Analisi citometrica a flusso di parametri mitocondriali multipli in cellule staminali pluripotenti indotte umane e loro derivati neurali e gliali

Summary

Questo studio riporta un nuovo approccio per misurare più parametri funzionali mitocondriali basati sulla citometria a flusso e sulla doppia colorazione con due reporter fluorescenti o anticorpi per rilevare cambiamenti nel volume mitocondriale, potenziale di membrana mitocondriale, livello di specie reattive dell’ossigeno, composizione della catena respiratoria mitocondriale e DNA mitocondriale.

Abstract

I mitocondri sono importanti nella fisiopatologia di molte malattie neurodegenerative. I cambiamenti nel volume mitocondriale, il potenziale di membrana mitocondriale (MMP), la produzione mitocondriale di specie reattive dell’ossigeno (ROS) e il numero di copie del DNA mitocondriale (mtDNA) sono spesso caratteristiche di questi processi. Questo rapporto descrive un nuovo approccio basato sulla citometria a flusso per misurare più parametri mitocondriali in diversi tipi di cellule, tra cui cellule staminali pluripotenti indotte umane (iPSC) e cellule neurali e gliali derivate da iPSC. Questa strategia basata sul flusso utilizza cellule vive per misurare il volume mitocondriale, i livelli di MMP e ROS, nonché cellule fisse per stimare componenti della catena respiratoria mitocondriale (MRC) e proteine associate al mtDNA come il fattore di trascrizione mitocondriale A (TFAM).

Co-colorando con reporter fluorescenti, tra cui MitoTracker Green (MTG), tetrametilrodamina estere etilico (TMRE) e MitoSox Red, i cambiamenti nel volume mitocondriale, MMP e ROS mitocondriale possono essere quantificati e correlati al contenuto mitocondriale. La doppia colorazione con anticorpi contro le subunità del complesso MRC e la translocasi della membrana mitocondriale esterna 20 (TOMM20) consente la valutazione dell’espressione della subunità MRC. Poiché la quantità di TFAM è proporzionale al numero di copie del mtDNA, la misurazione del TFAM per TOMM20 fornisce una misurazione indiretta del mtDNA per volume mitocondriale. L’intero protocollo può essere eseguito entro 2-3 ore. È importante sottolineare che questi protocolli consentono la misurazione dei parametri mitocondriali, sia a livello totale che a livello specifico per volume mitocondriale, utilizzando la citometria a flusso.

Introduction

I mitocondri sono organelli essenziali presenti in quasi tutte le cellule eucariotiche. I mitocondri sono responsabili dell’approvvigionamento energetico producendo adenosina trifosfato (ATP) attraverso la fosforilazione ossidativa e agiscono come intermediari metabolici per la biosintesi e il metabolismo. I mitocondri sono profondamente coinvolti in molti altri importanti processi cellulari, come la generazione di ROS, la morte cellulare e la regolazione intracellulare di Ca²⁺. La disfunzione mitocondriale è stata associata a varie malattie neurodegenerative, tra cui il morbo di Parkinson (PD), il morbo di Alzheimer (AD), la malattia di Huntington (HD), l’atassia di Friedreich (FRDA) e la sclerosi laterale amiotrofica (SLA)¹. Si ritiene inoltre che l’aumento della disfunzione mitocondriale e l’anomalia del mtDNA contribuiscano all’invecchiamento umano ^2,3.

Vari tipi di disfunzione mitocondriale si verificano nelle malattie neurodegenerative e cambiamenti nel volume mitocondriale, depolarizzazione MMP, produzione di ROS e alterazioni nel numero di copie del mtDNA sono comuni 4,5,6,7. Pertanto, la capacità di misurare queste e altre funzioni mitocondriali è di grande importanza quando si studiano i meccanismi della malattia e si testano potenziali agenti terapeutici. Inoltre, in considerazione della mancanza di modelli animali che replicano fedelmente le malattie neurodegenerative umane, stabilire adeguati sistemi modello in vitro che ricapitolino la malattia umana nelle cellule cerebrali è un passo importante verso una maggiore comprensione di queste malattie e lo sviluppo di nuove terapie 2,3,8,9.

Le iPSC umane possono essere utilizzate per generare varie cellule cerebrali, comprese le cellule neuronali e non neuronali (cioè le cellule gliali), e il danno mitocondriale associato alla malattia neurodegenerativa è stato trovato in entrambi i tipi di cellule 3,10,11,12,13. I metodi appropriati per la differenziazione delle iPSC in linee neurali e gliali sono disponibili^14,15,16. Queste cellule forniscono una piattaforma uomo/paziente unica per la modellazione in vitro della malattia e lo screening dei farmaci. Inoltre, poiché questi sono derivati dai pazienti, i neuroni derivati da iPSC e le cellule gliali forniscono modelli di malattia che riflettono ciò che sta accadendo negli esseri umani in modo più accurato.

Ad oggi, sono disponibili pochi metodi convenienti e affidabili per misurare più parametri funzionali mitocondriali nelle iPSC, in particolare i neuroni viventi e le cellule gliali. L’uso della citometria a flusso fornisce allo scienziato un potente strumento per misurare i parametri biologici, compresa la funzione mitocondriale, in singole cellule. Questo protocollo fornisce dettagli per la generazione di diversi tipi di cellule cerebrali, tra cui cellule staminali neurali (NSC), neuroni e astrociti gliali da iPSC, nonché nuovi approcci basati sulla citometria a flusso per misurare più parametri mitocondriali in diversi tipi di cellule, tra cui iPSC e cellule neurali e gliali derivate da iPSC. Il protocollo fornisce anche una strategia di co-colorazione per l’utilizzo della citometria a flusso per misurare il volume mitocondriale, MMP, livello di ROS mitocondriale, complessi MRC e TFAM. Incorporando misure del volume o della massa mitocondriale, questi protocolli consentono anche la misurazione sia del livello totale che del livello specifico per unità mitocondriale.

Protocol

NOTA: Vedere la tabella dei materiali e la tabella supplementare S1 per le ricette di tutti i supporti e le soluzioni utilizzate in questo protocollo. 1. Differenziazione delle iPSC umane in NCS, neuroni dopaminergici (DA) e astrociti Preparare piastre rivestite di matrice.Scongelare un flaconcino di 5 mL di matrice sul ghiaccio durante la notte. Diluire 1 mL di matrice con 99 mL di freddo Advanced Dulbecco’s Modified Eagle M…

Representative Results

Una descrizione schematica del metodo di differenziazione e delle strategie citometriche a flusso è mostrata nella Figura 3. Le iPSC umane sono differenziate in rosette neurali e quindi sollevate in coltura di sospensione per la differenziazione in sfere neurali. Le sfere neurali sono ulteriormente differenziate e maturate in neuroni DA. Le sfere neurali sono dissociate in singole cellule per generare astrociti gliali, riplaccate in monostrati come NSC e quindi differenziate in astrociti. Q…

Discussion

Qui sono protocolli per generare neuroni e astrociti derivati da iPSC e valutare molteplici aspetti della funzione mitocondriale utilizzando la citometria a flusso. Questi protocolli consentono un’efficiente conversione delle iPSC umane sia in neuroni che in astrociti gliali e la caratterizzazione dettagliata della funzione mitocondriale, principalmente nelle cellule viventi. I protocolli forniscono anche una strategia basata sulla citometria a flusso di co-colorazione per l’acquisizione e l’analisi di più funzioni mito…

Materials

anti-Oct4	Abcam	ab19857, RRID:AB_445175	Primary Antibody; use as 1:100, 10 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 488 goat anti-rabbit IgG  (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11008) as secondary antibody.
anti-SSEA4	Abcam	ab16287, RRID:AB_778073	Primary Antibody; use as 1:100, 10 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 594 goat anti-mouse IgG (1:800, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11005) as secondary antibody.
anti-Sox2	Abcam	ab97959, RRID:AB_2341193	Primary Antibody; use as 1:100, 10 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 488 goat anti-rabbit IgG  (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11008) as secondary antibody.
anti-Pax6	Abcam	ab5790, RRID:AB_305110	Primary Antibody; use as 1:100, 10 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 488 goat anti-rabbit IgG  (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11008) as secondary antibody.
anti-Nestin	Santa Cruz Biotechnology	sc-23927, RRID:AB_627994	Primary Antibody; use as 1:50, 20 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 594 goat anti-mouse IgG (1:800, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11005) as secondary antibody.
anti-GFAP	Abcam	ab4674, RRID:AB_304558	Primary Antibody; use as 1:100, 10 μL in 1000 μL staining solution;  use Alexa Fluor ® 594 goat anti-chicken IgG (1:800, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11042) as secondary antibody.
anti-S100β  conjugated with Alexa Fluor 488	Abcam	ab196442, RRID:AB_2722596	Primary Antibody; use as 1:400, 2.5 μL in 1000 μL staining solution;
anti-TH	Abcam	ab75875, RRID:AB_1310786	Primary Antibody; use as 1:100, 10 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 488 goat anti-rabbit IgG  (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11008) as secondary antibody.
anti-Tuj 1	Abcam	ab78078, RRID:AB_2256751	Primary Antibody; use as 1:1000, 1 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 594 goat anti-mouse IgG (1:800, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11005) as secondary antibody.
anti-Synaptophysin	Abcam	ab32127, RRID:AB_2286949	Primary Antibody; use as 1:100, 10 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 488 goat anti-rabbit IgG  (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11008) as secondary antibody.
anti-PSD-95	Abcam	ab2723, RRID:AB_303248	Primary Antibody; use as 1:100, 10 μL in 1000 μL staining solution;  use Alexa Fluor ® 594 goat anti-chicken IgG (1:800, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11042) as secondary antibody.
anti-TFAM conjugated with Alexa Fluor 488	Abcam	ab198308	Primary Antibody; use as 1:400, 2.5 μL in 1000 μL staining solution; use mouse monoclonal IgG2b  Alexa Fluor® 488 as an isotype control.
anti-TOMM20 conjugated with Alexa Fluor 488	Santa Cruz Biotechnology	Cat# sc-17764 RRID:AB_628381	Primary Antibody; use as 1:400, 2.5 μL in 1000 μL staining solution; use mouse monoclonal IgG2a  Alexa Fluor® 488 as an isotype control.
anti-NDUFB10	Abcam	ab196019	Primary Antibody; use as 1:1000, 1 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 488 goat anti-rabbit IgG  (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11008) as secondary antibody; use rabbit monoclonal IgG as an isotype control.
anti-SDHA	Abcam	ab137040	Primary Antibody; use as 1:1000, 1 μL in 1000 μL staining solution;  use Alexa Fluor ® 488 goat anti-rabbit IgG  (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11008) as secondary antibody; use rabbit monoclonal IgG as an isotype control.
anti-COX IV	Abcam	ab14744, RRID:AB_301443	Primary Antibody; use as 1:1000, 1 μL in 1000 μL staining solution; use  Alexa Fluor ® 488 goat anti-mouse IgG  (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11001) as secondary antibody; use mouse monoclonal IgG as an isotype control.
Activin A	PeproTech	120-14E	Astrocyte differentiation medium ingredient
ABM Basal Medium	Lonza	CC-3187	Basal medium for astrocyte culture
AGM SingleQuots Supplement Pack	Lonza	CC-4123	Supplement for astrocyte culture
Antibiotic-Antimycotic	Thermo Fisher Scientific	15240062	CDM ingredient
Advanced DMEM/F-12	Thermo Fisher Scientific	12634010	Basal medium for dilute Geltrex
Bovine Serum Albumin	Europa Bioproducts	EQBAH62-1000	Blocking agent to prevent non-specific binding of antibodies in immunostaining assays and CDM ingredient
BDNF	PeproTech	450-02	DA neurons medium ingredient
B-27 Supplement	Thermo Fisher Scientific	17504044	Astrocyte differentiation medium ingredient
BD Accuri C6 Plus Flow Cytometer	BD Biosciences, USA
Chemically Defined Lipid Concentrate	Thermo Fisher Scientific	11905031	CDM ingredient
Collagenase IV	Thermo Fisher Scientific	17104019	Reagent for gentle dissociation of human iPSCs
CCD Microscope Camera Leica DFC3000 G	Leica Microsystems, Germany
Corning non-treated culture dishes	Sigma-Aldrich	CLS430589	Suspension culture
DPBS	Thermo Fisher Scientific	14190250	Used for a variety of cell culture wash
DMEM/F-12, GlutaMAX supplement	Thermo Fisher Scientific	10565018	Astrocyte differentiation basal Medium
EDTA	Thermo Fisher Scientific	15575020	Reagent for gentle dissociation of human iPSCs
Essential 8 Basal Medium	Thermo Fisher Scientific	A1516901	Basal medium for iPSC culture
Essential 8 Supplement (50X)	Thermo Fisher Scientific	A1517101	Supplement for iPSC culture
EGF Recombinant Human Protein	Thermo Fisher Scientific	PHG0314	Supplement for NSC culture
FGF-basic (AA 10–155) Recombinant Human Protein	Thermo Fisher Scientific	PHG0024	Supplement for NSC culture
Fetal Bovine Serum	Sigma-Aldrich	12103C	Medium ingredient
FGF-basic	PeproTech	100-18B	Astrocyte differentiation medium ingredient
FCCP	Abcam	ab120081	Eliminates mitochondrial membrane potential and TMRE staining
Fluid aspiration system BVC control	Vacuubrand, Germany
Formaldehyde (PFA) 16%	Thermo Fisher Scientific	28908	Cell fixation
Geltrex	Thermo Fisher Scientific	A1413302	Used for attachment and maintenance of human iPSCs
GlutaMAX Supplement	Thermo Fisher Scientific	35050061	Supplement for NSC culture
GDNF	Peprotech	450-10	DA neurons medium ingredient
Glycine	Sigma-Aldrich	G8898	Used for blocking buffer
Ham's F-12 Nutrient Mix	Thermo Fisher Scientific	31765027	Basal medium for CDM
Heregulin beta-1 human	Sigma-Aldrich	SRP3055	Astrocyte differentiation medium ingredient
Hoechst 33342	Thermo Fisher Scientific	H1399	Stain the nuclei for confocal image
Heracell 150i CO2 Incubators	Fisher Scientific, USA
IMDM	Thermo Fisher Scientific	21980032	Basal medium for CDM
Insulin	Roche	1376497	CDM ingredient
InSolution AMPK Inhibitor	Sigma-Aldrich	171261	Neural induction medium ingredient
Insulin-like Growth Factor-I human	Sigma-Aldrich	I3769	Astrocyte differentiation medium ingredient
KnockOut DMEM/F-12 medium	Thermo Fisher Scientific	12660012	Basal medium for NSC culture
Laminin	Sigma-Aldrich	L2020	Promotes attachment and growth of neural cells in vitro
Leica TCS SP8 STED confocal microscope	Leica Microsystems, Germany
Monothioglycerol	Sigma-Aldrich	M6145	CDM ingredient
MitoTracker Green FM	Thermo Fisher Scientific	M7514	Used for mitochondrial volume indicator
MitoSox Red	Thermo Fisher Scientific	M36008	Used for mitochondrial ROS indicator
N-Acetyl-L-cysteine	Sigma-Aldrich	A7250	Neural induction medium ingredient
N-2 Supplement	Thermo Fisher Scientific	17502048	Astrocyte differentiation medium ingredient
Normal goat serum	Thermo Fisher Scientific	PCN5000	Used for blocking buffer
Orbital shakers – SSM1	Stuart Equipment, UK
Poly-L-ornithine solution	Sigma-Aldrich	P4957	Promotes attachment and growth of neural cells in vitro
Poly-D-lysine hydrobromide	Sigma-Aldrich	P7405	Promotes attachment and growth of neural cells in vitro
Purmorphamine	STEMCELL Technologies	72204	Promotes DA neuron differentiation
ProLong Gold Antifade Mountant	Thermo Fisher Scientific	P36930	Mounting the coverslip for confocal image
PBS 1x	Thermo Fisher Scientific	18912014	Used for a variety of wash
Recombinant Human/Mouse FGF-8b Protein	R&D Systems	423-F8-025/CF	Promotes DA neuron differentiation
SB 431542	Tocris Bioscience	TB1614-GMP	Neural Induction Medium ingredient
StemPro Neural Supplement	Thermo Fisher Scientific	A10508-01	Supplement for NSCs culture
TrypLE Express Enzyme	Thermo Fisher Scientific	12604013	Cell dissociation reagent
Transferrin	Roche	652202	CDM ingredient
TRITON X-100	VWR International	9002-93-1	Used for cells permeabilization in immunostaining assays
TMRE	Abcam	ab113852	Used for mitochondrial membrane potential staining
Water Bath Jb Academy Basic Jba5 JBA5 Grant Instruments	Grant Instruments, USA