בידוד של תאי שריר חלק אבי העורקים העיקריים הספציפיים למטופל ומדידות כיווץ חצי-קוונטיטיביות בזמן אמת במבחנה
Summary
מאמר זה מתאר שיטה מבוססת תרבית אקספלנט לבידוד וגידול של תאי שריר חלקים ראשוניים של אבי העורקים האנושיים הספציפיים לחולה ופיברובלסטים עוריים. יתר על כן, מוצגת שיטה חדשנית למדידת התכווצות תאים וניתוח לאחר מכן, אשר ניתן להשתמש בה כדי לחקור הבדלים ספציפיים לחולה בתאים אלה.
Abstract
תאי שריר חלקים (SMCs) הם סוג התא השולט במדיה אבי העורקים. המכונות החוזיות שלהם חשובות להעברת כוח באבי העורקים ומווסתות את כלי הדם ואת הרחבת כלי הדם. מוטציות בגנים המקודדים לחלבונים של מנגנון החוזה SMC קשורות למחלות אבי העורקים, כגון מפרצות אבי העורקים החזי. מדידת התכווצות SMC במבחנה היא מאתגרת, במיוחד באופן בעל תפוקה גבוהה, החיוני לסינון חומר המטופל. השיטות הזמינות כיום אינן מתאימות למטרה זו. מאמר זה מציג שיטה חדשנית המבוססת על חישת עכבה חשמלית של מצע התא (ECIS). ראשית, פרוטוקול אקספלנט מתואר כדי לבודד את ה-SMCs הראשוניים האנושיים הספציפיים למטופל מביופסיות אבי העורקים ופיברובלסטים עוריים ראשוניים אנושיים ספציפיים למטופל לצורך חקר מפרצות אבי העורקים. לאחר מכן, תיאור מפורט של שיטת כיווץ חדשה ניתן כדי למדוד את תגובת ההתכווצות של תאים אלה, כולל הניתוח הבא והצעה להשוואת קבוצות שונות. ניתן להשתמש בשיטה זו כדי לחקור את התכווצות התאים הדבקים בהקשר של מחקרים תרגומיים (לב וכלי דם) ומחקרי סינון חולים ותרופות.
Introduction
תאי שריר חלקים (SMCs) הם סוג התא השולט בשכבה המדיאלית של אבי העורקים, השכבה העבה ביותר של אבי העורקים. בתוך הקיר, הם מכוונים רדיאלית ומעורבים, בין שאר הפונקציות, vasoconstriction ו vasodlitation1. מנגנון התכווצות SMC מעורב בהעברת כוח באבי העורקים באמצעות הקשר הפונקציונלי עם המטריצה החוץ-תאית2. מוטציות בגנים המקודדים לחלבונים של מנגנון התכווצות SMC, כגון שרשרת כבדה של מיוזין שרירי חלק (MYH11) ואקטין שריר חלק (ACTA2), היו קשורות למקרים של מפרצות אבי העורקים החזי המשפחתי, מה שמדגיש את הרלוונטיות של התכווצות SMC בשמירה על השלמות המבנית והתפקודית של אבי העורקים 1,2 . יתר על כן, מוטציות במסלול האיתות TGFβ קשורות גם למפרצת אבי העורקים, וניתן לחקור את השפעותיהן בפתופיזיולוגיה של מפרצת אבי העורקים גם בפיברובלסטים בעור3.
מדידת תפוקה גבוהה של התכווצות SMC במבחנה היא מאתגרת. מכיוון שלא ניתן למדוד את התכווצות ה-SMC in vivo בבני אדם, בדיקות במבחנה על תאים אנושיים מהוות חלופה אפשרית. יתר על כן, התפתחות מפרצת אבי העורקים הבטני (AAA) במודלים של בעלי חיים מושרית כימית על ידי, למשל, זלוף אלסטאז, או נגרמת על ידי מוטציה ספציפית. לכן, נתוני בעלי חיים אינם דומים להתפתחות AAA בבני אדם, שלרוב יש לה גורם רב-גורמי, כגון עישון, גיל ו/או טרשת עורקים. במבחנה התכווצות SMC נמדדה עד כה בעיקר על ידי מיקרוסקופיית כוח מתיחה 4,5, כימות של שטפי סידן תוך תאיים פלואורסצנטיים של Fura-26, ומבחני קולגן מתקתקים7. בעוד שמיקרוסקופיית כוח המתיחה מספקת תובנה מספרית שלא תסולא בפז לגבי הכוחות הנוצרים על ידי תא יחיד, היא אינה מתאימה לסינון בתפוקה גבוהה בשל עיבוד הנתונים המתמטי המורכבים וניתוח של תא אחד בכל פעם, כלומר לוקח זמן רב למדוד מספר מייצג של תאים לכל תורם. מבחני צבע Fura-2 וקירור קולגן מאפשרים קביעה שטחית של התכווצות ואינם נותנים תפוקה מספרית מדויקת, מה שהופך אותם לפחות מתאימים להבחנה בהבדלים ספציפיים למטופל. פגיעה בהתכווצות SMC בתאים שמקורם באבי העורקים של חולי מפרצת באבי העורקים הבטני הודגמה לראשונה על ידי אופטימיזציה של שיטה חדשנית למדידת התכווצות SMC במבחנה8. זה נעשה על ידי ייעוד מחדש של שיטת חישת העכבה של המצע התא החשמלי (ECIS). ECIS הוא מבחן בתפוקה בינונית בזמן אמת לכימות התנהגות התאים הדבקים והתכווצות 9,10,11 כגון גדילה והתנהגות של SMC במבחני ריפוי ונדידה של פצעים 12,13,14. השיטה המדויקת מתוארת בסעיף הפרוטוקול. בדרך אופטימלית זו, ניתן להשתמש ב- ECIS גם כדי לחקור התכווצות פיברובלסטים בשל גודלם ומורפולוגיה דומים.
מטרת מאמר זה היא לספק תיאור מעמיק של השיטה למדידת התכווצות SMC במבחנה באמצעות ECIS8 והשוואת ההתכווצות בין בקרת עסקים קטנים ובינוניים למטופלים. ראשית, מוסבר הבידוד והתרבות של עסקים קטנים ובינוניים ראשוניים מביופסיות בקרה ואבי העורקים של המטופל, אשר יכולות לשמש למדידת התכווצות. שנית, מתוארים מדידות וניתוחים של התכווצות, לצד אימות ביטוי סמן SMC. יתר על כן, מאמר זה מתאר את השיטה לבידוד של פיברובלסטים עוריים ספציפיים לחולה, אשר ניתן למדוד את התכווצותם באמצעות אותה מתודולוגיה. תאים אלה יכולים לשמש למחקרים ספציפיים לחולה המתמקדים במפרצת אבי העורקים או בפתולוגיות קרדיווסקולריות אחרות15 או למחקרים פרוגנוסטיים באמצעות פרוטוקול טרנסדיפרנטיזציה המאפשר מדידת התכווצות לפני ניתוח מפרצת16.
Protocol
Representative Results
Discussion
מאמר זה מציג שיטה למדידת התכווצות SMC במבחנה, בהתבסס על השינויים בעכבה ובעיסוק פני השטח. ראשית, מתואר הבידוד, התרבות וההתרחבות של עסקים קטנים ובינוניים אנושיים ראשוניים ספציפיים למטופל ופיברובלסטים של העור, ולאחר מכן כיצד להשתמש בהם למדידות התכווצות.
מגבלה של המחקר קשו…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו רוצים להודות תודה לטארה ואן מריינבואר, אלברט ואן ויק, יולנדה ואן דר ולדן, יאן ד. בלנקנשטיין, לאן טראן, פיטר ל. הורדייק, צוות PAREL-AAA, וכל מנתחי כלי הדם של UMC באמסטרדם, Zaans Medisch Centrum ובית החולים Dijklander על אספקת חומרים ותמיכה למחקר זה.
Materials
| 96-well Array | Applied Biophysics | 96W10idf PET | Array used to measure contraction in the ECIS setup |
| Custodiol | Dr. Franz Höhler Chemie GmbH | RVG 12801 | Solution used to transfer tissue in from surgery room to laboratorium |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | 472301 | Solution used to dilute ionomycin |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 26140079 | Addition to cell culture medium |
| Ham's F-10 Nutrient Mix | Gibco | 11550043 | Medium used to culture skin fibroblasts |
| Human Vascular Smooth Muscle Cell Basal Medium (formerly ''Medium 231'') | Gibco | M231500 | Medium used to culture smooth muscle cells |
| Invitrogen countess II | Thermo Fisher Scientific | AMQAX1000 | Automated cell counter |
| Ionomycin calcium salt from Streptomyces conglobatus | Sigma-Aldrich | I0634-1MG | Compound used for contraction stimulation |
| NaCl 0.9% | Fresenius Kabi | B230561 | Solution used to transfer tissue in from surgery room to laboratorium |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | Antibiotics used for cell culture medium |
| Phospathe buffered saline | Gibco | 10010023 | Used to wash cells |
| Quick-RNA Miniprep Kit | Zymo Research | R1055 | Kit used for RNA isolation |
| Smooth Muscle Growth Supplement (SMGS) | Gibco | S00725 | Supplement which is added to smooth muscle cell culture medium |
| SuperScript VILO cDNA Synthesis Kit | Thermo Fisher Scientific | 11754250 | Kit used for cDNA synthesis |
| SYBR Green PCR Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4309155 | Reagent for qPCR |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 15400-054 | Used to trypsinize cells |
| ZTheta | Applied Biophysics | ZTheta | ECIS instrument used for contraction measurements |
Riferimenti
- Milewicz, D. M., et al. Genetic basis of thoracic aortic aneurysms and dissections: focus on smooth muscle cell contractile dysfunction. Annual Review of Genomics and Human Genetics. 9, 283-302 (2008).
- Milewicz, D. M., et al. Altered smooth muscle cell force generation as a driver of thoracic aortic aneurysms and dissections. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 37 (1), 26-34 (2017).
- Groeneveld, M. E., et al. Betaglycan (TGFBR3) up-regulation correlates with increased TGF-β signaling in Marfan patient fibroblasts in vitro. Cardiovascular Pathology. 32, 44-49 (2018).
- Chen, J., Li, H., SundarRaj, N., Wang, J. H. C. Alpha-smooth muscle actin expression enhances cell traction force. Cell Motility and the Cytoskeleton. 64 (4), 248-257 (2007).
- Peyton, S. R., Putnam, A. J. Extracellular matrix rigidity governs smooth muscle cell motility in a biphasic fashion. Journal of Cellular Physiology. 204 (1), 198-209 (2005).
- Williams, D. A., Fogarty, K. E., Tsien, R. Y., Fay, F. S. Calcium gradients in single smooth muscle cells revealed by the digital imaging microscope using Fura-2. Nature. 318 (6046), 558-561 (1985).
- Wu, D., et al. NLRP3 (nucleotide oligomerization domain-like receptor family, pyrin domain containing 3)-caspase-1 inflammasome degrades contractile proteins: implications for aortic biomechanical dysfunction and aneurysm and dissection formation. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 37 (4), 694-706 (2017).
- Bogunovic, N., et al. Impaired smooth muscle cell contractility as a novel concept of abdominal aortic aneurysm pathophysiology. Scientific Reports. 9 (1), 1-14 (2019).
- Hurst, V., Goldberg, P. L., Minnear, F. L., Heimark, R. L., Vincent, P. A. Rearrangement of adherens junctions by transforming growth factor-β1: role of contraction. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 276 (4), 582-595 (1999).
- Hu, N., et al. Comparison between ECIS and LAPS for establishing a cardiomyocyte-based biosensor. Sensors and Actuators B: Chemical. 185, 238-244 (2013).
- Peters, M. F., Lamore, S. D., Guo, L., Scott, C. W., Kolaja, K. L. Human stem cell-derived cardiomyocytes in cellular impedance assays: bringing cardiotoxicity screening to the front line. Cardiovascular Toxicology. 15 (2), 127-139 (2015).
- Zhang, S., Yang, Y., Kone, B. C., Allen, J. C., Kahn, A. M. Insulin-stimulated cyclic guanosine monophosphate inhibits vascular smooth muscle cell migration by inhibiting Ca/calmodulin-dependent protein kinase II. Circulation. 107 (11), 1539-1544 (2003).
- Halterman, J. A., Kwon, H. M., Zargham, R., Bortz, P. D. S., Wamhoff, B. R. Nuclear factor of activated T cells 5 regulates vascular smooth muscle cell phenotypic modulation. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 31 (10), 2287-2296 (2011).
- Bass, H. M., Beard, R. S., Cha, B. J., Yuan, S. Y., Nelson, P. R. Thrombomodulin induces a quiescent phenotype and inhibits migration in vascular smooth muscle cells in vitro. Annals of Vascular Surgery. 30, 149-156 (2016).
- Burger, J., et al. Molecular phenotyping and functional assessment of smooth muscle like-cells with pathogenic variants in aneurysm genes ACTA2, MYH11, SMAD3 and FBN1. Human Molecular Genetics. , (2021).
- Yeung, K. K., et al. Transdifferentiation of human dermal fibroblasts to smooth muscle-like cells to study the effect of MYH11 and ACTA2 mutations in aortic aneurysms. Human Mutation. 38 (4), 439-450 (2017).
