Патофизиологическая оценка сетчатки в модели крысы
Summary
Диабетическая ретинопатия является одной из ведущих причин слепоты. Гистология, анализ разрушения барьера сетчатки крови и флуоресцентная ангиография являются ценными методами для понимания патофизиологии сетчатки, что может еще больше повысить эффективность скрининга лекарств против диабетической ретинопатии.
Abstract
Заболевание заднего сегмента глаз, такое как диабетическая ретинопатия, изменяет физиологию сетчатки. Диабетическая ретинопатия характеризуется отслоением сетчатки, нарушением гемато-ретинального барьера (BRB) и ангиогенезом сетчатки. Модель крысы in vivo является ценным экспериментальным инструментом для изучения изменений в структуре и функции сетчатки. Мы предлагаем три различных экспериментальных метода в модели крыс для выявления морфологических изменений клеток сетчатки, сосудистой системы сетчатки и скомпрометированного BRB. Гистология сетчатки используется для изучения морфологии различных клеток сетчатки. Кроме того, количественное измерение выполняется путем подсчета клеток сетчатки и измерения толщины различных слоев сетчатки. Анализ распада BRB используется для определения утечки экстраокулярных белков из плазмы в стекловидное тело из-за распада BRB. Флуоресцентная ангиография используется для изучения ангиогенеза и утечки кровеносных сосудов путем визуализации сосудистой системы сетчатки с использованием красителя FITC-декстран.
Introduction
Диабетическая ретинопатия (ДР) является одним из самых сложных вторичных осложнений сахарного диабета. Это также является основной причиной предотвратимой слепоты среди населения трудоспособного возраста во всем мире. В недавнем мета-анализе 32,4 миллиона слепых людей 830 000 (2,6%) человек были слепыми из-за DR1. Доля потери зрения, связанной с диабетом, заняла седьмое место в 2015 году с 1,06% (0,15-2,38) во всем мире2,3.
Диабетическая ретинопатия диагностируется сосудистыми аномалиями в задних глазных тканях. Клинически он делится на две стадии – непролиферативный ДР (NPDR) и пролиферативный DR (PDR), основанный на васкуляризации в сетчатке. Гипергликемия считается мощным регулятором ДР, поскольку она включает в себя несколько путей, участвующих в нейродегенерации4,5, воспалении6,7 и микроциркуляторном русле8 в сетчатке. Множественные метаболические осложнения, вызванные гипергликемией, включают накопление конечных продуктов гликирования (AGE), полиольного пути, гексозаминового пути и пути протеинкиназы-С. Эти пути отвечают за пролиферацию клеток (эндотелиальные клетки), миграцию (перициты) и апоптоз (нервные клетки сетчатки, перициты и эндотелиальные клетки) на основе различных стадий диабетической ретинопатии. Эти метаболические изменения могут привести к физиологическим изменениям, таким как отслоение сетчатки, потеря клеток сетчатки, разрушение гематоэнцефалического барьера (BRB), аневризмы и ангиогенез9.
Стрептозотоцин (СТЗ), индуцированный диабетом 1 типа, является хорошо зарекомендовавшей себя и общепринятой практикой у крыс для оценки патогенеза диабета и его осложнений. Диабетогенные эффекты СТЗ обусловлены селективным разрушением островков поджелудочной железы β-клеток10. В результате животные будут подвергаться дефициту инсулина, гипергликемии, полидипсии и полиурии, все из которых характерны для сахарного диабета 1 типа 11. При тяжелой индукции диабета СТЗ вводят при 40-65 мг/кг массы тела внутривенно или внутрибрюшинно во взрослом возрасте. Примерно через 72 ч у этих животных уровень глюкозы в крови превышает 250 мг/дл10,12.
Чтобы понять физиологические изменения сетчатки из-за нейродегенерации, воспаления и ангиогенеза, различные методы должны быть оптимизированы на экспериментальных моделях животных. Структурные и функциональные изменения в клетках сетчатки и сосудах сетчатки могут быть изучены различными методами, такими как гистология, анализ распада BRB и флуоресцентная ангиография.
Гистология предполагает изучение анатомии клеток, тканей и органов на микроскопическом уровне. Устанавливает корреляцию между структурой и функцией клеток/тканей. Выполняется несколько этапов для визуализации и идентификации микроскопических изменений в структуре тканей, тем самым сравнивая здоровых и больных аналогов13. Следовательно, важно тщательно стандартизировать каждый шаг гистологии. Различные этапы, связанные с гистологией сетчатки, включают фиксацию образца, обрезку образца, обезвоживание, очистку, пропитку парафином, встраивание парафина, сечение и окрашивание (окрашивание гематоксилином и эозином)13,14.
В здоровой сетчатке транспорт молекул через сетчатку контролируется BRB, состоящим из эндотелиальных клеток и перицитов на внутренней стороне и пигментных эпителиальных клеток сетчатки на внешней стороне. Тем не менее, внутренние эндотелиальные клетки BRB и перициты начинают дегенерировать во время болезненного состояния, и BRB также скомпрометирован15. Из-за этого распада BRB многие низкомолекулярные молекулы просачиваются в стекловидное тело и ткань сетчатки16. По мере прогрессирования заболевания многие другие белковые молекулы (с низкой и высокой молекулярной массой) также просачиваются в стекловидное тело и ткань сетчатки из-за нарушения гомеостаза17. Это приводит к различным другим осложнениям и, в конечном счете, к макулярному отеку и слепоте. Следовательно, количественная оценка уровня белка в стекловидном теле и сравнение здоровых и диабетических состояний измеряет скомпрометированный BRB.
Флуоресцентная ангиография – это методика, используемая для изучения кровообращения сетчатки и сосудистой оболочки с использованием флуоресцентного красителя. Он используется для визуализации сосудистой системы сетчатки и сосудистой оболочки путем введения флуоресцеинового красителя внутривенным путем или сердечной инъекцией18. Как только краситель вводится, он сначала достигает артерий сетчатки, а затем вен сетчатки. Эта циркуляция красителя обычно завершается в течение 5-10 мин после инъекции красителя19. Это важный метод диагностики различных заболеваний заднего сегмента глаз, включая диабетическую ретинопатию и хориоидальную неоваскуляризацию20. Он помогает обнаружить большие и незначительные изменения сосудистой системы в нормальных и больных условиях.
Protocol
Representative Results
Discussion
Гистология
Гистология сетчатки проводится для визуализации морфологических изменений клеток и слоев сетчатки. Необходимо оптимизировать различные этапы, включая выбор фиксирующего раствора, продолжительность фиксации, обезвоживание и пропитку парафином. Размер ткани не …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы хотели бы отметить Индийский совет медицинских исследований (ICMR; ITR-2020-2882) для финансирования поддержки д-ра Нирмала Дж. Мы также хотели бы поблагодарить Университетский грант Комиссии за предоставление младшей исследовательской стипендии Манише Малани и Центральному аналитическому лабораторному центру, BITS-Pilani, кампус Хайдарабада для предоставления инфраструктурного объекта.
Materials
| Histology | |||
| Reagents | |||
| Isoflurane | Abbott | Anesthesia agent | |
| Ketamine hydrochloride | Troikaa Pharmaceuticals | Anesthesia agent | |
| Xylazine | Indian Immunologicals Limited | Anesthesia agent | |
| Pentobarbital sodium | Zora Pharma | Euthanesia agent | |
| Fixative solution (1 % formaldehyde, 1.25 % Glutaraldehyde | HiMedia, Avra | MB059, ASG2529 | Prepared in-house |
| Ethanol | Hayman | F204325 | Dehydration |
| Xylene | HiMedia | MB-180 | Clearing of ethanol or paraffin |
| Paraffin wax | HiMedia | GRM10702 | used for embedding tissue |
| Glycerol | HiMedia | TC503 | To prepare albumin coated slides. Glycerol and egg albumin is mixed in 1:1 ratio to coat on slides |
| Hydrochloric acid | Sisco Research laboratories Pvt. Ltd. | 65955 | For preparation of 1 % acid alcohol |
| Acetic acid | HiMedia | AS119 | For preparation of eosin |
| Scotts water | Leica | 3802900 | Bluing reagent |
| Papanicolaou's solution 1b Hematoxylin solution | Sigma | 1.09254.0500 | Staining of nuclei |
| Eosin | HiMedia | GRM115 | Staining of cytoplasm, 0.25 % solution was prepared in-house |
| DPX Mountant media | Sigma | 6522 | Visualization and protection of retinal sections |
| Equipments | |||
| Glassware | Borosil | ||
| Corneal forcep | Stephens Instruments | S5-1200 | Dissection |
| Colibri forcep | Stephens Instruments | S5-1135 | Dissection |
| Curved micro scissor | Stephens Instruments | S7-1311 | Dissection |
| Vannas scissor | Stephens Instruments | S7-1387 | Dissection |
| Iris scissor | Stephens Instruments | S7-1015 | Dissection |
| Cassettes | HiMedia | PW1292 | To hold tissue during histology processing |
| Water bath | GT Sonic | GT Sonic-D9 | Temperature maintenance |
| Paraffin embedding station | Myr | EC 350 | Preparation of paraffin blocks |
| Microtome | Zhengzhou Nanbei Instrument Equipment Co., Ltd. | YD-335A | Sectioning |
| Blades | Leica | Leica 818 | Sectioning |
| Slides | HiMedia | BG005 | Holding paraffin-tissue sections |
| Coverslips | HiMedia | BG014C | To cover tissue after adding mounting media |
| Blood Retinal Barrier breakdown | |||
| Reagents | |||
| Isoflurane | Abbott | B506 | Anesthesia |
| Dry ice | Not applicable | Not applicable | Dissection |
| Bradford reagent | Sigma | B6916 | Protein quantification |
| Equipments | |||
| Corneal forcep | Stephens Instruments | S5-1200 | Dissection |
| Colibri forcep | Stephens Instruments | S5-1135 | Dissection |
| Curved micro scissor | Stephens Instruments | S7-1311 | Dissection |
| Vannas scissor | Stephens Instruments | S7-1387 | Dissection |
| Iris scissor | Stephens Instruments | S7-1015 | Dissection |
| Glassware | Borosil | Not applicable | |
| EDTA coated tubes | J.K Diagnostics | Not applicable | Separate plasma from whole blood |
| Homogenization tubes | MP Biomedicals | SKU: 115076200-CF | Homogenization of vitreous |
| Homogenization caps | MP Biomedicals | SKU: 115063002-CF | Homogenization of vitreous |
| Glass beads | MP Biomedicals | SKU: 116914801 | Homogenization of vitreous |
| Homogeniser | Bertin Instruments | P000673-MLYS0-A | Homogenization of vitreous |
| 96-well plate – Transparent | Grenier | GN655101 | Protein quantification |
| Plate reader | Molecular devices | SpectrMax M4 | Absorbance measurement |
| Centrifuge | REMI | CPR240 Plus | Centrifugation |
| Fluorescence Angiography | |||
| Reagents | |||
| Isoflurane | Abbott | B506 | Anesthesia |
| FITC-dextran 70 kD (FITC, Dextran, Dibutylin dilaurate, DMSO | FITC, Dextran and Dibutylin dilaurate from Sigma; DMSO from HiMedia | FITC-F3651,Dextran-31390,Dibutylin dilaurate -29123, DMSO-TC185 | Prepared in-house |
| Fluoroshied | Sigma | F6182 | Anti-fading mounting medium |
| Equipments | |||
| Corneal forcep | Stephens Instruments | S5-1200 | Dissection |
| Colibri forcep | Stephens Instruments | S5-1135 | Dissection |
| Curved micro scissor | Stephens Instruments | S7-1311 | Dissection |
| Vannas scissor | Stephens Instruments | S7-1387 | Dissection |
| Iris scissor | Stephens Instruments | S7-1015 | Dissection |
| Glassware | Borosil | Not applicable | |
| Slides | HiMedia | BG005 | Flatmount preparation |
| Coverslips | HiMedia | BG014C | To cover tissue after adding mounting media |
| Confocal microscope | Leica | DMi8 | Visualization of flatmount |
Riferimenti
- Jonas, J. B., Sabanayagam, C. Epidemiology and risk factors for diabetic retinopathy. Diabetic Retinopathy and Cardiovascular Disease. 27, 20-37 (2019).
- Pandova, M. G. . Visual Impairment and Blindness. , (2019).
- Mokdad, A. H., et al. Global, regional, national, and subnational big data to inform health equity research: perspectives from the Global Burden of Disease Study 2017. Ethnicity & Disease. 29, 159-172 (2019).
- Barber, A. J., et al. Neural apoptosis in the retina during experimental and human diabetes. Early onset and effect of insulin. The Journal of Clinical Investigation. 102 (4), 783-791 (1998).
- El-Asrar, A. M. A., Dralands, L., Missotten, L., Al-Jadaan, I. A., Geboes, K. Expression of apoptosis markers in the retinas of human subjects with diabetes. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 45 (8), 2760-2766 (2004).
- Schröder, S., Palinski, W., Schmid-Schönbein, G. Activated monocytes and granulocytes, capillary nonperfusion, and neovascularization in diabetic retinopathy. The American Journal of Pathology. 139 (1), 81 (1991).
- Miyamoto, K., et al. Prevention of leukostasis and vascular leakage in streptozotocin-induced diabetic retinopathy via intercellular adhesion molecule-1 inhibition. Proceedings of the National Academy of Sciences. 96 (19), 10836-10841 (1999).
- Bhanushali, D., et al. Linking retinal microvasculature features with severity of diabetic retinopathy using optical coherence tomography angiography. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 57 (9), 519-525 (2016).
- Wang, W., Lo, A. C. Diabetic retinopathy: pathophysiology and treatments. International Journal of Molecular Sciences. 19 (6), 1816 (2018).
- Akbarzadeh, A., et al. Induction of diabetes by streptozotocin in rats. Indian Journal of Clinical Biochemistry. 22 (2), 60-64 (2007).
- Weiss, R. B. Streptozocin: a review of its pharmacology, efficacy, and toxicity. Cancer Treatment Reports. 66 (3), 427-438 (1982).
- Karunanayake, E. H., Hearse, D. J., Mellows, G. The metabolic fate and elimination of streptozotocin. Biochemical Society Transactions. 3 (3), 410-414 (1975).
- Luna, L. G. . Manual of Histologic Staining Methods of the Armed Forces Institute of Pathology. , (1968).
- Okunlola, A., et al. Histological studies on the retina and cerebellum of Wistar rats treated with Arteether. Journal of Morphological Sciences. 31 (01), 028-032 (2014).
- Wallow, I., Engerman, R. Permeability and patency of retinal blood vessels in experimental diabetes. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 16 (5), 447-461 (1977).
- do Cartmo, A., Ramos, P., Reis, A., Proença, R., Cunha-Vaz, J. Breakdown of the inner and outer blood retinal barrier in streptozotocin-induced diabetes. Experimental Eye Research. 67 (5), 569-575 (1998).
- Shires, T., Faeth, J., Pulido, J. Protein levels in the vitreous of rats with streptozotocin-induced diabetes mellitus. Brain Research Bulletin. 30 (1-2), 85-90 (1993).
- D’amato, R., Wesolowski, E., Smith, L. H. Microscopic visualization of the retina by angiography with high-molecular-weight fluorescein-labeled dextrans in the mouse. Microvascular Research. 46 (2), 135-142 (1993).
- Gupta, D. Fluorescein angiography refresher course: Here’s how to interpret the findings of this useful diagnostic tool. Review of Optometry. 138 (11), 60-65 (2001).
- Edelman, J. L., Castro, M. R. Quantitative image analysis of laser-induced choroidal neovascularization in rat. Experimental Eye Research. 71 (5), 523-533 (2000).
- Szabó, K., et al. Histological evaluation of diabetic neurodegeneration in the retina of Zucker diabetic fatty (ZDF) rats. Scientific Reports. 7 (1), 1-17 (2017).
- Margo, C. E., Lee, A. Fixation of whole eyes: the role of fixative osmolarity in the production of tissue artifact. Graefe’s Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 233 (6), 366-370 (1995).
- Tokuda, K., et al. Optimization of fixative solution for retinal morphology: a comparison with Davidson’s fixative and other fixation solutions. Japanese Journal of Ophthalmology. 62 (4), 481-490 (2018).
- Luna, L. G. . Manual of Histologic Staining Methods of the Armed Forces Institute of Pathology. Third edition. , (1968).
- Skeie, J. M., Tsang, S. H., Mahajan, V. B. Evisceration of mouse vitreous and retina for proteomic analyses. Journal of Visualized Experiments. (50), e2795 (2011).
- D’Amato, R., Wesolowski, E., Smith, L. E. Microscopic visualization of the retina by angiography with high-molecular-weight fluorescein-labeled dextrans in the mouse. Microvascular Research. 46 (2), 135-142 (1993).
- Atkinson, E. G., Jones, S., Ellis, B. A., Dumonde, D. C., Graham, E. Molecular size of retinal vascular leakage determined by FITC-dextran angiography in patients with posterior uveitis. Eye (Lond). 5, 440-446 (1991).
