Retinale pathofysiologische evaluatie in een rattenmodel
Summary
Diabetische retinopathie is een van de belangrijkste oorzaken van blindheid. Histologie, bloed-retinale barrièreafbraaktest en fluorescentieangiografie zijn waardevolle technieken om de pathofysiologie van het netvlies te begrijpen, wat de efficiënte screening van geneesmiddelen tegen diabetische retinopathie verder zou kunnen verbeteren.
Abstract
Een posterieure segment oogziekte zoals diabetische retinopathie verandert de fysiologie van het netvlies. Diabetische retinopathie wordt gekenmerkt door een netvliesloslating, afbraak van de bloed-retinale barrière (BRB) en retinale angiogenese. Een in vivo rattenmodel is een waardevol experimenteel hulpmiddel om de veranderingen in de structuur en functie van het netvlies te onderzoeken. We stellen drie verschillende experimentele technieken voor in het rattenmodel om morfologische veranderingen van retinale cellen, retinale vasculatuur en gecompromitteerde BRB te identificeren. Retinale histologie wordt gebruikt om de morfologie van verschillende retinale cellen te bestuderen. Ook wordt kwantitatieve meting uitgevoerd door retinale celgetal- en diktemeting van verschillende retinale lagen. Een BRB-afbraaktest wordt gebruikt om de lekkage van extraoculaire eiwitten uit het plasma naar glasachtig weefsel te bepalen als gevolg van de afbraak van BRB. Fluorescentieangiografie wordt gebruikt om angiogenese en lekkage van bloedvaten te bestuderen door retinale vasculatuur te visualiseren met behulp van FITC-dextran-kleurstof.
Introduction
Diabetische retinopathie (DR) is een van de meest complexe secundaire complicaties van diabetes mellitus. Het is ook de belangrijkste oorzaak van vermijdbare blindheid bij de beroepsbevolking wereldwijd. In een recente meta-analyse van 32,4 miljoen blinde mensen waren 830.000 (2,6%) mensen blind als gevolg van DR1. Het aandeel van verlies van gezichtsvermogen toegeschreven aan diabetes stond in 2015 op de zevende plaats met 1,06% (0,15-2,38) wereldwijd2,3.
Diabetische retinopathie wordt gediagnosticeerd door vasculaire afwijkingen in de achterste oculaire weefsels. Klinisch is het verdeeld in twee stadia – Non-Proliferatieve DR (NPDR) en Proliferatieve DR (PDR), gebaseerd op de vascularisatie in het netvlies. Hyperglycemie wordt beschouwd als de krachtige regulator van DR omdat het verschillende routes impliceert die betrokken zijn bij neurodegeneratie4,5, ontsteking6,7 en microvasculatuur8 in het netvlies. Meerdere metabole complicaties geïnduceerd als gevolg van hyperglycemie omvatten de accumulatie van geavanceerde glycatie-eindproducten (AGE’s), polyolroute, hexosamineroute en eiwitkinase-C-route. Deze routes zijn verantwoordelijk voor celproliferatie (endotheelcellen), migratie (pericyten) en apoptose (neurale retinale cellen, pericyten en endotheelcellen) op basis van verschillende stadia van diabetische retinopathie. Deze metabole veranderingen kunnen leiden tot fysiologische veranderingen zoals netvliesloslating, verlies van retinale cellen, afbraak van de bloed-retinale barrière (BRB), aneurysma’s en angiogenese9.
Streptozotocine (STZ) geïnduceerde type-1 diabetes is een gevestigde en goed geaccepteerde praktijk bij ratten voor het evalueren van diabetes pathogenese en de complicaties ervan. Diabetogene effecten van STZ zijn te wijten aan selectieve vernietiging van pancreaseilandjes β-cellen10. Als gevolg hiervan zullen de dieren insulinedeficiëntie, hyperglycemie, polydipsie en polyurie ondergaan, die allemaal kenmerkend zijn voor diabetes mellitus11 bij de mens type 1. Voor ernstige diabetesinductie wordt STZ toegediend met 40-65 mg / kg lichaamsgewicht intraveneus of intraperitoneaal tijdens de volwassenheid. Na ongeveer 72 uur vertonen deze dieren bloedglucosewaarden van meer dan 250 mg / dL10,12.
Om de fysiologische veranderingen van het netvlies als gevolg van neurodegeneratie, ontsteking en angiogenese te begrijpen, moeten verschillende technieken worden geoptimaliseerd in experimentele diermodellen. Structurele en functionele veranderingen in retinale cellen en retinale vaten kunnen worden bestudeerd door verschillende technieken zoals histologie, BRB-afbraaktest en fluorescentieangiografie.
Histologie omvat de studie van de anatomie van cellen, weefsels en organen op microscopisch niveau. Het legt een correlatie tussen de structuur en functie van cellen/weefsel. Verschillende stappen worden uitgevoerd om de microscopische veranderingen in de weefselstructuur te visualiseren en te identificeren, waardoor gezonde en zieke tegenhangers worden vergeleken13. Daarom is het essentieel om elke stap van de histologie zorgvuldig te standaardiseren. Verschillende stappen die betrokken zijn bij retinale histologie zijn fixatie van het monster, trimmen van het monster, uitdroging, opruimen, impregneren met paraffine, paraffine inbedding, sectie en kleuring (Hematoxyline en Eosine kleuring)13,14.
In een gezond netvlies wordt het transport van moleculen over het netvlies gecontroleerd door BRB, bestaande uit endotheelcellen en pericyten aan de binnenkant en retinale pigmentepitheelcellen aan de buitenkant. Innerlijke BRB-endotheelcellen en pericyten beginnen echter te degenereren tijdens de zieke toestand en BRB is ook aangetast15. Door deze BRB-afbraak lekken veel moleculen met een laag molecuulgewicht in glasvocht en netvliesweefsel16. Naarmate de ziekte vordert, lekken veel andere eiwitmoleculen (laag en hoog molecuulgewicht) ook in glasvocht en netvliesweefsel als gevolg van homeostasestoornissen17. Het leidt tot verschillende andere complicaties en uiteindelijk macula-oedeem en blindheid. Vandaar dat het kwantificeren van de eiwitniveaus in het glasvocht en het vergelijken van gezonde en diabetische toestanden BRB in gevaar bracht.
Fluorescentieangiografie is een techniek die wordt gebruikt om de bloedcirculatie van het netvlies en het vaatvlies te bestuderen met behulp van fluorescerende kleurstof. Het wordt gebruikt om vasculatuur van het netvlies en vaatvlies te visualiseren door fluoresceïnekleurstof te injecteren via intraveneuze route of hartinjectie18. Zodra de kleurstof is geïnjecteerd, bereikt deze eerst de retinale slagaders, gevolgd door retinale aderen. Deze circulatie van kleurstof wordt meestal voltooid binnen 5 tot 10 minuten na de injectie van kleurstof19. Het is een belangrijke techniek om verschillende posterieure segment oculaire ziekten te diagnosticeren, waaronder diabetische retinopathie en choroïdale neovascularisatie20. Het helpt bij het detecteren van grote en kleine vasculatuurveranderingen in normale en zieke omstandigheden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Histologie
Retinale histologie wordt uitgevoerd om de morfologische veranderingen van retinale cellen en lagen te visualiseren. Verschillende stappen, waaronder de keuze van de fixatieve oplossing, de fixatieduur, uitdroging en paraffine-impregnatie, moeten worden geoptimaliseerd. De weefselgrootte mag niet groter zijn dan 3 mm, omdat de fixatieve penetratie langzaam wordt. De veelgebruikte 4% paraformaldehyde leidt tot netvliesloslating, zelfs in het gezonde oog vanwege de relatief hoge osmolariteit …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Auteurs willen graag de Indian Council of Medical Research (ICMR; ITR-2020-2882) voor financieringssteun aan Dr. Nirmal J. We willen ook de University Grant of Commission bedanken voor het verstrekken van Junior Research Fellowship aan Manisha Malani en Central Analytical Laboratory Facility, BITS-Pilani, Hyderabad campus voor het verstrekken van infrastructurele faciliteiten.
Materials
| Histology | |||
| Reagents | |||
| Isoflurane | Abbott | Anesthesia agent | |
| Ketamine hydrochloride | Troikaa Pharmaceuticals | Anesthesia agent | |
| Xylazine | Indian Immunologicals Limited | Anesthesia agent | |
| Pentobarbital sodium | Zora Pharma | Euthanesia agent | |
| Fixative solution (1 % formaldehyde, 1.25 % Glutaraldehyde | HiMedia, Avra | MB059, ASG2529 | Prepared in-house |
| Ethanol | Hayman | F204325 | Dehydration |
| Xylene | HiMedia | MB-180 | Clearing of ethanol or paraffin |
| Paraffin wax | HiMedia | GRM10702 | used for embedding tissue |
| Glycerol | HiMedia | TC503 | To prepare albumin coated slides. Glycerol and egg albumin is mixed in 1:1 ratio to coat on slides |
| Hydrochloric acid | Sisco Research laboratories Pvt. Ltd. | 65955 | For preparation of 1 % acid alcohol |
| Acetic acid | HiMedia | AS119 | For preparation of eosin |
| Scotts water | Leica | 3802900 | Bluing reagent |
| Papanicolaou's solution 1b Hematoxylin solution | Sigma | 1.09254.0500 | Staining of nuclei |
| Eosin | HiMedia | GRM115 | Staining of cytoplasm, 0.25 % solution was prepared in-house |
| DPX Mountant media | Sigma | 6522 | Visualization and protection of retinal sections |
| Equipments | |||
| Glassware | Borosil | ||
| Corneal forcep | Stephens Instruments | S5-1200 | Dissection |
| Colibri forcep | Stephens Instruments | S5-1135 | Dissection |
| Curved micro scissor | Stephens Instruments | S7-1311 | Dissection |
| Vannas scissor | Stephens Instruments | S7-1387 | Dissection |
| Iris scissor | Stephens Instruments | S7-1015 | Dissection |
| Cassettes | HiMedia | PW1292 | To hold tissue during histology processing |
| Water bath | GT Sonic | GT Sonic-D9 | Temperature maintenance |
| Paraffin embedding station | Myr | EC 350 | Preparation of paraffin blocks |
| Microtome | Zhengzhou Nanbei Instrument Equipment Co., Ltd. | YD-335A | Sectioning |
| Blades | Leica | Leica 818 | Sectioning |
| Slides | HiMedia | BG005 | Holding paraffin-tissue sections |
| Coverslips | HiMedia | BG014C | To cover tissue after adding mounting media |
| Blood Retinal Barrier breakdown | |||
| Reagents | |||
| Isoflurane | Abbott | B506 | Anesthesia |
| Dry ice | Not applicable | Not applicable | Dissection |
| Bradford reagent | Sigma | B6916 | Protein quantification |
| Equipments | |||
| Corneal forcep | Stephens Instruments | S5-1200 | Dissection |
| Colibri forcep | Stephens Instruments | S5-1135 | Dissection |
| Curved micro scissor | Stephens Instruments | S7-1311 | Dissection |
| Vannas scissor | Stephens Instruments | S7-1387 | Dissection |
| Iris scissor | Stephens Instruments | S7-1015 | Dissection |
| Glassware | Borosil | Not applicable | |
| EDTA coated tubes | J.K Diagnostics | Not applicable | Separate plasma from whole blood |
| Homogenization tubes | MP Biomedicals | SKU: 115076200-CF | Homogenization of vitreous |
| Homogenization caps | MP Biomedicals | SKU: 115063002-CF | Homogenization of vitreous |
| Glass beads | MP Biomedicals | SKU: 116914801 | Homogenization of vitreous |
| Homogeniser | Bertin Instruments | P000673-MLYS0-A | Homogenization of vitreous |
| 96-well plate – Transparent | Grenier | GN655101 | Protein quantification |
| Plate reader | Molecular devices | SpectrMax M4 | Absorbance measurement |
| Centrifuge | REMI | CPR240 Plus | Centrifugation |
| Fluorescence Angiography | |||
| Reagents | |||
| Isoflurane | Abbott | B506 | Anesthesia |
| FITC-dextran 70 kD (FITC, Dextran, Dibutylin dilaurate, DMSO | FITC, Dextran and Dibutylin dilaurate from Sigma; DMSO from HiMedia | FITC-F3651,Dextran-31390,Dibutylin dilaurate -29123, DMSO-TC185 | Prepared in-house |
| Fluoroshied | Sigma | F6182 | Anti-fading mounting medium |
| Equipments | |||
| Corneal forcep | Stephens Instruments | S5-1200 | Dissection |
| Colibri forcep | Stephens Instruments | S5-1135 | Dissection |
| Curved micro scissor | Stephens Instruments | S7-1311 | Dissection |
| Vannas scissor | Stephens Instruments | S7-1387 | Dissection |
| Iris scissor | Stephens Instruments | S7-1015 | Dissection |
| Glassware | Borosil | Not applicable | |
| Slides | HiMedia | BG005 | Flatmount preparation |
| Coverslips | HiMedia | BG014C | To cover tissue after adding mounting media |
| Confocal microscope | Leica | DMi8 | Visualization of flatmount |
Riferimenti
- Jonas, J. B., Sabanayagam, C. Epidemiology and risk factors for diabetic retinopathy. Diabetic Retinopathy and Cardiovascular Disease. 27, 20-37 (2019).
- Pandova, M. G. . Visual Impairment and Blindness. , (2019).
- Mokdad, A. H., et al. Global, regional, national, and subnational big data to inform health equity research: perspectives from the Global Burden of Disease Study 2017. Ethnicity & Disease. 29, 159-172 (2019).
- Barber, A. J., et al. Neural apoptosis in the retina during experimental and human diabetes. Early onset and effect of insulin. The Journal of Clinical Investigation. 102 (4), 783-791 (1998).
- El-Asrar, A. M. A., Dralands, L., Missotten, L., Al-Jadaan, I. A., Geboes, K. Expression of apoptosis markers in the retinas of human subjects with diabetes. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 45 (8), 2760-2766 (2004).
- Schröder, S., Palinski, W., Schmid-Schönbein, G. Activated monocytes and granulocytes, capillary nonperfusion, and neovascularization in diabetic retinopathy. The American Journal of Pathology. 139 (1), 81 (1991).
- Miyamoto, K., et al. Prevention of leukostasis and vascular leakage in streptozotocin-induced diabetic retinopathy via intercellular adhesion molecule-1 inhibition. Proceedings of the National Academy of Sciences. 96 (19), 10836-10841 (1999).
- Bhanushali, D., et al. Linking retinal microvasculature features with severity of diabetic retinopathy using optical coherence tomography angiography. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 57 (9), 519-525 (2016).
- Wang, W., Lo, A. C. Diabetic retinopathy: pathophysiology and treatments. International Journal of Molecular Sciences. 19 (6), 1816 (2018).
- Akbarzadeh, A., et al. Induction of diabetes by streptozotocin in rats. Indian Journal of Clinical Biochemistry. 22 (2), 60-64 (2007).
- Weiss, R. B. Streptozocin: a review of its pharmacology, efficacy, and toxicity. Cancer Treatment Reports. 66 (3), 427-438 (1982).
- Karunanayake, E. H., Hearse, D. J., Mellows, G. The metabolic fate and elimination of streptozotocin. Biochemical Society Transactions. 3 (3), 410-414 (1975).
- Luna, L. G. . Manual of Histologic Staining Methods of the Armed Forces Institute of Pathology. , (1968).
- Okunlola, A., et al. Histological studies on the retina and cerebellum of Wistar rats treated with Arteether. Journal of Morphological Sciences. 31 (01), 028-032 (2014).
- Wallow, I., Engerman, R. Permeability and patency of retinal blood vessels in experimental diabetes. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 16 (5), 447-461 (1977).
- do Cartmo, A., Ramos, P., Reis, A., Proença, R., Cunha-Vaz, J. Breakdown of the inner and outer blood retinal barrier in streptozotocin-induced diabetes. Experimental Eye Research. 67 (5), 569-575 (1998).
- Shires, T., Faeth, J., Pulido, J. Protein levels in the vitreous of rats with streptozotocin-induced diabetes mellitus. Brain Research Bulletin. 30 (1-2), 85-90 (1993).
- D’amato, R., Wesolowski, E., Smith, L. H. Microscopic visualization of the retina by angiography with high-molecular-weight fluorescein-labeled dextrans in the mouse. Microvascular Research. 46 (2), 135-142 (1993).
- Gupta, D. Fluorescein angiography refresher course: Here’s how to interpret the findings of this useful diagnostic tool. Review of Optometry. 138 (11), 60-65 (2001).
- Edelman, J. L., Castro, M. R. Quantitative image analysis of laser-induced choroidal neovascularization in rat. Experimental Eye Research. 71 (5), 523-533 (2000).
- Szabó, K., et al. Histological evaluation of diabetic neurodegeneration in the retina of Zucker diabetic fatty (ZDF) rats. Scientific Reports. 7 (1), 1-17 (2017).
- Margo, C. E., Lee, A. Fixation of whole eyes: the role of fixative osmolarity in the production of tissue artifact. Graefe’s Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 233 (6), 366-370 (1995).
- Tokuda, K., et al. Optimization of fixative solution for retinal morphology: a comparison with Davidson’s fixative and other fixation solutions. Japanese Journal of Ophthalmology. 62 (4), 481-490 (2018).
- Luna, L. G. . Manual of Histologic Staining Methods of the Armed Forces Institute of Pathology. Third edition. , (1968).
- Skeie, J. M., Tsang, S. H., Mahajan, V. B. Evisceration of mouse vitreous and retina for proteomic analyses. Journal of Visualized Experiments. (50), e2795 (2011).
- D’Amato, R., Wesolowski, E., Smith, L. E. Microscopic visualization of the retina by angiography with high-molecular-weight fluorescein-labeled dextrans in the mouse. Microvascular Research. 46 (2), 135-142 (1993).
- Atkinson, E. G., Jones, S., Ellis, B. A., Dumonde, D. C., Graham, E. Molecular size of retinal vascular leakage determined by FITC-dextran angiography in patients with posterior uveitis. Eye (Lond). 5, 440-446 (1991).
