Análise citométrica de fluxo de múltiplos parâmetros mitocondriais em células-tronco pluripotentes induzidas por humanos e seus derivados neurais e gliais
Summary
Este estudo relata uma nova abordagem para medir múltiplos parâmetros funcionais mitocondriais com base na citometria de fluxo e dupla coloração com dois repórteres fluorescentes ou anticorpos para detectar alterações no volume mitocondrial, potencial de membrana mitocondrial, nível de espécies reativas de oxigênio, composição da cadeia respiratória mitocondrial e DNA mitocondrial.
Abstract
As mitocôndrias são importantes na fisiopatologia de muitas doenças neurodegenerativas. Alterações no volume mitocondrial, no potencial de membrana mitocondrial (MMP), na produção mitocondrial de espécies reativas de oxigênio (ROS) e no número de cópias do DNA mitocondrial (mtDNA) são frequentemente características desses processos. Este relatório detalha uma nova abordagem baseada em citometria de fluxo para medir múltiplos parâmetros mitocondriais em diferentes tipos de células, incluindo células-tronco pluripotentes induzidas por humanos (iPSCs) e células neurais e gliais derivadas de iPSC. Essa estratégia baseada em fluxo usa células vivas para medir o volume mitocondrial, os níveis de MMP e ROS, bem como células fixas para estimar componentes da cadeia respiratória mitocondrial (MRC) e proteínas associadas ao mtDNA, como o fator de transcrição mitocondrial A (TFAM).
Ao co-coloração com repórteres fluorescentes, incluindo MitoTracker Green (MTG), éster etílico de tetrametilrodamina (TMRE) e MitoSox Red, mudanças no volume mitocondrial, MMP e ROS mitocondrial podem ser quantificadas e relacionadas ao conteúdo mitocondrial. A dupla coloração com anticorpos contra subunidades do complexo MRC e translocase da membrana mitocondrial externa 20 (TOMM20) permite a avaliação da expressão da subunidade MRC. Como a quantidade de TFAM é proporcional ao número de cópias de mtDNA, a medição de TFAM por TOMM20 fornece uma medição indireta de mtDNA por volume mitocondrial. Todo o protocolo pode ser realizado dentro de 2-3 h. É importante ressaltar que esses protocolos permitem a mensuração de parâmetros mitocondriais, tanto no nível total quanto no nível específico por volume mitocondrial, utilizando citometria de fluxo.
Introduction
As mitocôndrias são organelas essenciais presentes em quase todas as células eucarióticas. As mitocôndrias são responsáveis pelo fornecimento de energia, produzindo trifosfato de adenosina (ATP) através da fosforilação oxidativa e atuam como intermediários metabólicos para a biossíntese e o metabolismo. As mitocôndrias estão profundamente envolvidas em muitos outros processos celulares importantes, como a geração de EROs, a morte celular e a regulação intracelular do Ca2+. A disfunção mitocondrial tem sido associada a várias doenças neurodegenerativas, incluindo a doença de Parkinson (DP), a doença de Alzheimer (DA), a doença de Huntington (DH), a ataxia de Friedreich (FRDA) e a esclerose lateral amiotrófica (ELA)1. Acredita-se que o aumento da disfunção mitocondrial e a anormalidade do mtDNA também contribuam para o envelhecimento humano 2,3.
Vários tipos de disfunção mitocondrial ocorrem em doenças neurodegenerativas, e alterações no volume mitocondrial, despolarização da MMP, produção de ERO e alterações no número de cópias do mtDNA são comuns 4,5,6,7. Portanto, a capacidade de medir essas e outras funções mitocondriais é de grande importância ao estudar os mecanismos da doença e testar potenciais agentes terapêuticos. Além disso, diante da falta de modelos animais que repliquem fielmente as doenças neurodegenerativas humanas, o estabelecimento de sistemas de modelos in vitro adequados que recapitulem a doença humana nas células cerebrais é um passo importante para uma maior compreensão dessas doenças e o desenvolvimento de novas terapias 2,3,8,9.
As iPSCs humanas podem ser usadas para gerar várias células cerebrais, incluindo células neuronais e não neuronais (ou seja, células gliais), e danos mitocondriais associados à doença neurodegenerativa foram encontrados em ambos os tipos celulares 3,10,11,12,13. Métodos apropriados para diferenciação de iPSC em linhagens neurais e gliais estão disponíveis14,15,16. Essas células fornecem uma plataforma única para humanos / pacientes para modelagem de doenças in vitro e triagem de medicamentos. Além disso, como estes são derivados de pacientes, os neurônios derivados de iPSC e as células gliais fornecem modelos de doença que refletem o que está acontecendo em humanos com mais precisão.
Até o momento, poucos métodos convenientes e confiáveis para medir múltiplos parâmetros funcionais mitocondriais em iPSCs, particularmente neurônios vivos e células gliais, estão disponíveis. O uso da citometria de fluxo fornece ao cientista uma ferramenta poderosa para medir parâmetros biológicos, incluindo a função mitocondrial, em células individuais. Este protocolo fornece detalhes para a geração de diferentes tipos de células cerebrais, incluindo células-tronco neurais (NSCs), neurônios e astrócitos gliais de iPSCs, bem como novas abordagens baseadas em citometria de fluxo para medir múltiplos parâmetros mitocondriais em diferentes tipos de células, incluindo iPSCs e células neurais e gliais derivadas de iPSC. O protocolo também fornece uma estratégia de co-coloração para o uso de citometria de fluxo para medir o volume mitocondrial, MMP, nível de ROS mitocondrial, complexos MRC e TFAM. Ao incorporar medidas de volume ou massa mitocondrial, esses protocolos também permitem a medição do nível total e do nível específico por unidade mitocondrial.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aqui estão os protocolos para gerar neurônios e astrócitos derivados de iPSC e avaliar múltiplos aspectos da função mitocondrial usando citometria de fluxo. Esses protocolos permitem a conversão eficiente de iPSCs humanas em neurônios e astrócitos gliais e a caracterização detalhada da função mitocondrial, principalmente em células vivas. Os protocolos também fornecem uma estratégia baseada em citometria de fluxo de cocoloração para adquirir e analisar múltiplas funções mitocondriais, incluindo volum…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos ao Centro de Imagem Molecular e ao Núcleo de Citometria de Fluxo da Universidade de Bergen, na Noruega. Este trabalho foi apoiado pelo financiamento do Conselho Norueguês de Pesquisa (número de subvenção: 229652), Rakel og Otto Kr.Bruuns legat e do Conselho de Bolsas de Estudo da China (número do projeto: 201906220275).
Materials
| anti-Oct4 | Abcam | ab19857, RRID:AB_445175 | Primary Antibody; use as 1:100, 10 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 488 goat anti-rabbit IgG (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11008) as secondary antibody. |
| anti-SSEA4 | Abcam | ab16287, RRID:AB_778073 | Primary Antibody; use as 1:100, 10 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 594 goat anti-mouse IgG (1:800, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11005) as secondary antibody. |
| anti-Sox2 | Abcam | ab97959, RRID:AB_2341193 | Primary Antibody; use as 1:100, 10 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 488 goat anti-rabbit IgG (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11008) as secondary antibody. |
| anti-Pax6 | Abcam | ab5790, RRID:AB_305110 | Primary Antibody; use as 1:100, 10 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 488 goat anti-rabbit IgG (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11008) as secondary antibody. |
| anti-Nestin | Santa Cruz Biotechnology | sc-23927, RRID:AB_627994 | Primary Antibody; use as 1:50, 20 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 594 goat anti-mouse IgG (1:800, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11005) as secondary antibody. |
| anti-GFAP | Abcam | ab4674, RRID:AB_304558 | Primary Antibody; use as 1:100, 10 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 594 goat anti-chicken IgG (1:800, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11042) as secondary antibody. |
| anti-S100β conjugated with Alexa Fluor 488 | Abcam | ab196442, RRID:AB_2722596 | Primary Antibody; use as 1:400, 2.5 μL in 1000 μL staining solution; |
| anti-TH | Abcam | ab75875, RRID:AB_1310786 | Primary Antibody; use as 1:100, 10 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 488 goat anti-rabbit IgG (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11008) as secondary antibody. |
| anti-Tuj 1 | Abcam | ab78078, RRID:AB_2256751 | Primary Antibody; use as 1:1000, 1 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 594 goat anti-mouse IgG (1:800, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11005) as secondary antibody. |
| anti-Synaptophysin | Abcam | ab32127, RRID:AB_2286949 | Primary Antibody; use as 1:100, 10 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 488 goat anti-rabbit IgG (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11008) as secondary antibody. |
| anti-PSD-95 | Abcam | ab2723, RRID:AB_303248 | Primary Antibody; use as 1:100, 10 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 594 goat anti-chicken IgG (1:800, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11042) as secondary antibody. |
| anti-TFAM conjugated with Alexa Fluor 488 | Abcam | ab198308 | Primary Antibody; use as 1:400, 2.5 μL in 1000 μL staining solution; use mouse monoclonal IgG2b Alexa Fluor® 488 as an isotype control. |
| anti-TOMM20 conjugated with Alexa Fluor 488 | Santa Cruz Biotechnology | Cat# sc-17764 RRID:AB_628381 | Primary Antibody; use as 1:400, 2.5 μL in 1000 μL staining solution; use mouse monoclonal IgG2a Alexa Fluor® 488 as an isotype control. |
| anti-NDUFB10 | Abcam | ab196019 | Primary Antibody; use as 1:1000, 1 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 488 goat anti-rabbit IgG (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11008) as secondary antibody; use rabbit monoclonal IgG as an isotype control. |
| anti-SDHA | Abcam | ab137040 | Primary Antibody; use as 1:1000, 1 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 488 goat anti-rabbit IgG (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11008) as secondary antibody; use rabbit monoclonal IgG as an isotype control. |
| anti-COX IV | Abcam | ab14744, RRID:AB_301443 | Primary Antibody; use as 1:1000, 1 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 488 goat anti-mouse IgG (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11001) as secondary antibody; use mouse monoclonal IgG as an isotype control. |
| Activin A | PeproTech | 120-14E | Astrocyte differentiation medium ingredient |
| ABM Basal Medium | Lonza | CC-3187 | Basal medium for astrocyte culture |
| AGM SingleQuots Supplement Pack | Lonza | CC-4123 | Supplement for astrocyte culture |
| Antibiotic-Antimycotic | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | CDM ingredient |
| Advanced DMEM/F-12 | Thermo Fisher Scientific | 12634010 | Basal medium for dilute Geltrex |
| Bovine Serum Albumin | Europa Bioproducts | EQBAH62-1000 | Blocking agent to prevent non-specific binding of antibodies in immunostaining assays and CDM ingredient |
| BDNF | PeproTech | 450-02 | DA neurons medium ingredient |
| B-27 Supplement | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | Astrocyte differentiation medium ingredient |
| BD Accuri C6 Plus Flow Cytometer | BD Biosciences, USA | ||
| Chemically Defined Lipid Concentrate | Thermo Fisher Scientific | 11905031 | CDM ingredient |
| Collagenase IV | Thermo Fisher Scientific | 17104019 | Reagent for gentle dissociation of human iPSCs |
| CCD Microscope Camera Leica DFC3000 G | Leica Microsystems, Germany | ||
| Corning non-treated culture dishes | Sigma-Aldrich | CLS430589 | Suspension culture |
| DPBS | Thermo Fisher Scientific | 14190250 | Used for a variety of cell culture wash |
| DMEM/F-12, GlutaMAX supplement | Thermo Fisher Scientific | 10565018 | Astrocyte differentiation basal Medium |
| EDTA | Thermo Fisher Scientific | 15575020 | Reagent for gentle dissociation of human iPSCs |
| Essential 8 Basal Medium | Thermo Fisher Scientific | A1516901 | Basal medium for iPSC culture |
| Essential 8 Supplement (50X) | Thermo Fisher Scientific | A1517101 | Supplement for iPSC culture |
| EGF Recombinant Human Protein | Thermo Fisher Scientific | PHG0314 | Supplement for NSC culture |
| FGF-basic (AA 10–155) Recombinant Human Protein | Thermo Fisher Scientific | PHG0024 | Supplement for NSC culture |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | 12103C | Medium ingredient |
| FGF-basic | PeproTech | 100-18B | Astrocyte differentiation medium ingredient |
| FCCP | Abcam | ab120081 | Eliminates mitochondrial membrane potential and TMRE staining |
| Fluid aspiration system BVC control | Vacuubrand, Germany | ||
| Formaldehyde (PFA) 16% | Thermo Fisher Scientific | 28908 | Cell fixation |
| Geltrex | Thermo Fisher Scientific | A1413302 | Used for attachment and maintenance of human iPSCs |
| GlutaMAX Supplement | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | Supplement for NSC culture |
| GDNF | Peprotech | 450-10 | DA neurons medium ingredient |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G8898 | Used for blocking buffer |
| Ham's F-12 Nutrient Mix | Thermo Fisher Scientific | 31765027 | Basal medium for CDM |
| Heregulin beta-1 human | Sigma-Aldrich | SRP3055 | Astrocyte differentiation medium ingredient |
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher Scientific | H1399 | Stain the nuclei for confocal image |
| Heracell 150i CO2 Incubators | Fisher Scientific, USA | ||
| IMDM | Thermo Fisher Scientific | 21980032 | Basal medium for CDM |
| Insulin | Roche | 1376497 | CDM ingredient |
| InSolution AMPK Inhibitor | Sigma-Aldrich | 171261 | Neural induction medium ingredient |
| Insulin-like Growth Factor-I human | Sigma-Aldrich | I3769 | Astrocyte differentiation medium ingredient |
| KnockOut DMEM/F-12 medium | Thermo Fisher Scientific | 12660012 | Basal medium for NSC culture |
| Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | Promotes attachment and growth of neural cells in vitro |
| Leica TCS SP8 STED confocal microscope | Leica Microsystems, Germany | ||
| Monothioglycerol | Sigma-Aldrich | M6145 | CDM ingredient |
| MitoTracker Green FM | Thermo Fisher Scientific | M7514 | Used for mitochondrial volume indicator |
| MitoSox Red | Thermo Fisher Scientific | M36008 | Used for mitochondrial ROS indicator |
| N-Acetyl-L-cysteine | Sigma-Aldrich | A7250 | Neural induction medium ingredient |
| N-2 Supplement | Thermo Fisher Scientific | 17502048 | Astrocyte differentiation medium ingredient |
| Normal goat serum | Thermo Fisher Scientific | PCN5000 | Used for blocking buffer |
| Orbital shakers – SSM1 | Stuart Equipment, UK | ||
| Poly-L-ornithine solution | Sigma-Aldrich | P4957 | Promotes attachment and growth of neural cells in vitro |
| Poly-D-lysine hydrobromide | Sigma-Aldrich | P7405 | Promotes attachment and growth of neural cells in vitro |
| Purmorphamine | STEMCELL Technologies | 72204 | Promotes DA neuron differentiation |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Thermo Fisher Scientific | P36930 | Mounting the coverslip for confocal image |
| PBS 1x | Thermo Fisher Scientific | 18912014 | Used for a variety of wash |
| Recombinant Human/Mouse FGF-8b Protein | R&D Systems | 423-F8-025/CF | Promotes DA neuron differentiation |
| SB 431542 | Tocris Bioscience | TB1614-GMP | Neural Induction Medium ingredient |
| StemPro Neural Supplement | Thermo Fisher Scientific | A10508-01 | Supplement for NSCs culture |
| TrypLE Express Enzyme | Thermo Fisher Scientific | 12604013 | Cell dissociation reagent |
| Transferrin | Roche | 652202 | CDM ingredient |
| TRITON X-100 | VWR International | 9002-93-1 | Used for cells permeabilization in immunostaining assays |
| TMRE | Abcam | ab113852 | Used for mitochondrial membrane potential staining |
| Water Bath Jb Academy Basic Jba5 JBA5 Grant Instruments | Grant Instruments, USA |
Riferimenti
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