Valutazione fisiopatologica retinica in un modello di ratto
Summary
La retinopatia diabetica è una delle principali cause di cecità. L’istologia, il test di rottura della barriera emato-retinica e l’angiografia a fluorescenza sono tecniche preziose per comprendere la fisiopatologia della retina, che potrebbe migliorare ulteriormente l’efficiente screening farmacologico contro la retinopatia diabetica.
Abstract
Una malattia dell’occhio del segmento posteriore come la retinopatia diabetica altera la fisiologia della retina. La retinopatia diabetica è caratterizzata da un distacco di retina, dalla rottura della barriera emato-retinica (BRB) e dall’angiogenesi retinica. Un modello di ratto in vivo è un prezioso strumento sperimentale per esaminare i cambiamenti nella struttura e nella funzione della retina. Proponiamo tre diverse tecniche sperimentali nel modello di ratto per identificare i cambiamenti morfologici delle cellule retiniche, della vascolarizzazione retinica e della BRB compromessa. L’istologia retinica viene utilizzata per studiare la morfologia di varie cellule retiniche. Inoltre, la misurazione quantitativa viene eseguita mediante conteggio delle cellule retiniche e misurazione dello spessore di diversi strati retinici. Un test di degradazione BRB viene utilizzato per determinare la perdita di proteine extraoculari dal plasma al tessuto vitreo a causa della rottura di BRB. L’angiografia a fluorescenza viene utilizzata per studiare l’angiogenesi e la perdita dei vasi sanguigni visualizzando la vascolarizzazione retinica utilizzando il colorante FITC-destrano.
Introduction
La retinopatia diabetica (DR) è una delle complicanze secondarie più complesse del diabete mellito. È anche la principale causa di cecità prevenibile nella popolazione in età lavorativa in tutto il mondo. In una recente meta-analisi di 32,4 milioni di persone non vedenti, 830.000 (2,6%) persone erano cieche a causa di DR1. La percentuale di perdita della vista attribuita al diabete si è classificata settima nel 2015 all’1,06% (0,15-2,38) a livello globale2,3.
La retinopatia diabetica è diagnosticata da anomalie vascolari nei tessuti oculari posteriori. Clinicamente, è diviso in due fasi: DR non proliferativo (NPDR) e DR proliferativo (PDR), basato sulla vascolarizzazione nella retina. L’iperglicemia è considerata il potente regolatore della DR in quanto coinvolge diversi percorsi coinvolti nella neurodegenerazione4,5, nell’infiammazione6,7 e nella microvascolarizzazione8 nella retina. Molteplici complicanze metaboliche indotte a causa dell’iperglicemia includono l’accumulo di prodotti finali avanzati di glicazione (AGE), la via poliolica, la via esosamina e la via proteina chinasi-C. Queste vie sono responsabili della proliferazione cellulare (cellule endoteliali), della migrazione (periciti) e dell’apoptosi (cellule retiniche neurali, periciti e cellule endoteliali) basate su diversi stadi della retinopatia diabetica. Queste alterazioni metaboliche possono portare a cambiamenti fisiologici come il distacco della retina, la perdita di cellule retiniche, la rottura della barriera emato-retinica (BRB), gli aneurismi e l’angiogenesi9.
Il diabete di tipo 1 indotto da streptozotocina (STZ) è una pratica ben consolidata e ben accettata nei ratti per valutare la patogenesi del diabete e le sue complicanze. Gli effetti diabetogeni della STZ sono dovuti alla distruzione selettiva delle cellule β delle isole pancreatiche10. Di conseguenza, gli animali subiranno carenza di insulina, iperglicemia, polidipsia e poliuria, che sono tutti caratteristici del diabete mellito di tipo 1 umano11. Per l’induzione del diabete grave, STZ viene somministrato a 40-65 mg / kg di peso corporeo per via endovenosa o intraperitoneale durante l’età adulta. Dopo circa 72 ore, questi animali presentano livelli di glucosio nel sangue superiori a 250 mg/dL10,12.
Per comprendere le alterazioni fisiologiche della retina dovute alla neurodegenerazione, all’infiammazione e all’angiogenesi, diverse tecniche dovrebbero essere ottimizzate in modelli animali sperimentali. I cambiamenti strutturali e funzionali nelle cellule retiniche e nei vasi retinici possono essere studiati con varie tecniche come l’istologia, il saggio di degradazione BRB e l’angiografia a fluorescenza.
L’istologia comporta lo studio dell’anatomia di cellule, tessuti e organi a livello microscopico. Stabilisce una correlazione tra la struttura e la funzione delle cellule/tessuti. Vengono eseguiti diversi passaggi per visualizzare e identificare le alterazioni microscopiche nella struttura dei tessuti, confrontando così le controparti sane e malate13. Quindi, è essenziale standardizzare meticolosamente ogni fase dell’istologia. Vari passaggi coinvolti nell’istologia retinica sono la fissazione del campione, il taglio del campione, la disidratazione, la pulizia, l’impregnazione con paraffina, l’incorporamento di paraffina, il sezionamento e la colorazione (colorazione di ematossilina ed eosina)13,14.
In una retina sana, il trasporto di molecole attraverso la retina è controllato da BRB, composto da cellule endoteliali e periciti sul lato interno e cellule epiteliali pigmentate retiniche sul lato esterno. Tuttavia, le cellule endoteliali BRB interne e i periciti iniziano a degenerare durante la condizione di malattia e anche la BRB è compromessa15. A causa di questa rottura del BRB, molte molecole a basso peso molecolare fuoriescono nel tessuto vitreo e retinico16. Con il progredire della malattia, molte altre molecole proteiche (a basso e alto peso molecolare) fuoriescono anche nel tessuto vitreo e retinico a causa di disturbi dell’omeostasi17. Porta a varie altre complicazioni e, infine, edema maculare e cecità. Quindi, quantificare i livelli di proteine nel vitreo e confrontare le misure degli stati sani e diabetici ha compromesso il BRB.
L’angiografia a fluorescenza è una tecnica utilizzata per studiare la circolazione sanguigna della retina e della coroide utilizzando colorante fluorescente. Viene utilizzato per visualizzare la vascolarizzazione della retina e della coroide iniettando colorante alla fluoresceina per via endovenosa o iniezione cardiaca18. Una volta iniettato, il colorante raggiunge prima le arterie retiniche, seguite dalle vene retiniche. Questa circolazione del colorante viene solitamente completata entro 5-10 minuti dall’iniezione del colorante19. È una tecnica importante per diagnosticare varie malattie oculari del segmento posteriore, tra cui la retinopatia diabetica e la neovascolarizzazione coroidale20. Aiuta a rilevare i cambiamenti vascolari maggiori e minori in condizioni normali e malate.
Protocol
Representative Results
Discussion
Istologia
L’istologia retinica viene eseguita per visualizzare i cambiamenti morfologici delle cellule e degli strati retinici. Vari passaggi, tra cui la scelta della soluzione fissativa, la durata della fissazione, la disidratazione e l’impregnazione di paraffina, devono essere ottimizzati. La dimensione del tessuto non deve superare i 3 mm, poiché la penetrazione fissativa diventa lenta. La paraformaldeide al 4% comunemente usata porta al distacco della retina anche nell’occhio sano a causa dell’os…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori vorrebbero riconoscere l’Indian Council of Medical Research (ICMR; ITR-2020-2882) per il sostegno finanziario al Dr. Nirmal J. Vorremmo anche ringraziare la university grant of Commission per aver fornito una junior research fellowship a Manisha Malani e central analytical laboratory facility, BITS-Pilani, hyderabad campus per aver fornito strutture infrastrutturali.
Materials
| Histology | |||
| Reagents | |||
| Isoflurane | Abbott | Anesthesia agent | |
| Ketamine hydrochloride | Troikaa Pharmaceuticals | Anesthesia agent | |
| Xylazine | Indian Immunologicals Limited | Anesthesia agent | |
| Pentobarbital sodium | Zora Pharma | Euthanesia agent | |
| Fixative solution (1 % formaldehyde, 1.25 % Glutaraldehyde | HiMedia, Avra | MB059, ASG2529 | Prepared in-house |
| Ethanol | Hayman | F204325 | Dehydration |
| Xylene | HiMedia | MB-180 | Clearing of ethanol or paraffin |
| Paraffin wax | HiMedia | GRM10702 | used for embedding tissue |
| Glycerol | HiMedia | TC503 | To prepare albumin coated slides. Glycerol and egg albumin is mixed in 1:1 ratio to coat on slides |
| Hydrochloric acid | Sisco Research laboratories Pvt. Ltd. | 65955 | For preparation of 1 % acid alcohol |
| Acetic acid | HiMedia | AS119 | For preparation of eosin |
| Scotts water | Leica | 3802900 | Bluing reagent |
| Papanicolaou's solution 1b Hematoxylin solution | Sigma | 1.09254.0500 | Staining of nuclei |
| Eosin | HiMedia | GRM115 | Staining of cytoplasm, 0.25 % solution was prepared in-house |
| DPX Mountant media | Sigma | 6522 | Visualization and protection of retinal sections |
| Equipments | |||
| Glassware | Borosil | ||
| Corneal forcep | Stephens Instruments | S5-1200 | Dissection |
| Colibri forcep | Stephens Instruments | S5-1135 | Dissection |
| Curved micro scissor | Stephens Instruments | S7-1311 | Dissection |
| Vannas scissor | Stephens Instruments | S7-1387 | Dissection |
| Iris scissor | Stephens Instruments | S7-1015 | Dissection |
| Cassettes | HiMedia | PW1292 | To hold tissue during histology processing |
| Water bath | GT Sonic | GT Sonic-D9 | Temperature maintenance |
| Paraffin embedding station | Myr | EC 350 | Preparation of paraffin blocks |
| Microtome | Zhengzhou Nanbei Instrument Equipment Co., Ltd. | YD-335A | Sectioning |
| Blades | Leica | Leica 818 | Sectioning |
| Slides | HiMedia | BG005 | Holding paraffin-tissue sections |
| Coverslips | HiMedia | BG014C | To cover tissue after adding mounting media |
| Blood Retinal Barrier breakdown | |||
| Reagents | |||
| Isoflurane | Abbott | B506 | Anesthesia |
| Dry ice | Not applicable | Not applicable | Dissection |
| Bradford reagent | Sigma | B6916 | Protein quantification |
| Equipments | |||
| Corneal forcep | Stephens Instruments | S5-1200 | Dissection |
| Colibri forcep | Stephens Instruments | S5-1135 | Dissection |
| Curved micro scissor | Stephens Instruments | S7-1311 | Dissection |
| Vannas scissor | Stephens Instruments | S7-1387 | Dissection |
| Iris scissor | Stephens Instruments | S7-1015 | Dissection |
| Glassware | Borosil | Not applicable | |
| EDTA coated tubes | J.K Diagnostics | Not applicable | Separate plasma from whole blood |
| Homogenization tubes | MP Biomedicals | SKU: 115076200-CF | Homogenization of vitreous |
| Homogenization caps | MP Biomedicals | SKU: 115063002-CF | Homogenization of vitreous |
| Glass beads | MP Biomedicals | SKU: 116914801 | Homogenization of vitreous |
| Homogeniser | Bertin Instruments | P000673-MLYS0-A | Homogenization of vitreous |
| 96-well plate – Transparent | Grenier | GN655101 | Protein quantification |
| Plate reader | Molecular devices | SpectrMax M4 | Absorbance measurement |
| Centrifuge | REMI | CPR240 Plus | Centrifugation |
| Fluorescence Angiography | |||
| Reagents | |||
| Isoflurane | Abbott | B506 | Anesthesia |
| FITC-dextran 70 kD (FITC, Dextran, Dibutylin dilaurate, DMSO | FITC, Dextran and Dibutylin dilaurate from Sigma; DMSO from HiMedia | FITC-F3651,Dextran-31390,Dibutylin dilaurate -29123, DMSO-TC185 | Prepared in-house |
| Fluoroshied | Sigma | F6182 | Anti-fading mounting medium |
| Equipments | |||
| Corneal forcep | Stephens Instruments | S5-1200 | Dissection |
| Colibri forcep | Stephens Instruments | S5-1135 | Dissection |
| Curved micro scissor | Stephens Instruments | S7-1311 | Dissection |
| Vannas scissor | Stephens Instruments | S7-1387 | Dissection |
| Iris scissor | Stephens Instruments | S7-1015 | Dissection |
| Glassware | Borosil | Not applicable | |
| Slides | HiMedia | BG005 | Flatmount preparation |
| Coverslips | HiMedia | BG014C | To cover tissue after adding mounting media |
| Confocal microscope | Leica | DMi8 | Visualization of flatmount |
Riferimenti
- Jonas, J. B., Sabanayagam, C. Epidemiology and risk factors for diabetic retinopathy. Diabetic Retinopathy and Cardiovascular Disease. 27, 20-37 (2019).
- Pandova, M. G. . Visual Impairment and Blindness. , (2019).
- Mokdad, A. H., et al. Global, regional, national, and subnational big data to inform health equity research: perspectives from the Global Burden of Disease Study 2017. Ethnicity & Disease. 29, 159-172 (2019).
- Barber, A. J., et al. Neural apoptosis in the retina during experimental and human diabetes. Early onset and effect of insulin. The Journal of Clinical Investigation. 102 (4), 783-791 (1998).
- El-Asrar, A. M. A., Dralands, L., Missotten, L., Al-Jadaan, I. A., Geboes, K. Expression of apoptosis markers in the retinas of human subjects with diabetes. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 45 (8), 2760-2766 (2004).
- Schröder, S., Palinski, W., Schmid-Schönbein, G. Activated monocytes and granulocytes, capillary nonperfusion, and neovascularization in diabetic retinopathy. The American Journal of Pathology. 139 (1), 81 (1991).
- Miyamoto, K., et al. Prevention of leukostasis and vascular leakage in streptozotocin-induced diabetic retinopathy via intercellular adhesion molecule-1 inhibition. Proceedings of the National Academy of Sciences. 96 (19), 10836-10841 (1999).
- Bhanushali, D., et al. Linking retinal microvasculature features with severity of diabetic retinopathy using optical coherence tomography angiography. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 57 (9), 519-525 (2016).
- Wang, W., Lo, A. C. Diabetic retinopathy: pathophysiology and treatments. International Journal of Molecular Sciences. 19 (6), 1816 (2018).
- Akbarzadeh, A., et al. Induction of diabetes by streptozotocin in rats. Indian Journal of Clinical Biochemistry. 22 (2), 60-64 (2007).
- Weiss, R. B. Streptozocin: a review of its pharmacology, efficacy, and toxicity. Cancer Treatment Reports. 66 (3), 427-438 (1982).
- Karunanayake, E. H., Hearse, D. J., Mellows, G. The metabolic fate and elimination of streptozotocin. Biochemical Society Transactions. 3 (3), 410-414 (1975).
- Luna, L. G. . Manual of Histologic Staining Methods of the Armed Forces Institute of Pathology. , (1968).
- Okunlola, A., et al. Histological studies on the retina and cerebellum of Wistar rats treated with Arteether. Journal of Morphological Sciences. 31 (01), 028-032 (2014).
- Wallow, I., Engerman, R. Permeability and patency of retinal blood vessels in experimental diabetes. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 16 (5), 447-461 (1977).
- do Cartmo, A., Ramos, P., Reis, A., Proença, R., Cunha-Vaz, J. Breakdown of the inner and outer blood retinal barrier in streptozotocin-induced diabetes. Experimental Eye Research. 67 (5), 569-575 (1998).
- Shires, T., Faeth, J., Pulido, J. Protein levels in the vitreous of rats with streptozotocin-induced diabetes mellitus. Brain Research Bulletin. 30 (1-2), 85-90 (1993).
- D’amato, R., Wesolowski, E., Smith, L. H. Microscopic visualization of the retina by angiography with high-molecular-weight fluorescein-labeled dextrans in the mouse. Microvascular Research. 46 (2), 135-142 (1993).
- Gupta, D. Fluorescein angiography refresher course: Here’s how to interpret the findings of this useful diagnostic tool. Review of Optometry. 138 (11), 60-65 (2001).
- Edelman, J. L., Castro, M. R. Quantitative image analysis of laser-induced choroidal neovascularization in rat. Experimental Eye Research. 71 (5), 523-533 (2000).
- Szabó, K., et al. Histological evaluation of diabetic neurodegeneration in the retina of Zucker diabetic fatty (ZDF) rats. Scientific Reports. 7 (1), 1-17 (2017).
- Margo, C. E., Lee, A. Fixation of whole eyes: the role of fixative osmolarity in the production of tissue artifact. Graefe’s Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 233 (6), 366-370 (1995).
- Tokuda, K., et al. Optimization of fixative solution for retinal morphology: a comparison with Davidson’s fixative and other fixation solutions. Japanese Journal of Ophthalmology. 62 (4), 481-490 (2018).
- Luna, L. G. . Manual of Histologic Staining Methods of the Armed Forces Institute of Pathology. Third edition. , (1968).
- Skeie, J. M., Tsang, S. H., Mahajan, V. B. Evisceration of mouse vitreous and retina for proteomic analyses. Journal of Visualized Experiments. (50), e2795 (2011).
- D’Amato, R., Wesolowski, E., Smith, L. E. Microscopic visualization of the retina by angiography with high-molecular-weight fluorescein-labeled dextrans in the mouse. Microvascular Research. 46 (2), 135-142 (1993).
- Atkinson, E. G., Jones, S., Ellis, B. A., Dumonde, D. C., Graham, E. Molecular size of retinal vascular leakage determined by FITC-dextran angiography in patients with posterior uveitis. Eye (Lond). 5, 440-446 (1991).
