, el contenido intestinal de S. mucronata hambrienta no afectó la fluorescencia basal y Chl-a cuando la densidad fue ≤5 inds·mL−1 (Figura 5 y Figura 6). Estos resultados sugieren que este protocolo puede medir la fotofisiología de <em…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

La labor contó con el apoyo del Fondo de Investigación Colaborativa de la Prefectura de Shiga titulado “Estudio sobre la calidad del agua y el medio ambiente del fondo de los lagos para la protección de la solidez del medio ambiente acuático” en el marco de la Subvención Japonesa para la Revitalización Regional y el Fondo de Investigación y Desarrollo Tecnológico del Medio Ambiente (Nº 5-1607) del Ministerio de Medio Ambiente del Japón. https://www.kantei.go.jp/jp/singi/tiiki/tiikisaisei/souseikoufukin.html. Los autores desean agradecer a Enago (www.enago.jp) por la revisión en inglés.

Materials

Acrodisc syringe filter Pall Corporation, Ann Arbor, MI, USA 0.2 μm pore size
Act2Run CTG Ltd., West Molesey, UK
Biotin Wako 023-08711 AF-6 medium
CaCl2·2H2O Wako 031-25031 AF-6 medium
CaCO3 Wako 036-00382 AF-6 medium
Citric acid Wako 036-05522 AF-6 medium
CoCl2·6H2O Wako 036-03682 AF-6 medium
Concentrated Chlorella Recenttec, Tokyo, Japan 20 mg C·mL−1 ; store at 4 °C
FastOcean Act2 CTG Ltd., West Molesey, UK
Fe-citrate Wako 093-00952 AF-6 medium
FeCl3·6H2O Wako 091-00872 AF-6 medium
HCLP-880PF Nippon Medical and Chemical Instruments
 Co., Ltd., Osaka, Japan		 With LED light bulbs
K2HPO4 Wako 160-04292 AF-6 medium
KH2PO4 Wako 167-04241 AF-6 medium
MgSO4·7H2O Wako 137-00402 AF-6 medium
MnCl3·4H2O Wako 139-00722 AF-6 medium
Na2EDTA Wako 343-01861 AF-6 medium
Na2MoO4 Wako 196-02472 AF-6 medium
NaNO3 Wako 191-02542 AF-6 medium
NH4NO3 Wako 015-03231 AF-6 medium
Plankton Counter Matsunami Glass, Osaka, Japan S6300
Pylex test tube CTG Ltd., West Molesey, UK With rim, 16 x 100 mm
Vit. B1 Wako 203-00851 AF-6 medium
Vit. B12 Wako 226-00343 AF-6 medium
Vit. B6 Wako 165-05401 AF-6 medium
ZnSO4·7H2O Wako 264-00402 AF-6 medium
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Keywords: PhotophysiologyAttached AlgaeColacium Sp.Cuvette-type Fast Repetition Rate FluorometerZooplanktonScapholeberis MucronataFluorescenceChlorophyll AAF-6 MediumBaseline FluorescencePhotosynthetic ActivityReal-time MeasurementSample Distraction
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Kazama, T., Hayakawa, K., Shimotori, K., Imai, A. Measuring Photophysiology of Attached Stage of Colacium sp. by a Cuvette-Type Fast Repetition Rate Fluorometer. J. Vis. Exp. (177), e63108, doi:10.3791/63108 (2021).
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