Isolatie van primaire patiëntspecifieke gladde spiercellen van aorta en semikwantitatieve real-time contractiemetingen in vitro
Summary
Dit artikel beschrijft een op explantcultuur gebaseerde methode voor de isolatie en kweek van primaire, patiëntspecifieke menselijke aorta gladde spiercellen en dermale fibroblasten. Verder wordt een nieuwe methode gepresenteerd voor het meten van celcontractie en daaropvolgende analyse, die kan worden gebruikt om patiëntspecifieke verschillen in deze cellen te bestuderen.
Abstract
Gladde spiercellen (SMC’s) zijn het overheersende celtype in de aortamedia. Hun contractiele machinerie is belangrijk voor de overdracht van kracht in de aorta en reguleert vasoconstrictie en vaatverwijding. Mutaties in genen die coderen voor de SMC contractiele apparaateiwitten zijn geassocieerd met aortaziekten, zoals thoracale aorta-aneurysma’s. Het meten van SMC-contractie in vitro is een uitdaging, vooral op een high-throughput manier, wat essentieel is voor het screenen van patiëntmateriaal. De momenteel beschikbare methoden zijn niet geschikt voor dit doel. Dit artikel presenteert een nieuwe methode op basis van elektrische cel-substraat impedantie sensing (ECIS). Ten eerste wordt een explantprotocol beschreven om patiëntspecifieke menselijke primaire SMC’s te isoleren van aortabiopten en patiëntspecifieke menselijke primaire dermale fibroblasten voor de studie van aorta-aneurysma’s. Vervolgens wordt een gedetailleerde beschrijving gegeven van een nieuwe contractiemethode om de contractiele respons van deze cellen te meten, inclusief de daaropvolgende analyse en suggestie voor het vergelijken van verschillende groepen. Deze methode kan worden gebruikt om de samentrekking van adherente cellen te bestuderen in het kader van translationele (cardiovasculaire) studies en patiënt- en medicijnscreeningstudies.
Introduction
Gladde spiercellen (SMC’s) zijn het overheersende celtype in de aortamediale laag, de dikste laag van de aorta. Binnen de muur zijn ze radiaal georiënteerd en zijn ze betrokken bij onder andere vasoconstrictie en vaatverwijding1. De SMC contractiele machinerie is betrokken bij de overdracht van kracht in de aorta via de functionele link met de extracellulaire matrix2. Mutaties in genen die coderen voor de eiwitten van het SMC-contractiele apparaat, zoals gladde spier myosine zware keten (MYH11) en gladde spier actine (ACTA2), zijn gerelateerd aan gevallen van familiale thoracale aorta-aneurysmata, wat de relevantie van SMC-contractie voor het behoud van de structurele en functionele integriteit van de aortaonderstreept 1,2 . Bovendien zijn mutaties in de TGFβ-signaleringsroute ook geassocieerd met aorta-aneurysma’s en hun effecten in de pathofysiologie van aorta-aneurysma kunnen ook worden bestudeerd in huidfibroblasten3.
High-throughput meting van SMC-contractie in vitro is een uitdaging. Aangezien SMC-contractiliteit niet in vivo bij mensen kan worden gemeten, vormen in vitro testen op menselijke cellen een haalbaar alternatief. Bovendien wordt de ontwikkeling van abdominaal aorta-aneurysma (AAA) in diermodellen chemisch geïnduceerd door bijvoorbeeld elastaseperfusie, of veroorzaakt door een specifieke mutatie. Daarom zijn diergegevens niet vergelijkbaar met AAA-ontwikkeling bij mensen, die meestal een multifactoriële oorzaak heeft, zoals roken, leeftijd en / of atherosclerose. In vitro SMC-contractiliteit is tot nu toe voornamelijk gemeten door tractiekrachtmicroscopie 4,5, kwantificering van Fura-2 fluorescentie intracellulaire calciumfluxen6 en collageenrimpelingstests7. Hoewel tractiekrachtmicroscopie onschatbare numerieke inzichten biedt in de krachten die door een enkele cel worden gegenereerd, is het niet geschikt voor screening met hoge doorvoer vanwege de complexe wiskundige gegevensverwerking en de analyse van één cel tegelijk, wat betekent dat het zeer tijdrovend is om een representatief aantal cellen per donor te meten. Fura-2 kleurstof en collageen rimpeling assays maken de oppervlakkige bepaling van contractie mogelijk en geven geen precieze numerieke output, waardoor ze minder geschikt zijn voor het onderscheiden van patiëntspecifieke verschillen. Verminderde SMC-contractie in cellen afgeleid van de aorta van abdominale aorta-aneurysmapatiënten werd voor het eerst aangetoond door een nieuwe methode voor het meten van SMC-contractie in vitrote optimaliseren 8. Dit werd gedaan door de elektrische cel-substraat impedantie sensing (ECIS) methode opnieuw te gebruiken. ECIS is een real-time, medium-throughput assay voor de kwantificering van aanhangende celgedrag en contractie 9,10,11 zoals SMC-groei en -gedrag in wondgenezings- en migratietests 12,13,14. De exacte methode wordt beschreven in de protocolsectie. Op deze geoptimaliseerde manier kan het ECIS ook worden gebruikt om fibroblastcontractie te bestuderen vanwege hun vergelijkbare grootte en morfologie.
Het doel van dit artikel is om een stapsgewijze beschrijving te geven van de methode voor het meten van SMC-contractie in vitro met ecis8 en het vergelijken van de contractie tussen controle en patiënt SMC’s. Eerst wordt de isolatie en kweek van primaire SMC’s van controle- en patiëntaortabiopten uitgelegd, die kunnen worden gebruikt voor contractiemeting. Ten tweede worden contractiemetingen en -analyses, naast de verificatie van SMC-markerexpressie, beschreven. Verder beschrijft dit artikel de methode voor de isolatie van patiëntspecifieke dermale fibroblasten waarvan de contractie met dezelfde methodologie kan worden gemeten. Deze cellen kunnen worden gebruikt voor patiëntspecifieke studies gericht op aorta-aneurysma of andere cardiovasculaire pathologieën15 of prognostische studies met behulp van een transdifferentiatieprotocol dat contractiemeting voorafgaand aan aneurysmachirurgiemogelijk maakt 16.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dit artikel presenteert een methode om SMC-contractie in vitro te meten, gebaseerd op de veranderingen in impedantie en oppervlaktebezetting. Eerst wordt de isolatie, kweek en uitbreiding van patiëntspecifieke primaire menselijke SMC’s en huidfibroblasten beschreven, gevolgd door hoe ze te gebruiken voor contractiemetingen.
Een beperking van het onderzoek houdt verband met het verkrijgen van de cellen via een explantprotocol. De cellen die zich vermenigvuldigen uit de biopsie kunnen…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken Tara van Merrienboer, Albert van Wijk, Jolanda van der Velden, Jan D. Blankensteijn, Lan Tran, Peter L. Hordijk, het PAREL-AAA team en alle vaatchirurgen van het Amsterdam UMC, Zaans Medisch Centrum en Dijklander ziekenhuis voor het leveren van materialen en ondersteuning voor dit onderzoek.
Materials
| 96-well Array | Applied Biophysics | 96W10idf PET | Array used to measure contraction in the ECIS setup |
| Custodiol | Dr. Franz Höhler Chemie GmbH | RVG 12801 | Solution used to transfer tissue in from surgery room to laboratorium |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | 472301 | Solution used to dilute ionomycin |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 26140079 | Addition to cell culture medium |
| Ham's F-10 Nutrient Mix | Gibco | 11550043 | Medium used to culture skin fibroblasts |
| Human Vascular Smooth Muscle Cell Basal Medium (formerly ''Medium 231'') | Gibco | M231500 | Medium used to culture smooth muscle cells |
| Invitrogen countess II | Thermo Fisher Scientific | AMQAX1000 | Automated cell counter |
| Ionomycin calcium salt from Streptomyces conglobatus | Sigma-Aldrich | I0634-1MG | Compound used for contraction stimulation |
| NaCl 0.9% | Fresenius Kabi | B230561 | Solution used to transfer tissue in from surgery room to laboratorium |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | Antibiotics used for cell culture medium |
| Phospathe buffered saline | Gibco | 10010023 | Used to wash cells |
| Quick-RNA Miniprep Kit | Zymo Research | R1055 | Kit used for RNA isolation |
| Smooth Muscle Growth Supplement (SMGS) | Gibco | S00725 | Supplement which is added to smooth muscle cell culture medium |
| SuperScript VILO cDNA Synthesis Kit | Thermo Fisher Scientific | 11754250 | Kit used for cDNA synthesis |
| SYBR Green PCR Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4309155 | Reagent for qPCR |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 15400-054 | Used to trypsinize cells |
| ZTheta | Applied Biophysics | ZTheta | ECIS instrument used for contraction measurements |
Riferimenti
- Milewicz, D. M., et al. Genetic basis of thoracic aortic aneurysms and dissections: focus on smooth muscle cell contractile dysfunction. Annual Review of Genomics and Human Genetics. 9, 283-302 (2008).
- Milewicz, D. M., et al. Altered smooth muscle cell force generation as a driver of thoracic aortic aneurysms and dissections. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 37 (1), 26-34 (2017).
- Groeneveld, M. E., et al. Betaglycan (TGFBR3) up-regulation correlates with increased TGF-β signaling in Marfan patient fibroblasts in vitro. Cardiovascular Pathology. 32, 44-49 (2018).
- Chen, J., Li, H., SundarRaj, N., Wang, J. H. C. Alpha-smooth muscle actin expression enhances cell traction force. Cell Motility and the Cytoskeleton. 64 (4), 248-257 (2007).
- Peyton, S. R., Putnam, A. J. Extracellular matrix rigidity governs smooth muscle cell motility in a biphasic fashion. Journal of Cellular Physiology. 204 (1), 198-209 (2005).
- Williams, D. A., Fogarty, K. E., Tsien, R. Y., Fay, F. S. Calcium gradients in single smooth muscle cells revealed by the digital imaging microscope using Fura-2. Nature. 318 (6046), 558-561 (1985).
- Wu, D., et al. NLRP3 (nucleotide oligomerization domain-like receptor family, pyrin domain containing 3)-caspase-1 inflammasome degrades contractile proteins: implications for aortic biomechanical dysfunction and aneurysm and dissection formation. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 37 (4), 694-706 (2017).
- Bogunovic, N., et al. Impaired smooth muscle cell contractility as a novel concept of abdominal aortic aneurysm pathophysiology. Scientific Reports. 9 (1), 1-14 (2019).
- Hurst, V., Goldberg, P. L., Minnear, F. L., Heimark, R. L., Vincent, P. A. Rearrangement of adherens junctions by transforming growth factor-β1: role of contraction. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 276 (4), 582-595 (1999).
- Hu, N., et al. Comparison between ECIS and LAPS for establishing a cardiomyocyte-based biosensor. Sensors and Actuators B: Chemical. 185, 238-244 (2013).
- Peters, M. F., Lamore, S. D., Guo, L., Scott, C. W., Kolaja, K. L. Human stem cell-derived cardiomyocytes in cellular impedance assays: bringing cardiotoxicity screening to the front line. Cardiovascular Toxicology. 15 (2), 127-139 (2015).
- Zhang, S., Yang, Y., Kone, B. C., Allen, J. C., Kahn, A. M. Insulin-stimulated cyclic guanosine monophosphate inhibits vascular smooth muscle cell migration by inhibiting Ca/calmodulin-dependent protein kinase II. Circulation. 107 (11), 1539-1544 (2003).
- Halterman, J. A., Kwon, H. M., Zargham, R., Bortz, P. D. S., Wamhoff, B. R. Nuclear factor of activated T cells 5 regulates vascular smooth muscle cell phenotypic modulation. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 31 (10), 2287-2296 (2011).
- Bass, H. M., Beard, R. S., Cha, B. J., Yuan, S. Y., Nelson, P. R. Thrombomodulin induces a quiescent phenotype and inhibits migration in vascular smooth muscle cells in vitro. Annals of Vascular Surgery. 30, 149-156 (2016).
- Burger, J., et al. Molecular phenotyping and functional assessment of smooth muscle like-cells with pathogenic variants in aneurysm genes ACTA2, MYH11, SMAD3 and FBN1. Human Molecular Genetics. , (2021).
- Yeung, K. K., et al. Transdifferentiation of human dermal fibroblasts to smooth muscle-like cells to study the effect of MYH11 and ACTA2 mutations in aortic aneurysms. Human Mutation. 38 (4), 439-450 (2017).
