एक चूहे मॉडल में रेटिना Pathophysiological मूल्यांकन
Summary
डायबिटिक रेटिनोपैथी अंधापन के प्रमुख कारणों में से एक है। हिस्टोलॉजी, रक्त-रेटिना बाधा टूटने परख, और प्रतिदीप्ति एंजियोग्राफी रेटिना के पैथोफिजियोलॉजी को समझने के लिए मूल्यवान तकनीकें हैं, जो मधुमेह रेटिनोपैथी के खिलाफ कुशल दवा स्क्रीनिंग को और बढ़ा सकती हैं।
Abstract
डायबिटिक रेटिनोपैथी जैसी एक पश्चवर्ती खंड आंख की बीमारी रेटिना के शरीर विज्ञान को बदल देती है। मधुमेह रेटिनोपैथी को रेटिना टुकड़ी, रक्त-रेटिना बाधा (बीआरबी) के टूटने और रेटिना एंजियोजेनेसिस की विशेषता है। एक इन विवो चूहा मॉडल रेटिना की संरचना और कार्य में परिवर्तन की जांच करने के लिए एक मूल्यवान प्रयोगात्मक उपकरण है। हम रेटिना कोशिकाओं, रेटिना वास्कुलचर, और समझौता किए गए बीआरबी के रूपात्मक परिवर्तनों की पहचान करने के लिए चूहे के मॉडल में तीन अलग-अलग प्रयोगात्मक तकनीकों का प्रस्ताव करते हैं। रेटिना हिस्टोलॉजी का उपयोग विभिन्न रेटिना कोशिकाओं की आकृति विज्ञान का अध्ययन करने के लिए किया जाता है। इसके अलावा, मात्रात्मक माप रेटिना सेल गिनती और विभिन्न रेटिना परतों की मोटाई माप द्वारा किया जाता है। एक BRB टूटने परख का उपयोग बीआरबी के टूटने के कारण प्लाज्मा से विट्रियस ऊतक के लिए एक्स्ट्राओकुलर प्रोटीन के रिसाव को निर्धारित करने के लिए किया जाता है। प्रतिदीप्ति एंजियोग्राफी का उपयोग एफआईटीसी-डेक्सट्रान डाई का उपयोग करके रेटिना वास्कुलचर की कल्पना करके एंजियोजेनेसिस और रक्त वाहिकाओं के रिसाव का अध्ययन करने के लिए किया जाता है।
Introduction
मधुमेह रेटिनोपैथी (डीआर) मधुमेह मेलिटस की सबसे जटिल माध्यमिक जटिलताओं में से एक है। यह दुनिया भर में कामकाजी उम्र की आबादी में रोकथाम योग्य अंधापन का प्रमुख कारण भी है। 32.4 मिलियन अंधे लोगों के हाल के मेटा-विश्लेषण में, 830,000 (2.6%) लोग DR1 के कारण अंधे थे। मधुमेह के लिए जिम्मेदार दृष्टि हानि का अनुपात 2015 में वैश्विक स्तर पर 1.06% (0.15-2.38) पर सातवें स्थान पर रहा।
मधुमेह रेटिनोपैथी का निदान पश्चवर्ती ओकुलर ऊतकों में संवहनी असामान्यताओं द्वारा किया जाता है। नैदानिक रूप से, इसे दो चरणों में विभाजित किया गया है – रेटिना में संवहनीकरण के आधार पर गैर-प्रोलिफेरेटिव डीआर (एनपीडीआर) और प्रोलिफेरेटिव डीआर (पीडीआर)। हाइपरग्लाइसेमिया को डीआर का शक्तिशाली नियामक माना जाता है क्योंकि यह रेटिना में न्यूरोडीजेनेरेशन 4,5, सूजन 6,7 और माइक्रोवैस्कुलचर 8 में शामिल कई मार्गों को फंसाता है। हाइपरग्लाइसेमिया के कारण प्रेरित कई चयापचय जटिलताओं में उन्नत ग्लाइकेशन एंड प्रोडक्ट्स (एजीई), पॉलीओल पाथवे, हेक्सोसामाइन पाथवे और प्रोटीन किनेज-सी पाथवे का संचय शामिल है। ये रास्ते मधुमेह रेटिनोपैथी के विभिन्न चरणों के आधार पर सेल प्रसार (एंडोथेलियल कोशिकाएं), प्रवासन (पेरिसाइट), और एपोप्टोसिस (तंत्रिका रेटिना कोशिकाओं, पेरिसाइट्स और एंडोथेलियल कोशिकाओं) के लिए जिम्मेदार हैं। ये चयापचय परिवर्तन रेटिना डिटेचमेंट, रेटिना कोशिकाओं के नुकसान, रक्त-रेटिना बाधा (बीआरबी), एन्यूरिज्म और एंजियोजेनेसिस 9 के टूटने जैसे शारीरिक परिवर्तनों को जन्म दे सकते हैं।
Streptozotocin (एसटीजेड) प्रेरित टाइप -1 मधुमेह मधुमेह रोगजनन और इसकी जटिलताओं का मूल्यांकन करने के लिए चूहों में एक अच्छी तरह से स्थापित और अच्छी तरह से स्वीकृत अभ्यास है। एसटीजेड के डायबेटोजेनिक प्रभाव अग्नाशयी आइलेट β-कोशिकाओं के चयनात्मक विनाश के कारण होते हैं10। नतीजतन, जानवरों को इंसुलिन की कमी, हाइपरग्लाइसीमिया, पॉलीडिप्सिया और पॉलीयूरिया से गुजरना होगा, जिनमें से सभी मानव टाइप -1 मधुमेह मेलिटस 11 की विशेषता हैं। गंभीर मधुमेह प्रेरण के लिए, एसटीजेड को वयस्कता के दौरान 40-65 मिलीग्राम / किलोग्राम शरीर के वजन पर अंतःशिरा या अंतःक्रियात्मक रूप से प्रशासित किया जाता है। लगभग 72 घंटे के बाद, ये जानवर 250 मिलीग्राम / डीएल 10,12 से अधिक रक्त शर्करा के स्तर को प्रस्तुत करते हैं।
न्यूरोडीजेनेरेशन, सूजन और एंजियोजेनेसिस के कारण रेटिना के शारीरिक परिवर्तनों को समझने के लिए, प्रयोगात्मक पशु मॉडल में विभिन्न तकनीकों को अनुकूलित किया जाना चाहिए। रेटिना कोशिकाओं और रेटिना वाहिकाओं में संरचनात्मक और कार्यात्मक परिवर्तनों का अध्ययन विभिन्न तकनीकों जैसे कि हिस्टोलॉजी, बीआरबी ब्रेकडाउन परख और प्रतिदीप्ति एंजियोग्राफी द्वारा किया जा सकता है।
हिस्टोलॉजी में सूक्ष्म स्तर पर कोशिकाओं, ऊतकों और अंगों की शरीर रचना का अध्ययन शामिल है। यह कोशिकाओं / ऊतकों की संरचना और कार्य के बीच एक सहसंबंध स्थापित करता है। ऊतक संरचना में सूक्ष्म परिवर्तनों की कल्पना करने और पहचानने के लिए कई चरण किए जाते हैं, जिससे स्वस्थ और रोगग्रस्त समकक्षों की तुलना की जाती है। इसलिए, हिस्टोलॉजी के प्रत्येक चरण को सावधानीपूर्वक मानकीकृत करना आवश्यक है। रेटिना हिस्टोलॉजी में शामिल विभिन्न चरणों में नमूने का निर्धारण, नमूने को ट्रिम करना, निर्जलीकरण, समाशोधन, पैराफिन के साथ गर्भाधान, पैराफिन एम्बेडिंग, सेक्शनिंग और स्टेनिंग (हेमेटोक्सिलिन और इओसिन स्टेनिंग) 13,14 हैं।
एक स्वस्थ रेटिना में, रेटिना में अणुओं के परिवहन को बीआरबी द्वारा नियंत्रित किया जाता है, जो आंतरिक पक्ष पर एंडोथेलियल कोशिकाओं और पेरिसाइट से बना होता है, और बाहरी तरफ रेटिना वर्णक उपकला कोशिकाएं होती हैं। हालांकि, आंतरिक बीआरबी एंडोथेलियल कोशिकाएं और पेरिसाइट रोगग्रस्त स्थिति के दौरान विघटित होने लगते हैं, और बीआरबी से भी समझौता किया जाता है। इस बीआरबी टूटने के कारण, कई कम आणविक भार अणु विट्रियस और रेटिना ऊतक 16 में रिसाव करते हैं। जैसे-जैसे रोग बढ़ता है, कई अन्य प्रोटीन अणु (कम और उच्च आणविक वजन) भी होमोस्टैसिस गड़बड़ी के कारण विट्रियस और रेटिना ऊतक में रिसाव करते हैं। यह विभिन्न अन्य जटिलताओं और अंततः धब्बेदार एडिमा और अंधापन की ओर जाता है। इसलिए, विट्रियस में प्रोटीन के स्तर को परिमाणित करना और स्वस्थ और मधुमेह राज्यों के उपायों की तुलना बीआरबी से समझौता करना।
प्रतिदीप्ति एंजियोग्राफी एक तकनीक है जिसका उपयोग फ्लोरोसेंट डाई का उपयोग करके रेटिना और कोरॉइड के रक्त परिसंचरण का अध्ययन करने के लिए किया जाता है। इसका उपयोग अंतःशिरा मार्ग या कार्डियक इंजेक्शन 18 के माध्यम से फ्लोरोसीन डाई इंजेक्ट करके रेटिना और कोरॉइड के वास्कुलचर की कल्पना करने के लिए किया जाता है। एक बार डाई इंजेक्ट किए जाने के बाद, यह पहले रेटिना धमनियों तक पहुंचता है, उसके बाद रेटिना नसों द्वारा। डाई का यह परिसंचरण आमतौर पर डाई 19 के इंजेक्शन से 5 से 10 मिनट के भीतर पूरा हो जाता है। यह मधुमेह रेटिनोपैथी और choroidal neovascularization20 सहित विभिन्न पश्चवर्ती खंड ओकुलर रोगों का निदान करने के लिए एक महत्वपूर्ण तकनीक है। यह सामान्य और रोगग्रस्त स्थितियों में प्रमुख और मामूली वास्कुलचर परिवर्तनों का पता लगाने में मदद करता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
प्रोटोकॉल
रेटिना हिस्टोलॉजी रेटिना कोशिकाओं और परतों के रूपात्मक परिवर्तनों की कल्पना करने के लिए किया जाता है। फिक्सेटिव समाधान, निर्धारण अवधि, निर्जलीकरण, और पैराफिन गर्भाधान की पसंद सहित …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखक भारतीय चिकित्सा अनुसंधान परिषद (आईसीएमआर) को स्वीकार करना चाहते हैं; आईटीआर-2020-2882) डॉ निर्मल जे को वित्त पोषण सहायता के लिए। हम मनीषा मलानी को जूनियर रिसर्च फेलोशिप प्रदान करने के लिए आयोग के विश्वविद्यालय अनुदान और अवसंरचनात्मक सुविधा प्रदान करने के लिए केंद्रीय विश्लेषणात्मक प्रयोगशाला सुविधा, बिट्स-पिलानी, हैदराबाद परिसर को भी धन्यवाद देना चाहते हैं।
Materials
| Histology | |||
| Reagents | |||
| Isoflurane | Abbott | Anesthesia agent | |
| Ketamine hydrochloride | Troikaa Pharmaceuticals | Anesthesia agent | |
| Xylazine | Indian Immunologicals Limited | Anesthesia agent | |
| Pentobarbital sodium | Zora Pharma | Euthanesia agent | |
| Fixative solution (1 % formaldehyde, 1.25 % Glutaraldehyde | HiMedia, Avra | MB059, ASG2529 | Prepared in-house |
| Ethanol | Hayman | F204325 | Dehydration |
| Xylene | HiMedia | MB-180 | Clearing of ethanol or paraffin |
| Paraffin wax | HiMedia | GRM10702 | used for embedding tissue |
| Glycerol | HiMedia | TC503 | To prepare albumin coated slides. Glycerol and egg albumin is mixed in 1:1 ratio to coat on slides |
| Hydrochloric acid | Sisco Research laboratories Pvt. Ltd. | 65955 | For preparation of 1 % acid alcohol |
| Acetic acid | HiMedia | AS119 | For preparation of eosin |
| Scotts water | Leica | 3802900 | Bluing reagent |
| Papanicolaou's solution 1b Hematoxylin solution | Sigma | 1.09254.0500 | Staining of nuclei |
| Eosin | HiMedia | GRM115 | Staining of cytoplasm, 0.25 % solution was prepared in-house |
| DPX Mountant media | Sigma | 6522 | Visualization and protection of retinal sections |
| Equipments | |||
| Glassware | Borosil | ||
| Corneal forcep | Stephens Instruments | S5-1200 | Dissection |
| Colibri forcep | Stephens Instruments | S5-1135 | Dissection |
| Curved micro scissor | Stephens Instruments | S7-1311 | Dissection |
| Vannas scissor | Stephens Instruments | S7-1387 | Dissection |
| Iris scissor | Stephens Instruments | S7-1015 | Dissection |
| Cassettes | HiMedia | PW1292 | To hold tissue during histology processing |
| Water bath | GT Sonic | GT Sonic-D9 | Temperature maintenance |
| Paraffin embedding station | Myr | EC 350 | Preparation of paraffin blocks |
| Microtome | Zhengzhou Nanbei Instrument Equipment Co., Ltd. | YD-335A | Sectioning |
| Blades | Leica | Leica 818 | Sectioning |
| Slides | HiMedia | BG005 | Holding paraffin-tissue sections |
| Coverslips | HiMedia | BG014C | To cover tissue after adding mounting media |
| Blood Retinal Barrier breakdown | |||
| Reagents | |||
| Isoflurane | Abbott | B506 | Anesthesia |
| Dry ice | Not applicable | Not applicable | Dissection |
| Bradford reagent | Sigma | B6916 | Protein quantification |
| Equipments | |||
| Corneal forcep | Stephens Instruments | S5-1200 | Dissection |
| Colibri forcep | Stephens Instruments | S5-1135 | Dissection |
| Curved micro scissor | Stephens Instruments | S7-1311 | Dissection |
| Vannas scissor | Stephens Instruments | S7-1387 | Dissection |
| Iris scissor | Stephens Instruments | S7-1015 | Dissection |
| Glassware | Borosil | Not applicable | |
| EDTA coated tubes | J.K Diagnostics | Not applicable | Separate plasma from whole blood |
| Homogenization tubes | MP Biomedicals | SKU: 115076200-CF | Homogenization of vitreous |
| Homogenization caps | MP Biomedicals | SKU: 115063002-CF | Homogenization of vitreous |
| Glass beads | MP Biomedicals | SKU: 116914801 | Homogenization of vitreous |
| Homogeniser | Bertin Instruments | P000673-MLYS0-A | Homogenization of vitreous |
| 96-well plate – Transparent | Grenier | GN655101 | Protein quantification |
| Plate reader | Molecular devices | SpectrMax M4 | Absorbance measurement |
| Centrifuge | REMI | CPR240 Plus | Centrifugation |
| Fluorescence Angiography | |||
| Reagents | |||
| Isoflurane | Abbott | B506 | Anesthesia |
| FITC-dextran 70 kD (FITC, Dextran, Dibutylin dilaurate, DMSO | FITC, Dextran and Dibutylin dilaurate from Sigma; DMSO from HiMedia | FITC-F3651,Dextran-31390,Dibutylin dilaurate -29123, DMSO-TC185 | Prepared in-house |
| Fluoroshied | Sigma | F6182 | Anti-fading mounting medium |
| Equipments | |||
| Corneal forcep | Stephens Instruments | S5-1200 | Dissection |
| Colibri forcep | Stephens Instruments | S5-1135 | Dissection |
| Curved micro scissor | Stephens Instruments | S7-1311 | Dissection |
| Vannas scissor | Stephens Instruments | S7-1387 | Dissection |
| Iris scissor | Stephens Instruments | S7-1015 | Dissection |
| Glassware | Borosil | Not applicable | |
| Slides | HiMedia | BG005 | Flatmount preparation |
| Coverslips | HiMedia | BG014C | To cover tissue after adding mounting media |
| Confocal microscope | Leica | DMi8 | Visualization of flatmount |
Riferimenti
- Jonas, J. B., Sabanayagam, C. Epidemiology and risk factors for diabetic retinopathy. Diabetic Retinopathy and Cardiovascular Disease. 27, 20-37 (2019).
- Pandova, M. G. . Visual Impairment and Blindness. , (2019).
- Mokdad, A. H., et al. Global, regional, national, and subnational big data to inform health equity research: perspectives from the Global Burden of Disease Study 2017. Ethnicity & Disease. 29, 159-172 (2019).
- Barber, A. J., et al. Neural apoptosis in the retina during experimental and human diabetes. Early onset and effect of insulin. The Journal of Clinical Investigation. 102 (4), 783-791 (1998).
- El-Asrar, A. M. A., Dralands, L., Missotten, L., Al-Jadaan, I. A., Geboes, K. Expression of apoptosis markers in the retinas of human subjects with diabetes. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 45 (8), 2760-2766 (2004).
- Schröder, S., Palinski, W., Schmid-Schönbein, G. Activated monocytes and granulocytes, capillary nonperfusion, and neovascularization in diabetic retinopathy. The American Journal of Pathology. 139 (1), 81 (1991).
- Miyamoto, K., et al. Prevention of leukostasis and vascular leakage in streptozotocin-induced diabetic retinopathy via intercellular adhesion molecule-1 inhibition. Proceedings of the National Academy of Sciences. 96 (19), 10836-10841 (1999).
- Bhanushali, D., et al. Linking retinal microvasculature features with severity of diabetic retinopathy using optical coherence tomography angiography. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 57 (9), 519-525 (2016).
- Wang, W., Lo, A. C. Diabetic retinopathy: pathophysiology and treatments. International Journal of Molecular Sciences. 19 (6), 1816 (2018).
- Akbarzadeh, A., et al. Induction of diabetes by streptozotocin in rats. Indian Journal of Clinical Biochemistry. 22 (2), 60-64 (2007).
- Weiss, R. B. Streptozocin: a review of its pharmacology, efficacy, and toxicity. Cancer Treatment Reports. 66 (3), 427-438 (1982).
- Karunanayake, E. H., Hearse, D. J., Mellows, G. The metabolic fate and elimination of streptozotocin. Biochemical Society Transactions. 3 (3), 410-414 (1975).
- Luna, L. G. . Manual of Histologic Staining Methods of the Armed Forces Institute of Pathology. , (1968).
- Okunlola, A., et al. Histological studies on the retina and cerebellum of Wistar rats treated with Arteether. Journal of Morphological Sciences. 31 (01), 028-032 (2014).
- Wallow, I., Engerman, R. Permeability and patency of retinal blood vessels in experimental diabetes. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 16 (5), 447-461 (1977).
- do Cartmo, A., Ramos, P., Reis, A., Proença, R., Cunha-Vaz, J. Breakdown of the inner and outer blood retinal barrier in streptozotocin-induced diabetes. Experimental Eye Research. 67 (5), 569-575 (1998).
- Shires, T., Faeth, J., Pulido, J. Protein levels in the vitreous of rats with streptozotocin-induced diabetes mellitus. Brain Research Bulletin. 30 (1-2), 85-90 (1993).
- D’amato, R., Wesolowski, E., Smith, L. H. Microscopic visualization of the retina by angiography with high-molecular-weight fluorescein-labeled dextrans in the mouse. Microvascular Research. 46 (2), 135-142 (1993).
- Gupta, D. Fluorescein angiography refresher course: Here’s how to interpret the findings of this useful diagnostic tool. Review of Optometry. 138 (11), 60-65 (2001).
- Edelman, J. L., Castro, M. R. Quantitative image analysis of laser-induced choroidal neovascularization in rat. Experimental Eye Research. 71 (5), 523-533 (2000).
- Szabó, K., et al. Histological evaluation of diabetic neurodegeneration in the retina of Zucker diabetic fatty (ZDF) rats. Scientific Reports. 7 (1), 1-17 (2017).
- Margo, C. E., Lee, A. Fixation of whole eyes: the role of fixative osmolarity in the production of tissue artifact. Graefe’s Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 233 (6), 366-370 (1995).
- Tokuda, K., et al. Optimization of fixative solution for retinal morphology: a comparison with Davidson’s fixative and other fixation solutions. Japanese Journal of Ophthalmology. 62 (4), 481-490 (2018).
- Luna, L. G. . Manual of Histologic Staining Methods of the Armed Forces Institute of Pathology. Third edition. , (1968).
- Skeie, J. M., Tsang, S. H., Mahajan, V. B. Evisceration of mouse vitreous and retina for proteomic analyses. Journal of Visualized Experiments. (50), e2795 (2011).
- D’Amato, R., Wesolowski, E., Smith, L. E. Microscopic visualization of the retina by angiography with high-molecular-weight fluorescein-labeled dextrans in the mouse. Microvascular Research. 46 (2), 135-142 (1993).
- Atkinson, E. G., Jones, S., Ellis, B. A., Dumonde, D. C., Graham, E. Molecular size of retinal vascular leakage determined by FITC-dextran angiography in patients with posterior uveitis. Eye (Lond). 5, 440-446 (1991).
