İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücrelerde Multipl Mitokondriyal Parametrelerin ve Nöral ve Glial Türevlerinin Akış Sitometrik Analizi
Summary
Bu çalışma, mitokondriyal hacim, mitokondriyal membran potansiyeli, reaktif oksijen türleri seviyesi, mitokondriyal solunum zinciri bileşimi ve mitokondriyal DNA’daki değişiklikleri tespit etmek için iki floresan muhabir veya antikor ile akış sitometrisine ve çift boyamaya dayalı çoklu mitokondriyal fonksiyonel parametreleri ölçmek için yeni bir yaklaşım sunmaktadır.
Abstract
Mitokondri birçok nörodejeneratif hastalığın patofizyolojisinde önemlidir. Mitokondriyal hacimdeki değişiklikler, mitokondriyal membran potansiyeli (MMP), reaktif oksijen türlerinin mitokondriyal üretimi (ROS) ve mitokondriyal DNA (mtDNA) kopya sayısı genellikle bu süreçlerin özellikleridir. Bu rapor, insan kaynaklı pluripotent kök hücreler (iPSC’ler) ve iPSC kaynaklı nöral ve glial hücreler de dahil olmak üzere farklı hücre tiplerinde çoklu mitokondriyal parametreleri ölçmek için yeni bir akış sitometrisine dayalı yaklaşımı detaylandırmaktadır. Bu akış tabanlı strateji, mitokondriyal hacim, MMP ve ROS seviyelerini ölçmek için canlı hücrelerin yanı sıra mitokondriyal solunum zincirinin (MRC) bileşenlerini ve mitokondriyal transkripsiyon faktörü A (TFAM) gibi mtDNA ile ilişkili proteinleri tahmin etmek için sabit hücreleri kullanır.
MitoTracker Green (MTG), tetrametilrodamin etil ester (TMRE) ve MitoSox Red dahil olmak üzere floresan muhabirlerle birlikte boyanarak, mitokondriyal hacim, MMP ve mitokondriyal ROS’taki değişiklikler ölçülebilir ve mitokondriyal içerikle ilişkilendirilebilir. MRC kompleks alt birimlerine ve dış mitokondriyal membran 20 (TOMM20) translokazına karşı antikorlarla çift boyama, MRC alt birim ekspresyonunun değerlendirilmesine izin verir. TFAM miktarı mtDNA kopya sayısı ile orantılı olduğundan, TOMM20 başına TFAM ölçümü, mitokondriyal hacim başına mtDNA’nın dolaylı bir ölçümünü verir. Tüm protokol 2-3 saat içinde gerçekleştirilebilir. Önemli olarak, bu protokoller, akış sitometrisi kullanılarak mitokondriyal parametrelerin hem toplam seviyede hem de mitokondriyal hacim başına spesifik seviyede ölçülmesine izin verir.
Introduction
Mitokondri, hemen hemen tüm ökaryotik hücrelerde bulunan esansiyel organellerdir. Mitokondri, oksidatif fosforilasyon yoluyla adenozin trifosfat (ATP) üreterek enerji tedarikinden sorumludur ve biyosentez ve metabolizma için metabolik aracılar olarak işlev görür. Mitokondri, ROS üretimi, hücre ölümü ve hücre içi Ca2 + regülasyon gibi diğer birçok önemli hücresel süreçte derinden rol oynar. Mitokondriyal disfonksiyon, Parkinson hastalığı (PD), Alzheimer hastalığı (AD), Huntington hastalığı (HD), Friedreich ataksi (FRDA) ve amiyotrofik lateral skleroz (ALS)1 dahil olmak üzere çeşitli nörodejeneratif hastalıklarla ilişkilendirilmiştir. Artmış mitokondriyal disfonksiyon ve mtDNA anormalliğinin de insan yaşlanmasına katkıda bulunduğu düşünülmektedir 2,3.
Nörodejeneratif hastalıklarda çeşitli mitokondriyal disfonksiyon tipleri ortaya çıkar ve mitokondriyal hacimdeki değişiklikler, MMP depolarizasyonu, ROS üretimi ve mtDNA kopya sayısındaki değişiklikler yaygındır 4,5,6,7. Bu nedenle, bu ve diğer mitokondriyal fonksiyonları ölçme yeteneği, hastalık mekanizmalarını incelerken ve potansiyel terapötik ajanları test ederken büyük önem taşımaktadır. Ayrıca, insan nörodejeneratif hastalıklarını sadık bir şekilde kopyalayan hayvan modellerinin eksikliği göz önüne alındığında, beyin hücrelerinde insan hastalığını özetleyen uygun in vitro model sistemlerin kurulması, bu hastalıkların daha iyi anlaşılması ve yeni tedavilerin geliştirilmesi için önemli bir adımdır 2,3,8,9.
İnsan iPSC’leri, nöronal ve nöronal olmayan hücreler (yani, glial hücreler) dahil olmak üzere çeşitli beyin hücreleri üretmek için kullanılabilir ve nörodejeneratif hastalıkla ilişkili mitokondriyal hasar her iki hücre tipinde debulunmuştur 3,10,11,12,13. Nöral ve glial soylara iPSC farklılaşması için uygun yöntemler mevcuttur14,15,16. Bu hücreler, in vitro hastalık modellemesi ve ilaç taraması için benzersiz bir insan / hasta platformu sağlar. Ayrıca, bunlar hastalardan türetildiğinden, iPSC kaynaklı nöronlar ve glial hücreler, insanlarda neler olup bittiğini daha doğru yansıtan hastalık modelleri sağlar.
Bugüne kadar, iPSC’lerde, özellikle canlı nöronlarda ve glial hücrelerde çoklu mitokondriyal fonksiyonel parametreleri ölçmek için birkaç uygun ve güvenilir yöntem mevcuttur. Akış sitometrisinin kullanımı, bilim adamına mitokondriyal fonksiyon da dahil olmak üzere biyolojik parametreleri tek hücrelerde ölçmek için güçlü bir araç sağlar. Bu protokol, iPSC’lerden nöral kök hücreler (NSC’ler), nöronlar ve glial astrositler dahil olmak üzere farklı tipte beyin hücrelerinin yanı sıra iPSC’ler ve iPSC türevi nöral ve glial hücreler de dahil olmak üzere farklı hücre tiplerinde çoklu mitokondriyal parametreleri ölçmek için yeni akış sitometrisine dayalı yaklaşımlar için ayrıntılar sağlar. Protokol ayrıca mitokondriyal hacmi, MMP’yi, mitokondriyal ROS seviyesini, MRC komplekslerini ve TFAM’yi ölçmek için akış sitometrisini kullanmak için bir ortak boyama stratejisi sağlar. Mitokondriyal hacim veya kütle ölçümlerini içererek, bu protokoller mitokondriyal birim başına hem toplam seviyenin hem de spesifik seviyenin ölçülmesine izin verir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada, iPSC kaynaklı nöronlar ve astrositler üretmek ve akış sitometrisi kullanarak mitokondriyal fonksiyonun birçok yönünü değerlendirmek için protokoller bulunmaktadır. Bu protokoller, insan iPSC’lerinin hem nöronlara hem de glial astrositlere verimli bir şekilde dönüştürülmesine ve çoğunlukla canlı hücrelerde mitokondriyal fonksiyonun ayrıntılı karakterizasyonuna izin verir. Protokoller ayrıca, canlı hücrelerde hacim, MMP ve mitokondriyal ROS seviyeleri ve MRC kompleksleri ve sabit hücre…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Norveç’teki Bergen Üniversitesi’ndeki Moleküler Görüntüleme Merkezi ve Akış Sitometrisi Çekirdek Tesisi’ne teşekkür ederiz. Bu çalışma, Norveç Araştırma Konseyi (Hibe numarası: 229652), Rakel og Otto Kr.Bruuns legat ve Çin Burs Konseyi (proje numarası: 201906220275) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| anti-Oct4 | Abcam | ab19857, RRID:AB_445175 | Primary Antibody; use as 1:100, 10 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 488 goat anti-rabbit IgG (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11008) as secondary antibody. |
| anti-SSEA4 | Abcam | ab16287, RRID:AB_778073 | Primary Antibody; use as 1:100, 10 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 594 goat anti-mouse IgG (1:800, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11005) as secondary antibody. |
| anti-Sox2 | Abcam | ab97959, RRID:AB_2341193 | Primary Antibody; use as 1:100, 10 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 488 goat anti-rabbit IgG (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11008) as secondary antibody. |
| anti-Pax6 | Abcam | ab5790, RRID:AB_305110 | Primary Antibody; use as 1:100, 10 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 488 goat anti-rabbit IgG (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11008) as secondary antibody. |
| anti-Nestin | Santa Cruz Biotechnology | sc-23927, RRID:AB_627994 | Primary Antibody; use as 1:50, 20 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 594 goat anti-mouse IgG (1:800, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11005) as secondary antibody. |
| anti-GFAP | Abcam | ab4674, RRID:AB_304558 | Primary Antibody; use as 1:100, 10 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 594 goat anti-chicken IgG (1:800, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11042) as secondary antibody. |
| anti-S100β conjugated with Alexa Fluor 488 | Abcam | ab196442, RRID:AB_2722596 | Primary Antibody; use as 1:400, 2.5 μL in 1000 μL staining solution; |
| anti-TH | Abcam | ab75875, RRID:AB_1310786 | Primary Antibody; use as 1:100, 10 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 488 goat anti-rabbit IgG (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11008) as secondary antibody. |
| anti-Tuj 1 | Abcam | ab78078, RRID:AB_2256751 | Primary Antibody; use as 1:1000, 1 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 594 goat anti-mouse IgG (1:800, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11005) as secondary antibody. |
| anti-Synaptophysin | Abcam | ab32127, RRID:AB_2286949 | Primary Antibody; use as 1:100, 10 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 488 goat anti-rabbit IgG (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11008) as secondary antibody. |
| anti-PSD-95 | Abcam | ab2723, RRID:AB_303248 | Primary Antibody; use as 1:100, 10 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 594 goat anti-chicken IgG (1:800, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11042) as secondary antibody. |
| anti-TFAM conjugated with Alexa Fluor 488 | Abcam | ab198308 | Primary Antibody; use as 1:400, 2.5 μL in 1000 μL staining solution; use mouse monoclonal IgG2b Alexa Fluor® 488 as an isotype control. |
| anti-TOMM20 conjugated with Alexa Fluor 488 | Santa Cruz Biotechnology | Cat# sc-17764 RRID:AB_628381 | Primary Antibody; use as 1:400, 2.5 μL in 1000 μL staining solution; use mouse monoclonal IgG2a Alexa Fluor® 488 as an isotype control. |
| anti-NDUFB10 | Abcam | ab196019 | Primary Antibody; use as 1:1000, 1 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 488 goat anti-rabbit IgG (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11008) as secondary antibody; use rabbit monoclonal IgG as an isotype control. |
| anti-SDHA | Abcam | ab137040 | Primary Antibody; use as 1:1000, 1 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 488 goat anti-rabbit IgG (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11008) as secondary antibody; use rabbit monoclonal IgG as an isotype control. |
| anti-COX IV | Abcam | ab14744, RRID:AB_301443 | Primary Antibody; use as 1:1000, 1 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 488 goat anti-mouse IgG (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11001) as secondary antibody; use mouse monoclonal IgG as an isotype control. |
| Activin A | PeproTech | 120-14E | Astrocyte differentiation medium ingredient |
| ABM Basal Medium | Lonza | CC-3187 | Basal medium for astrocyte culture |
| AGM SingleQuots Supplement Pack | Lonza | CC-4123 | Supplement for astrocyte culture |
| Antibiotic-Antimycotic | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | CDM ingredient |
| Advanced DMEM/F-12 | Thermo Fisher Scientific | 12634010 | Basal medium for dilute Geltrex |
| Bovine Serum Albumin | Europa Bioproducts | EQBAH62-1000 | Blocking agent to prevent non-specific binding of antibodies in immunostaining assays and CDM ingredient |
| BDNF | PeproTech | 450-02 | DA neurons medium ingredient |
| B-27 Supplement | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | Astrocyte differentiation medium ingredient |
| BD Accuri C6 Plus Flow Cytometer | BD Biosciences, USA | ||
| Chemically Defined Lipid Concentrate | Thermo Fisher Scientific | 11905031 | CDM ingredient |
| Collagenase IV | Thermo Fisher Scientific | 17104019 | Reagent for gentle dissociation of human iPSCs |
| CCD Microscope Camera Leica DFC3000 G | Leica Microsystems, Germany | ||
| Corning non-treated culture dishes | Sigma-Aldrich | CLS430589 | Suspension culture |
| DPBS | Thermo Fisher Scientific | 14190250 | Used for a variety of cell culture wash |
| DMEM/F-12, GlutaMAX supplement | Thermo Fisher Scientific | 10565018 | Astrocyte differentiation basal Medium |
| EDTA | Thermo Fisher Scientific | 15575020 | Reagent for gentle dissociation of human iPSCs |
| Essential 8 Basal Medium | Thermo Fisher Scientific | A1516901 | Basal medium for iPSC culture |
| Essential 8 Supplement (50X) | Thermo Fisher Scientific | A1517101 | Supplement for iPSC culture |
| EGF Recombinant Human Protein | Thermo Fisher Scientific | PHG0314 | Supplement for NSC culture |
| FGF-basic (AA 10–155) Recombinant Human Protein | Thermo Fisher Scientific | PHG0024 | Supplement for NSC culture |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | 12103C | Medium ingredient |
| FGF-basic | PeproTech | 100-18B | Astrocyte differentiation medium ingredient |
| FCCP | Abcam | ab120081 | Eliminates mitochondrial membrane potential and TMRE staining |
| Fluid aspiration system BVC control | Vacuubrand, Germany | ||
| Formaldehyde (PFA) 16% | Thermo Fisher Scientific | 28908 | Cell fixation |
| Geltrex | Thermo Fisher Scientific | A1413302 | Used for attachment and maintenance of human iPSCs |
| GlutaMAX Supplement | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | Supplement for NSC culture |
| GDNF | Peprotech | 450-10 | DA neurons medium ingredient |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G8898 | Used for blocking buffer |
| Ham's F-12 Nutrient Mix | Thermo Fisher Scientific | 31765027 | Basal medium for CDM |
| Heregulin beta-1 human | Sigma-Aldrich | SRP3055 | Astrocyte differentiation medium ingredient |
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher Scientific | H1399 | Stain the nuclei for confocal image |
| Heracell 150i CO2 Incubators | Fisher Scientific, USA | ||
| IMDM | Thermo Fisher Scientific | 21980032 | Basal medium for CDM |
| Insulin | Roche | 1376497 | CDM ingredient |
| InSolution AMPK Inhibitor | Sigma-Aldrich | 171261 | Neural induction medium ingredient |
| Insulin-like Growth Factor-I human | Sigma-Aldrich | I3769 | Astrocyte differentiation medium ingredient |
| KnockOut DMEM/F-12 medium | Thermo Fisher Scientific | 12660012 | Basal medium for NSC culture |
| Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | Promotes attachment and growth of neural cells in vitro |
| Leica TCS SP8 STED confocal microscope | Leica Microsystems, Germany | ||
| Monothioglycerol | Sigma-Aldrich | M6145 | CDM ingredient |
| MitoTracker Green FM | Thermo Fisher Scientific | M7514 | Used for mitochondrial volume indicator |
| MitoSox Red | Thermo Fisher Scientific | M36008 | Used for mitochondrial ROS indicator |
| N-Acetyl-L-cysteine | Sigma-Aldrich | A7250 | Neural induction medium ingredient |
| N-2 Supplement | Thermo Fisher Scientific | 17502048 | Astrocyte differentiation medium ingredient |
| Normal goat serum | Thermo Fisher Scientific | PCN5000 | Used for blocking buffer |
| Orbital shakers – SSM1 | Stuart Equipment, UK | ||
| Poly-L-ornithine solution | Sigma-Aldrich | P4957 | Promotes attachment and growth of neural cells in vitro |
| Poly-D-lysine hydrobromide | Sigma-Aldrich | P7405 | Promotes attachment and growth of neural cells in vitro |
| Purmorphamine | STEMCELL Technologies | 72204 | Promotes DA neuron differentiation |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Thermo Fisher Scientific | P36930 | Mounting the coverslip for confocal image |
| PBS 1x | Thermo Fisher Scientific | 18912014 | Used for a variety of wash |
| Recombinant Human/Mouse FGF-8b Protein | R&D Systems | 423-F8-025/CF | Promotes DA neuron differentiation |
| SB 431542 | Tocris Bioscience | TB1614-GMP | Neural Induction Medium ingredient |
| StemPro Neural Supplement | Thermo Fisher Scientific | A10508-01 | Supplement for NSCs culture |
| TrypLE Express Enzyme | Thermo Fisher Scientific | 12604013 | Cell dissociation reagent |
| Transferrin | Roche | 652202 | CDM ingredient |
| TRITON X-100 | VWR International | 9002-93-1 | Used for cells permeabilization in immunostaining assays |
| TMRE | Abcam | ab113852 | Used for mitochondrial membrane potential staining |
| Water Bath Jb Academy Basic Jba5 JBA5 Grant Instruments | Grant Instruments, USA |
Riferimenti
- Wang, Y., Xu, E., Musich, P. R., Lin, F. Mitochondrial dysfunction in neurodegenerative diseases and the potential countermeasure. CNS Neuroscience & Therapeutics. 25 (7), 816-824 (2019).
- Chen, A., et al. Nicotinamide riboside and metformin ameliorate mitophagy defect in induced pluripotent stem cell-derived astrocytes with POLG mutations. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 737304 (2021).
- Liang, K. X., et al. Disease-specific phenotypes in iPSC-derived neural stem cells with POLG mutations. EMBO Molecular Medicine. 12 (10), 12146 (2020).
- Chen, H., Chan, D. C. Mitochondrial dynamics–fusion, fission, movement, and mitophagy–in neurodegenerative diseases. Human Molecular Genetics. 18, 169-176 (2009).
- Lin, M. T., Beal, M. F. Mitochondrial dysfunction and oxidative stress in neurodegenerative diseases. Nature. 443 (7113), 787-795 (2006).
- Singh, A., Kukreti, R., Saso, L., Kukreti, S. Oxidative stress: A key modulator in neurodegenerative diseases. Molecules. 24 (8), 1583 (2019).
- Kondadi, A. K., Anand, R., Reichert, A. S. Functional interplay between cristae biogenesis, mitochondrial dynamics and mitochondrial DNA integrity. International Journal of Molecular Sciences. 20 (17), 4311 (2019).
- Sterneckert, J. L., Reinhardt, P., Schöler, H. R. Investigating human disease using stem cell models. Nature Reviews. Genetics. 15 (9), 625-639 (2014).
- Patani, R. Human stem cell models of disease and the prognosis of academic medicine. Nature Medicine. 26 (4), 449 (2020).
- Liang, K. X., et al. N-acetylcysteine amide ameliorates mitochondrial dysfunction and reduces oxidative stress in hiPSC-derived dopaminergic neurons with POLG mutation. Experimental Neurology. , 337 (2021).
- Kikuchi, T., et al. Human iPS cell-derived dopaminergic neurons function in a primate Parkinson’s disease model. Nature. 548 (7669), 592-596 (2017).
- Juopperi, T. A., et al. Astrocytes generated from patient induced pluripotent stem cells recapitulate features of Huntington’s disease patient cells. Molecular Brain. 5, 17 (2012).
- Liang, K. X., et al. Stem cell derived astrocytes with POLG mutations and mitochondrial dysfunction including abnormal NAD+ metabolism is toxic for neurons. bioRxiv. , (2020).
- Liu, Q., et al. Human neural crest stem cells derived from human ESCs and induced pluripotent stem cells: induction, maintenance, and differentiation into functional schwann cells. Stem Cells Translational Medicine. 1 (4), 266-278 (2012).
- Hong, Y. J., Do, J. T. Neural lineage differentiation from pluripotent stem cells to mimic human brain tissues. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 400 (2019).
- Lundin, A., et al. Human iPS-derived astroglia from a stable neural precursor state show improved functionality compared with conventional astrocytic models. Stem Cell Reports. 10 (3), 1030-1045 (2018).
- Liang, K. X., et al. N-acetylcysteine amide ameliorates mitochondrial dysfunction and reduces oxidative stress in hiPSC-derived dopaminergic neurons with POLG mutation. Experimental Neurology. 337, 113536 (2021).
- Pendergrass, W., Wolf, N., Poot, M. Efficacy of MitoTracker Green™ and CMXrosamine to measure changes in mitochondrial membrane potentials in living cells and tissues. Cytometry. Part A. 61 (2), 162-169 (2004).
- Keij, J. F., Bell-Prince, C., Steinkamp, J. A. Staining of mitochondrial membranes with 10-nonyl acridine orange, MitoFluor Green, and MitoTracker Green is affected by mitochondrial membrane potential altering drugs. Cytometry. 39 (3), 203-210 (2000).
- Buckman, J. F., et al. MitoTracker labeling in primary neuronal and astrocytic cultures: influence of mitochondrial membrane potential and oxidants. Journal of Neuroscience Methods. 104 (2), 165-176 (2001).
- Zanchetta, L. M., Kirk, D., Lyng, F., Walsh, J., Murphy, J. E. Cell-density-dependent changes in mitochondrial membrane potential and reactive oxygen species production in human skin cells post sunlight exposure. Photodermatology, Photoimmunology & Photomedicine. 26 (6), 311-317 (2010).
