הערכה פתופיפיזיולוגית של רשתית במודל חולדה
Summary
רטינופתיה סוכרתית היא אחד הגורמים המובילים לעיוורון. היסטולוגיה, בדיקת פירוק מחסום רשתית דם, ואנגיוגרפיה פלואורסצנטית הן טכניקות בעלות ערך להבנת הפתופיזיולוגיה של הרשתית, אשר יכול לשפר עוד יותר את ההקרנה היעילה של סמים נגד רטינופתיה סוכרתית.
Abstract
מחלת עיניים אחורית כמו רטינופתיה סוכרתית משנה את הפיזיולוגיה של הרשתית. רטינופתיה סוכרתית מאופיינת על ידי ניתוק רשתית, פירוק של מחסום רשתית הדם (BRB), ו אנגיוגנזה ברשתית. מודל חולדת in vivo הוא כלי ניסיוני בעל ערך כדי לבחון את השינויים במבנה ובתפקוד של הרשתית. אנו מציעים שלוש טכניקות ניסיוניות שונות במודל החולדה כדי לזהות שינויים מורפולוגיים של תאי רשתית, כלי רשתית, ו BRB נפגע. היסטולוגיה רשתית משמשת לחקר המורפולוגיה של תאי רשתית שונים. כמו כן, מדידה כמותית מבוצעת על ידי ספירת תאי רשתית ומדידת עובי של שכבות רשתית שונות. בדיקת פירוק BRB משמשת כדי לקבוע את הדליפה של חלבונים חוץ-עיניים מהפלזמה לרקמה הזגוגית עקב התמוטטות של BRB. אנגיוגרפיה פלואורסצנטית משמשת לחקר אנגיוגנזה ודליפת כלי דם על ידי הדמיית כלי דם ברשתית באמצעות צבע FITC-dextran.
Introduction
רטינופתיה סוכרתית (DR) היא אחד הסיבוכים המשניים המורכבים ביותר של סוכרת. זהו גם הגורם המוביל לעיוורון ניתן למניעה באוכלוסייה בגיל העבודה ברחבי העולם. במטא-אנליזה שנערכה לאחרונה בקרב 32.4 מיליון עיוורים, 830,000 (2.6%) אנשים היו עיוורים עקב DR1. שיעור אובדן הראייה המיוחס לסוכרת דורג במקום השביעי בשנת 2015 עם 1.06% (0.15-2.38) ברחבי העולם 2,3.
רטינופתיה סוכרתית מאובחנת על ידי חריגות בכלי הדם ברקמות העין האחוריות. מבחינה קלינית, הוא מחולק לשני שלבים – DR לא שגשוג (NPDR) ו DR שגשוג (PDR), המבוסס על כלי הדם ברשתית. היפרגליקמיה נחשבת הרגולטור החזק של DR כפי שהוא מסבך מספר מסלולים המעורבים neurodegeneration4,5, דלקת6,7, ו microvasculature8 ברשתית. סיבוכים מטבוליים מרובים הנגרמים עקב היפרגליקמיה כוללים הצטברות של מוצרי קצה גליקציה מתקדמים (AGEs), מסלול פוליאול, מסלול הקסוסמין, מסלול קינאז-C חלבון. מסלולים אלה אחראים על התפשטות התאים (תאי אנדותל), הגירה (pericytes) ואפופטוזיס (תאי רשתית עצבית, pericytes, ותאי אנדותל) המבוססים על שלבים שונים של רטינופתיה סוכרתית. שינויים מטבוליים אלה יכולים להוביל לשינויים פיזיולוגיים כגון ניתוק רשתית, אובדן תאי רשתית, פירוק מחסום רשתית הדם (BRB), מפרצות, ו אנגיוגנזה9.
סטרפטוזוטוצין (STZ) הנגרמת על ידי סוכרת מסוג 1 היא פרקטיקה מבוססת ומקובלת בחולדות להערכת סוכרת פתוגנזה וסיבוכיה. ההשפעות Diabetogenic של STZ נובעים הרס סלקטיבי של אי הלבלב β תאים10. כתוצאה מכך, בעלי החיים יעברו מחסור באינסולין, היפרגליקמיה, פולידיפסיה ופוליאוריה, שכולם אופייניים לסוכרת מסוג 1 אנושית11. עבור אינדוקציה סוכרת חמורה, STZ מנוהל ב 40-65 מ”ג /ק”ג משקל גוף תוך ורידי או תוך-פריטוני במהלך הבגרות. לאחר כ 72 שעות, בעלי חיים אלה מציגים רמות הגלוקוז בדם גדול מ 250 מ”ג / dL10,12.
כדי להבין את השינויים הפיזיולוגיים של הרשתית עקב ניוון עצבי, דלקת, אנגיוגנזה, טכניקות שונות צריך להיות אופטימיזציה במודלים בעלי חיים ניסיוניים. שינויים מבניים ותפקודיים בתאי רשתית וכלי רשתית ניתן ללמוד על ידי טכניקות שונות כגון היסטולוגיה, בדיקת התמוטטות BRB, אנגיוגרפיה פלואורסצנטית.
היסטולוגיה כוללת את חקר האנטומיה של תאים, רקמות ואיברים ברמה מיקרוסקופית. זה יוצר מתאם בין המבנה והתפקוד של תאים / רקמה. מספר שלבים מבוצעים כדי לדמיין ולזהות את השינויים המיקרוסקופיים במבנה הרקמה, ובכך להשוות עמיתים בריאים וחולים13. לפיכך, חיוני לתקנן כל שלב של היסטולוגיה בקפדנות. שלבים שונים המעורבים בהיסטולוגיה של הרשתית הם קיבוע הדגימה, חיתוך הדגימה, התייבשות, ניקוי, הספגה עם פרפין, הטמעת פרפין, חתך וכתמים (כתמי המטוקסילין ואאוזין)13,14.
ברשתית בריאה, הובלת מולקולות על פני הרשתית נשלטת על ידי BRB, המורכב מתאי אנדותל ופריקים בצד הפנימי, ותאי אפיתל פיגמנט רשתית בצד החיצוני. עם זאת, תאי אנדותל BRB פנימיים ו pericytes להתחיל ניוון במהלך המצב החולה, ו BRB נפגע גם 15. עקב התמוטטות BRB זו, מולקולות משקל מולקולרי נמוך רבות דולפות לתוך רקמת הזגוגית והרשתית16. ככל שהמחלה מתקדמת, מולקולות חלבון רבות אחרות (משקל מולקולרי נמוך וגבוה) דולפות גם הן לרקמת הזגוגית והרשתית עקב הפרעות הומאוסטזיס17. זה מוביל לסיבוכים שונים אחרים ובסופו של דבר בצקת מקולרית ועיוורון. לפיכך, כימות רמות החלבון בזגוגית והשוואת מצבים בריאים וסוכרתיים מדדים נפגע BRB.
אנגיוגרפיה פלואורסצנטית היא טכניקה המשמשת לחקר זרימת הדם של הרשתית והכורואיד באמצעות צבע פלואורסצנטי. הוא משמש כדי לדמיין vasculature של הרשתית choroid על ידי הזרקת צבע פלואורסצ’ין באמצעות מסלול תוך ורידי או הזרקת לב18. ברגע שהצבע מוזרק, הוא מגיע תחילה לעורקי הרשתית, ואחריו ורידים ברשתית. מחזור זה של צבע הושלם בדרך כלל בתוך 5 עד 10 דקות מן הזרקת צבע19. זוהי טכניקה חשובה לאבחון מחלות עיניים שונות בחלק האחורי, כולל רטינופתיה סוכרתית וניאווסקולריזציה choroidal20. זה עוזר לזהות שינויים כלליים וקטנים בכלי דם גדולים וקטנים בתנאים נורמליים וחולים.
Protocol
Representative Results
Discussion
היסטולוגיה
היסטולוגיה רשתית מבוצעת כדי לדמיין את השינויים המורפולוגיים של תאי רשתית ושכבות. צעדים שונים, כולל בחירה של פתרון קבוע, משך קיבעון, התייבשות, והספגת פרפין, צריך להיות ממוטב. גודל הרקמה לא יעלה על 3 מ”מ, כמו חדירה קבועה הופכת איטית. 4% paraformaldehyde נפוץ מוביל ניתוק רשתית אפיל?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחברים רוצים להכיר המועצה ההודית למחקר רפואי (ICMR; ITR-2020-2882) למימון תמיכה לד”ר נירמל ג’יי. ברצוננו גם להודות למענק האוניברסיטה של הנציבות על מתן מלגת מחקר זוטרה למנשה מלאני ולמתקן המעבדה האנליטית המרכזית, BITS-Pilani, קמפוס היידראבאד על אספקת מתקן תשתיתי.
Materials
| Histology | |||
| Reagents | |||
| Isoflurane | Abbott | Anesthesia agent | |
| Ketamine hydrochloride | Troikaa Pharmaceuticals | Anesthesia agent | |
| Xylazine | Indian Immunologicals Limited | Anesthesia agent | |
| Pentobarbital sodium | Zora Pharma | Euthanesia agent | |
| Fixative solution (1 % formaldehyde, 1.25 % Glutaraldehyde | HiMedia, Avra | MB059, ASG2529 | Prepared in-house |
| Ethanol | Hayman | F204325 | Dehydration |
| Xylene | HiMedia | MB-180 | Clearing of ethanol or paraffin |
| Paraffin wax | HiMedia | GRM10702 | used for embedding tissue |
| Glycerol | HiMedia | TC503 | To prepare albumin coated slides. Glycerol and egg albumin is mixed in 1:1 ratio to coat on slides |
| Hydrochloric acid | Sisco Research laboratories Pvt. Ltd. | 65955 | For preparation of 1 % acid alcohol |
| Acetic acid | HiMedia | AS119 | For preparation of eosin |
| Scotts water | Leica | 3802900 | Bluing reagent |
| Papanicolaou's solution 1b Hematoxylin solution | Sigma | 1.09254.0500 | Staining of nuclei |
| Eosin | HiMedia | GRM115 | Staining of cytoplasm, 0.25 % solution was prepared in-house |
| DPX Mountant media | Sigma | 6522 | Visualization and protection of retinal sections |
| Equipments | |||
| Glassware | Borosil | ||
| Corneal forcep | Stephens Instruments | S5-1200 | Dissection |
| Colibri forcep | Stephens Instruments | S5-1135 | Dissection |
| Curved micro scissor | Stephens Instruments | S7-1311 | Dissection |
| Vannas scissor | Stephens Instruments | S7-1387 | Dissection |
| Iris scissor | Stephens Instruments | S7-1015 | Dissection |
| Cassettes | HiMedia | PW1292 | To hold tissue during histology processing |
| Water bath | GT Sonic | GT Sonic-D9 | Temperature maintenance |
| Paraffin embedding station | Myr | EC 350 | Preparation of paraffin blocks |
| Microtome | Zhengzhou Nanbei Instrument Equipment Co., Ltd. | YD-335A | Sectioning |
| Blades | Leica | Leica 818 | Sectioning |
| Slides | HiMedia | BG005 | Holding paraffin-tissue sections |
| Coverslips | HiMedia | BG014C | To cover tissue after adding mounting media |
| Blood Retinal Barrier breakdown | |||
| Reagents | |||
| Isoflurane | Abbott | B506 | Anesthesia |
| Dry ice | Not applicable | Not applicable | Dissection |
| Bradford reagent | Sigma | B6916 | Protein quantification |
| Equipments | |||
| Corneal forcep | Stephens Instruments | S5-1200 | Dissection |
| Colibri forcep | Stephens Instruments | S5-1135 | Dissection |
| Curved micro scissor | Stephens Instruments | S7-1311 | Dissection |
| Vannas scissor | Stephens Instruments | S7-1387 | Dissection |
| Iris scissor | Stephens Instruments | S7-1015 | Dissection |
| Glassware | Borosil | Not applicable | |
| EDTA coated tubes | J.K Diagnostics | Not applicable | Separate plasma from whole blood |
| Homogenization tubes | MP Biomedicals | SKU: 115076200-CF | Homogenization of vitreous |
| Homogenization caps | MP Biomedicals | SKU: 115063002-CF | Homogenization of vitreous |
| Glass beads | MP Biomedicals | SKU: 116914801 | Homogenization of vitreous |
| Homogeniser | Bertin Instruments | P000673-MLYS0-A | Homogenization of vitreous |
| 96-well plate – Transparent | Grenier | GN655101 | Protein quantification |
| Plate reader | Molecular devices | SpectrMax M4 | Absorbance measurement |
| Centrifuge | REMI | CPR240 Plus | Centrifugation |
| Fluorescence Angiography | |||
| Reagents | |||
| Isoflurane | Abbott | B506 | Anesthesia |
| FITC-dextran 70 kD (FITC, Dextran, Dibutylin dilaurate, DMSO | FITC, Dextran and Dibutylin dilaurate from Sigma; DMSO from HiMedia | FITC-F3651,Dextran-31390,Dibutylin dilaurate -29123, DMSO-TC185 | Prepared in-house |
| Fluoroshied | Sigma | F6182 | Anti-fading mounting medium |
| Equipments | |||
| Corneal forcep | Stephens Instruments | S5-1200 | Dissection |
| Colibri forcep | Stephens Instruments | S5-1135 | Dissection |
| Curved micro scissor | Stephens Instruments | S7-1311 | Dissection |
| Vannas scissor | Stephens Instruments | S7-1387 | Dissection |
| Iris scissor | Stephens Instruments | S7-1015 | Dissection |
| Glassware | Borosil | Not applicable | |
| Slides | HiMedia | BG005 | Flatmount preparation |
| Coverslips | HiMedia | BG014C | To cover tissue after adding mounting media |
| Confocal microscope | Leica | DMi8 | Visualization of flatmount |
Riferimenti
- Jonas, J. B., Sabanayagam, C. Epidemiology and risk factors for diabetic retinopathy. Diabetic Retinopathy and Cardiovascular Disease. 27, 20-37 (2019).
- Pandova, M. G. . Visual Impairment and Blindness. , (2019).
- Mokdad, A. H., et al. Global, regional, national, and subnational big data to inform health equity research: perspectives from the Global Burden of Disease Study 2017. Ethnicity & Disease. 29, 159-172 (2019).
- Barber, A. J., et al. Neural apoptosis in the retina during experimental and human diabetes. Early onset and effect of insulin. The Journal of Clinical Investigation. 102 (4), 783-791 (1998).
- El-Asrar, A. M. A., Dralands, L., Missotten, L., Al-Jadaan, I. A., Geboes, K. Expression of apoptosis markers in the retinas of human subjects with diabetes. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 45 (8), 2760-2766 (2004).
- Schröder, S., Palinski, W., Schmid-Schönbein, G. Activated monocytes and granulocytes, capillary nonperfusion, and neovascularization in diabetic retinopathy. The American Journal of Pathology. 139 (1), 81 (1991).
- Miyamoto, K., et al. Prevention of leukostasis and vascular leakage in streptozotocin-induced diabetic retinopathy via intercellular adhesion molecule-1 inhibition. Proceedings of the National Academy of Sciences. 96 (19), 10836-10841 (1999).
- Bhanushali, D., et al. Linking retinal microvasculature features with severity of diabetic retinopathy using optical coherence tomography angiography. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 57 (9), 519-525 (2016).
- Wang, W., Lo, A. C. Diabetic retinopathy: pathophysiology and treatments. International Journal of Molecular Sciences. 19 (6), 1816 (2018).
- Akbarzadeh, A., et al. Induction of diabetes by streptozotocin in rats. Indian Journal of Clinical Biochemistry. 22 (2), 60-64 (2007).
- Weiss, R. B. Streptozocin: a review of its pharmacology, efficacy, and toxicity. Cancer Treatment Reports. 66 (3), 427-438 (1982).
- Karunanayake, E. H., Hearse, D. J., Mellows, G. The metabolic fate and elimination of streptozotocin. Biochemical Society Transactions. 3 (3), 410-414 (1975).
- Luna, L. G. . Manual of Histologic Staining Methods of the Armed Forces Institute of Pathology. , (1968).
- Okunlola, A., et al. Histological studies on the retina and cerebellum of Wistar rats treated with Arteether. Journal of Morphological Sciences. 31 (01), 028-032 (2014).
- Wallow, I., Engerman, R. Permeability and patency of retinal blood vessels in experimental diabetes. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 16 (5), 447-461 (1977).
- do Cartmo, A., Ramos, P., Reis, A., Proença, R., Cunha-Vaz, J. Breakdown of the inner and outer blood retinal barrier in streptozotocin-induced diabetes. Experimental Eye Research. 67 (5), 569-575 (1998).
- Shires, T., Faeth, J., Pulido, J. Protein levels in the vitreous of rats with streptozotocin-induced diabetes mellitus. Brain Research Bulletin. 30 (1-2), 85-90 (1993).
- D’amato, R., Wesolowski, E., Smith, L. H. Microscopic visualization of the retina by angiography with high-molecular-weight fluorescein-labeled dextrans in the mouse. Microvascular Research. 46 (2), 135-142 (1993).
- Gupta, D. Fluorescein angiography refresher course: Here’s how to interpret the findings of this useful diagnostic tool. Review of Optometry. 138 (11), 60-65 (2001).
- Edelman, J. L., Castro, M. R. Quantitative image analysis of laser-induced choroidal neovascularization in rat. Experimental Eye Research. 71 (5), 523-533 (2000).
- Szabó, K., et al. Histological evaluation of diabetic neurodegeneration in the retina of Zucker diabetic fatty (ZDF) rats. Scientific Reports. 7 (1), 1-17 (2017).
- Margo, C. E., Lee, A. Fixation of whole eyes: the role of fixative osmolarity in the production of tissue artifact. Graefe’s Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 233 (6), 366-370 (1995).
- Tokuda, K., et al. Optimization of fixative solution for retinal morphology: a comparison with Davidson’s fixative and other fixation solutions. Japanese Journal of Ophthalmology. 62 (4), 481-490 (2018).
- Luna, L. G. . Manual of Histologic Staining Methods of the Armed Forces Institute of Pathology. Third edition. , (1968).
- Skeie, J. M., Tsang, S. H., Mahajan, V. B. Evisceration of mouse vitreous and retina for proteomic analyses. Journal of Visualized Experiments. (50), e2795 (2011).
- D’Amato, R., Wesolowski, E., Smith, L. E. Microscopic visualization of the retina by angiography with high-molecular-weight fluorescein-labeled dextrans in the mouse. Microvascular Research. 46 (2), 135-142 (1993).
- Atkinson, E. G., Jones, S., Ellis, B. A., Dumonde, D. C., Graham, E. Molecular size of retinal vascular leakage determined by FITC-dextran angiography in patients with posterior uveitis. Eye (Lond). 5, 440-446 (1991).
