प्राथमिक रोगी-विशिष्ट महाधमनी चिकनी मांसपेशी कोशिकाओं और विट्रो में अर्धमात्रात्मक वास्तविक समय संकुचन माप का अलगाव
Summary
यह पेपर प्राथमिक, रोगी-विशिष्ट मानव महाधमनी चिकनी मांसपेशी कोशिकाओं और त्वचीय फाइब्रोब्लास्ट्स के अलगाव और खेती के लिए एक स्पष्टीकरण संस्कृति-आधारित विधि का वर्णन करता है। इसके अलावा, सेल संकुचन और बाद के विश्लेषण को मापने के लिए एक उपन्यास विधि प्रस्तुत की जाती है, जिसका उपयोग इन कोशिकाओं में रोगी-विशिष्ट अंतरों का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है।
Abstract
चिकनी मांसपेशी कोशिकाएं (एसएमसी) महाधमनी मीडिया में प्रमुख सेल प्रकार हैं। उनकी संकुचनशील मशीनरी महाधमनी में बल के संचरण के लिए महत्वपूर्ण है और वाहिकासंकीर्णन और वासोडिलेशन को नियंत्रित करती है। एसएमसी संकुचनशील उपकरण प्रोटीन के लिए एन्कोडिंग जीन में उत्परिवर्तन महाधमनी रोगों से जुड़े होते हैं, जैसे कि वक्षीय महाधमनी एन्यूरिज्म। विट्रो में एसएमसी संकुचन को मापना चुनौतीपूर्ण है, विशेष रूप से एक उच्च-थ्रूपुट तरीके से, जो रोगी सामग्री की स्क्रीनिंग के लिए आवश्यक है। वर्तमान में उपलब्ध तरीके इस उद्देश्य के लिए उपयुक्त नहीं हैं। यह पेपर इलेक्ट्रिक सेल-सब्सट्रेट प्रतिबाधा संवेदन (ईसीआईएस) पर आधारित एक उपन्यास विधि प्रस्तुत करता है। सबसे पहले, महाधमनी एन्यूरिज्म के अध्ययन के लिए महाधमनी बायोप्सी और रोगी-विशिष्ट मानव प्राथमिक त्वचीय फाइब्रोब्लास्ट्स से रोगी-विशिष्ट मानव प्राथमिक एसएमसी को अलग करने के लिए एक स्पष्टीकरण प्रोटोकॉल का वर्णन किया गया है। अगला, इन कोशिकाओं की संकुचन प्रतिक्रिया को मापने के लिए एक नई संकुचन विधि का एक विस्तृत विवरण दिया गया है, जिसमें बाद के विश्लेषण और विभिन्न समूहों की तुलना के लिए सुझाव शामिल हैं। इस विधि का उपयोग ट्रांसलेशनल (कार्डियोवैस्कुलर) अध्ययन और रोगी और दवा स्क्रीनिंग अध्ययनों के संदर्भ में अनुयायी कोशिकाओं के संकुचन का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है।
Introduction
चिकनी मांसपेशी कोशिकाएं (एसएमसी) महाधमनी औसत दर्जे की परत में प्रमुख सेल प्रकार हैं, जो महाधमनी की सबसे मोटी परत है। दीवार के भीतर, वे रेडियल रूप से उन्मुख हैं और अन्य कार्यों के बीच, वाहिकासंकीर्णन और वासोडिलेशन1 में शामिल हैं। एसएमसी संकुचनशील मशीनरी एक्स्ट्रासेल्युलर मैट्रिक्स2 के साथ कार्यात्मक लिंक के माध्यम से महाधमनी में बल के संचरण में शामिल है। एसएमसी संकुचन तंत्र के प्रोटीन के लिए एन्कोडिंग जीन में उत्परिवर्तन, जैसे कि चिकनी मांसपेशी मायोसिन भारी श्रृंखला (MYH11) और चिकनी मांसपेशी एक्टिन (ACTA2), पारिवारिक वक्षीय महाधमनी एन्यूरिज्म के मामलों से संबंधित हैं, जो महाधमनी 1,2 की संरचनात्मक और कार्यात्मक अखंडता को बनाए रखने में एसएमसी संकुचन की प्रासंगिकता को रेखांकित करते हैं। . इसके अलावा, टीजीएफ सिग्नलिंग मार्ग में उत्परिवर्तन भी महाधमनी एन्यूरिज्म से जुड़े होते हैं, और महाधमनी एन्यूरिज्म पैथोफिजियोलॉजी में उनके प्रभावों का अध्ययन त्वचा फाइब्रोब्लास्ट्स 3 में भी किया जा सकताहै।
विट्रो में एसएमसी संकुचन का उच्च-थ्रूपुट माप चुनौतीपूर्ण है। जैसा कि एसएमसी संकुचन को मनुष्यों में विवो में मापा नहीं जा सकता है, मानव कोशिकाओं पर इन विट्रो एसेस एक व्यवहार्य विकल्प प्रस्तुत करते हैं। इसके अलावा, पशु मॉडल में पेट महाधमनी एन्यूरिज्म (एएए) विकास या तो रासायनिक रूप से प्रेरित होता है, उदाहरण के लिए, इलास्टेज़ परफ्यूजन, या एक विशिष्ट उत्परिवर्तन के कारण होता है। इसलिए, जानवरों के डेटा मनुष्यों में एएए विकास के लिए तुलनीय नहीं हैं, जिसमें ज्यादातर धूम्रपान, उम्र और / या एथेरोस्क्लेरोसिस जैसे मल्टीफैक्टोरियल कारण होते हैं। इन विट्रो एसएमसी संकुचन को अब तक मुख्य रूप से कर्षण बल माइक्रोस्कोपी 4,5, फुरा -2 प्रतिदीप्ति इंट्रासेल्युलर कैल्शियम फ्लक्स6 के परिमाणीकरण, और कोलेजन झुर्रियोंके द्वारा मापा गया है। जबकि कर्षण बल माइक्रोस्कोपी एक एकल सेल द्वारा उत्पन्न बलों में अमूल्य संख्यात्मक अंतर्दृष्टि प्रदान करता है, यह जटिल गणितीय डेटा प्रसंस्करण और एक समय में एक सेल के विश्लेषण के कारण उच्च-थ्रूपुट स्क्रीनिंग के लिए उपयुक्त नहीं है, जिसका अर्थ है कि प्रति दाता कोशिकाओं की प्रतिनिधि संख्या को मापने के लिए यह बहुत समय लेने वाला है। Fura-2 डाई और कोलेजन wrinkling assays संकुचन के सतही निर्धारण की अनुमति देते हैं और एक सटीक संख्यात्मक आउटपुट नहीं देते हैं, जिससे उन्हें रोगी-विशिष्ट मतभेदों को भेदभाव करने के लिए कम उपयुक्त बनाया जाता है। पेट महाधमनी एन्यूरिज्म रोगियों के महाधमनी से व्युत्पन्न कोशिकाओं में बिगड़ा एसएमसी संकुचन पहली बार विट्रो8 में एसएमसी संकुचन को मापने के लिए एक उपन्यास विधि को अनुकूलित करके प्रदर्शित किया गया था। यह इलेक्ट्रिक सेल-सब्सट्रेट प्रतिबाधा संवेदन (ईसीआईएस) विधि को फिर से तैयार करके किया गया था। ECIS एक वास्तविक समय, मध्यम थ्रूपुट परख अनुयायी सेल व्यवहार और संकुचन 9,10,11 जैसे SMC विकास और घाव भरने और माइग्रेशन assays12,13,14 में व्यवहार के परिमाणीकरण के लिए है. सटीक विधि प्रोटोकॉल अनुभाग में वर्णित है। इस अनुकूलित तरीके से, ईसीआईएस का उपयोग उनके समान आकार और आकृति विज्ञान के कारण फाइब्रोब्लास्ट संकुचन का अध्ययन करने के लिए भी किया जा सकता है।
इस पेपर का उद्देश्य ECIS8 का उपयोग करके विट्रो में SMC संकुचन को मापने और नियंत्रण और रोगी SMCs के बीच संकुचन की तुलना करने के लिए विधि का एक stepwise विवरण प्रदान करना है। सबसे पहले, नियंत्रण और रोगी महाधमनी बायोप्सी से प्राथमिक एसएमसी के अलगाव और संवर्धन को समझाया गया है, जिसका उपयोग संकुचन माप के लिए किया जा सकता है। दूसरा, संकुचन माप और विश्लेषण, एसएमसी मार्कर अभिव्यक्ति के सत्यापन के साथ-साथ, वर्णित हैं। इसके अलावा, यह पेपर रोगी-विशिष्ट त्वचीय फाइब्रोब्लास्ट्स के अलगाव के लिए विधि का वर्णन करता है, जिनके संकुचन को एक ही पद्धति का उपयोग करके मापा जा सकता है। इन कोशिकाओं का उपयोग रोगी-विशिष्ट अध्ययनों के लिए किया जा सकता है जो महाधमनी एन्यूरिज्म या अन्य कार्डियोवैस्कुलर पैथोलॉजी15 या एक ट्रांसडिफरेंशिएशन प्रोटोकॉल का उपयोग करके पूर्वानुमानात्मक अध्ययनों पर केंद्रित है जो एन्यूरिज्म सर्जरी16 से पहले संकुचन माप की अनुमति देता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
यह पेपर प्रतिबाधा और सतह के कब्जे में परिवर्तन के आधार पर विट्रो में एसएमसी संकुचन को मापने के लिए एक विधि प्रस्तुत करता है। सबसे पहले, रोगी-विशिष्ट प्राथमिक मानव एसएमसी और त्वचा फाइब्रोब्लास्ट के …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम कृतज्ञतापूर्वक तारा वैन Merrienboer, अल्बर्ट वैन Wijk, Jolanda वैन डेर Velden, जन डी Blankensteijn, लैन ट्रान, पीटर एल Hordijk, PAREL-AAA टीम, और एम्स्टर्डम UMC के सभी संवहनी सर्जन, Zaans Medisch Centrum, और Dijklander अस्पताल इस अध्ययन के लिए सामग्री और समर्थन प्रदान करने के लिए स्वीकार करना चाहते हैं।
Materials
| 96-well Array | Applied Biophysics | 96W10idf PET | Array used to measure contraction in the ECIS setup |
| Custodiol | Dr. Franz Höhler Chemie GmbH | RVG 12801 | Solution used to transfer tissue in from surgery room to laboratorium |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | 472301 | Solution used to dilute ionomycin |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 26140079 | Addition to cell culture medium |
| Ham's F-10 Nutrient Mix | Gibco | 11550043 | Medium used to culture skin fibroblasts |
| Human Vascular Smooth Muscle Cell Basal Medium (formerly ''Medium 231'') | Gibco | M231500 | Medium used to culture smooth muscle cells |
| Invitrogen countess II | Thermo Fisher Scientific | AMQAX1000 | Automated cell counter |
| Ionomycin calcium salt from Streptomyces conglobatus | Sigma-Aldrich | I0634-1MG | Compound used for contraction stimulation |
| NaCl 0.9% | Fresenius Kabi | B230561 | Solution used to transfer tissue in from surgery room to laboratorium |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | Antibiotics used for cell culture medium |
| Phospathe buffered saline | Gibco | 10010023 | Used to wash cells |
| Quick-RNA Miniprep Kit | Zymo Research | R1055 | Kit used for RNA isolation |
| Smooth Muscle Growth Supplement (SMGS) | Gibco | S00725 | Supplement which is added to smooth muscle cell culture medium |
| SuperScript VILO cDNA Synthesis Kit | Thermo Fisher Scientific | 11754250 | Kit used for cDNA synthesis |
| SYBR Green PCR Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4309155 | Reagent for qPCR |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 15400-054 | Used to trypsinize cells |
| ZTheta | Applied Biophysics | ZTheta | ECIS instrument used for contraction measurements |
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